MTT方法测定脾淋巴细胞转化(20070727)
MTT的测定方法基本上是利用细胞本身的酵素对受质的作用
MTT的測定方法基本上是利用細胞本身的酵素對受質的作用，產生顏色的變化，再進一步測定其吸光值。
如果細胞受到細胞裂殖素的刺激，增生越多，則活的細胞愈多，酵素的活性就會較高，可以測到較高的吸光值。
利用此一原理，也可以來測定細胞的增殖反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高，對懸浮性細胞則較不理想，進行本實驗時應特別注意。
细胞增殖的测定：四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)[3]：选择对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化5～8min，调整细胞浓度为5×104/mL加于96孔培养板，每孔100μL，再分别加入不同浓度药物（1.5、1.8、2.2、2.5、2.8、3.2mg/mL），并设置培养液对照。
置37℃，体积分数为5％CO2条件下培养56～72h，于结束前4h加入MTT10μL/孔，4h后弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100μL/孔，振荡10min左右，置酶标仪测A值，波长为570nm。
用含15％小牛血清的1640培养液将801-D细胞或肿瘤细胞接种于96孔板，每孔100?μl，设空白组及不同肿瘤细胞浓度组，每组分别设为5×102、1×103、5×103、1×104、2×104、5×104／孔。
置37℃、5％CO2饱和湿度培养72小时，弃上清。
每孔加MTT 20?μl(浓度5?mg ／ml)，继续培养4小时。
加100?μl DMSO，平板振荡器上震荡5分钟，在酶标仪上以570?nm 波长检测。
脾T淋巴细胞增殖反应测定[4]脾细胞（2.5×105/孔）在37℃，5% CO2培养条件下，用10ug/ml gD蛋白（阴性对照组为RPMI1640培养基；阳性对照组为5ug/ml PHA）刺激3天。
加入10ul MTT(5m g/ml)，37℃继续培养4小时后，每孔加入100ul DMSO溶解formazon。
检测各孔490nm光吸收值（每一组设3个重复孔）；计算刺激指数（SI）=A490nm(实验组)/A490nm(阴性对照组)。
MTT法检测细胞活力精讲
耐药性机制研究
通过MTT法可以研究肿瘤 耐药性的机制，了解耐药 相关基因和蛋白的表达及 功能。
逆转耐药性
MTT法可用于筛选能够逆 转肿瘤耐药性的药物或分 子，提高肿瘤治疗的疗效。
注意事项与局限性
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实验条件控制
细胞状态与培养时间
干扰因素
仅适用于贴壁细胞
MTT法的实验条件需严格控制 ，以确保实验结果的准确性和 可靠性。
细胞类型特异性
MTT法在不同类型的细胞 中表现出不同的敏感性， 可用于研究不同细胞类型 的毒性特征。
细胞凋亡检测
通过MTT法可以检测细胞 凋亡的发生，了解凋亡相 关基因和信号通路的活性。
在肿瘤耐药性研究中的应用
肿瘤耐药性评估
MTT法可用于评估肿瘤细 胞对化疗药物的耐药性， 为制定有效的治疗方案提 供依据。
通过MTT法可以研究药物的作用机制， 了解药物对细胞生长、增殖和凋亡等 方面的影响。
药物浓度与细胞毒性关系
通过MTT法可以观察不同浓度的药物 对细胞活力的影响，从而确定药物的 毒性阈值和安全使用范围。
在细胞毒性研究中的应用
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细胞毒性评估
MTT法可用于评估不同因 素对细胞造成的毒性作用， 如化学物质、辐射、病毒 等。
80%
细胞毒性评估
通过比较给药组与对照组的OD值 ，可评估药物的细胞毒性。OD值 降低表明药物对细胞活力产生负 面影响。
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mtt法的操作步骤
细胞培养与样品准备
细胞培养
选择适宜的细胞系，在适宜的培 养条件下进行细胞培养，确保细 胞生长旺盛、状态良好。
样品准备
将待检测的细胞样品离心，去除 培养液，并用磷酸盐缓冲液清洗 细胞，去除残留的培养液。
淋巴细胞转化试验(MTT)
一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。
当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。
（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。
用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。
丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。
取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。
调整细胞浓度为5 105/ml。
②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
MTT实验方法步骤
一．悬浮细胞MTT实验时,由于离心弃上清会造成一定程度的细胞丢失,而且操作又麻烦.请教各位老师,不用弃上清的SDS-DMF,酸化异丙醇的方法的具体步骤和参考文献.谢谢!1．介绍一种巨噬细胞杀伤活性的MTT检测：于24孔培养板中加入1×109/L腹腔巨噬细胞(1ml/孔)，培养2h后洗去未贴壁细胞，加入不同浓度的MDP。
收集对数生长期的UMR106细胞，调整细胞浓度至1×108/L，加入各孔，效靶比（E/T）为10:1，再培养24h，充分振荡。
每孔取100μl的UMR106细胞移入96孔培养板，各孔加入5g/LMTT20μl，培养4h，再加入10％SDS100μl，测定570nm处的A值。
计算公式如下：杀伤活性（％）=(1－实验组UMR106细胞的A值/对照组UMR106细胞的A值)×100％本方法参考文献，Jiao H, Shan WM, Ohe Y, et al. A new MTT assay for testing macrophage cytotoxicity to L1210 and its drug resistant cell lines in vitro. Cancer Immunol Immunother,1992;35:412～4162．SRB是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在490nm~520nm 波长处其OD值与活细胞数成良好的直线关系。
SRB法已被NCI选定作为筛选抗癌药物的新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于MTT法。
除此之外SRB法还有以下优点：(1)操作时间短，细胞固定和染色仅需90分钟左右，而MTT加样后还需培养4小时。
(2)没有严格时间限制，在TCA固定后或SRB结合后的细胞均可存放，Monks指出样品保存7天，测定的OD值下降不超过2％[8]。
（3）可以测定悬浮细胞，采用16% 的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之MTT 法或结晶紫法离心取上清的操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。
T淋巴细胞转化试验步骤及注意事项
淋巴增殖实验:第一种，取外周血和脾脏分离淋巴细胞用于淋巴增殖实验,具体步骤如下⑴雏鸡翅下釆血2mL,加入1mL抗凝血和1mLPBS的混合液,混合均匀后,缓缓加入装有2mL淋巴细胞分离液的无菌透明的大离心管中,不要摇晃,注意血液与淋巴细胞分离液不要混合,2000rpm,离心20min,可以看见中间有层白色雾状白细胞,吸取白细胞至2inL离心管中,2000rpm离心5min取沉淀;(2)向离心管中加入1mL 1640清洗2遍,2000rpm离心5min取沉淀;⑶将沉淀悬于1mL DMEM,细胞计数板计数,取 1 xlO7个细胞悬于ImLPBS中,置于37°C培养箱中用CFSE (终浓度2gM)避光染色lOmin,每隔2-3min上下颠倒一次;(4)DMEM洗漆细胞2次,每次1mL,2000rpm离心6-7min;(5)悬于1mL DMEM 中;(6)取5xl05个细胞置于96孔板,同时加入20μ30μg/m的ConA,DMEM补齐至200μL,4℃二氧化碳培养箱诱导3d;(7)流式专用buffer洗涤2次,2000r离心5min,200μbuffer悬起,流式细胞仪检测。
取1小块脾脏加入1mL 1640研磨,脾脏细胞先用200μL红细胞裂解液作用5min,2000rpm离心5min,计数,之后重复上述步骤。
第三种，外周血液 T、B 淋巴细胞增殖功能测定——MTT 测定法1. 外周血液淋巴细胞悬液的制备无菌采取外周血液，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法(2000r/min，20min)分离淋巴细胞，再用 RPMI1640 培养液离心洗涤(1500r/min，10min)淋巴细胞 3 次，用台盼兰拒染法检测细胞活率＞95％，同时进行细胞计数，用 RPMI-l640 完全培养液调细胞浓度至1×107/ml。
2. 外周血液 T 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板每孔加入50µl含20µg/m1 ConA 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液。
淋巴细胞转化实验报告
淋巴细胞转化实验报告本实验旨在探究淋巴细胞的转化过程及其影响因素。
实验过程中，将淋巴细胞与一种称为“共同诱导剂”的物质一起培养，观察其细胞增殖情况，并对其进行形态、生物学指标等方面的分析。
实验设备：1.淋巴细胞分离液2.共同诱导剂3.2.5％DMSO4.96孔板5.无菌蒸馏水6.比色计7.显微镜实验步骤：1.将新鲜小鼠脾脏切割成碎片，加入10ml的淋巴细胞分离液中，用离心机将其离心5min，取上清液为淋巴细胞。
2.将淋巴细胞洗涤三次，倒掉上清并加入10ml新的淋巴细胞分离液进行离心。
重复该步骤3次，以去除悬浮在淋巴细胞上的血红细胞和血小板。
3.将10μl细胞悬液加入90μl试验液（不含共同诱导剂），分别加入5% DMSO，共同诱导剂和一个对照组，分别孵育24h，48h和72h。
4.将80μl的淋巴细胞悬液加入新的96孔板中。
根据实验要求进行加药与相应的控制。
5.将淋巴细胞36h悬液转移到新的96孔板中，各包含80μl，进行形态学观察。
6.将淋巴细胞72h转移，在比色计中检测细胞增殖情况，计算得到相应的增殖指数（SI）。
实验结果：1.形态观察通过显微镜观察淋巴细胞的形态学变化。
对照组：淋巴细胞间距等距，无细胞破裂或缺损。
5% DMSO：淋巴细胞受到较严重的损伤，细胞全部变形。
共同诱导剂：淋巴细胞形态多样性，出现组织块状聚集现象。
2.细胞增殖情况70h后，比色计检测增殖情况。
对照组：SI为15% DMSO：SI为0.4共同诱导剂（分析不同剂量）：(a) 0.01ug/ml：SI为1.8(b) 0.1ug/ml：SI为2.7(c) 1.0ug/ml：SI为2.1实验分析：淋巴细胞转化是一种细胞增殖的过程，在此过程中细胞数量增加。
转化可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。
体外诱导转化中，加入化合物或病毒等诱导剂，以刺激细胞增殖。
本实验中，采用的淋巴细胞采用体外诱导转化的形式。
实验结果表明，共同诱导剂对淋巴细胞转化具有明显的促进作用，而DMSO对淋巴细胞的增殖有一定的抑制作用。
(methyl thiazolyl tetrazolium) mtt法
(methyl thiazolyl tetrazolium) mtt法1. 引言1.1 概述MTT法是一种常用的细胞存活率检测方法，它通过检测细胞对(methyl thiazolyl tetrazolium) MTT染料的代谢能力来评估细胞的生命活力。
该方法被广泛应用于生物医学研究中，特别是在肿瘤细胞耐药性研究、药物筛选与毒性评价以及组织工程等领域。
1.2 文章结构本文将首先介绍MTT法的基本原理和在细胞存活率检测中的应用，然后详细阐述MTT法的操作步骤，包括细胞处理及培养条件准备、MTT染色和测量以及数据分析和结果解读。
接下来，本文将分享一些MTT法在生物医学研究中的应用案例，包括肿瘤细胞耐药性研究、药物筛选与毒性评价以及组织工程及再生医学。
最后，文章将总结并展望MTT法在未来的发展前景。
1.3 目的本文旨在全面介绍MTT法，并突出其在生物医学研究中的重要应用。
通过详细阐述MTT法的原理、操作步骤和应用案例，旨在提供读者对该方法的全面了解和应用指导，进一步促进其在生物医学研究中的广泛应用和发展。
同时，本文也希望能够引起更多研究者对MTT法的关注，并为未来的相关研究提供新思路和启示。
2. MTT法的原理：MTT法（(methyl thiazolyl tetrazolium) MTT assay）是一种常用的细胞存活率检测方法，通过测量细胞内还原酶催化将无色MTT显色成紫色形azán离子。
该方法基于细胞代谢活跃度与存活能力密切相关的原理。
2.1 MTT法的基本原理：MTT是一种黄色可溶于生理盐水的四唑类化合物，在细胞实验中被广泛应用。
当MTT进入到细胞内后，由于存在细胞内还原酶（如线粒体呼吸链中的NADH-脱氢酶、二氢四氮杂苯脱氢酶等），MTT会被代谢成可以溶于有机溶剂（如DMSO，二甲基亚砜）的紫色产物——甲基三唑瓣啉蓝(MTT-formazan)。
这个过程为混色反应。
2.2 MTT法在细胞存活率检测中的应用：MTT法主要通过检测MTO-formazan所生成的紫色产物来分析细胞存活率和生长情况。
T淋巴细胞转化实验 ppt课件
T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖， 其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲 基噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催 化形成蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异 丙醇或溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞 增殖活化的程度呈正相关。
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试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。
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试剂与器材
3. 姬姆萨染液。 4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 5．器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高
压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。
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操作步骤
外周血0.2ml
PHA
无PHA
5%CO2 37℃ 72h 1500rpm 离心10min
吸取白细胞层涂片ppt课件24 2 ．淋巴细胞转化率的计算：按上述分类检查推片头、体、尾三部 分，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及 成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞， 按下列公式计算转化率：
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转化率
转化的淋巴细胞数 转化和未转化的淋巴细
胞数
100%
15
四、结果观察
可以见到以下几种类型细胞 (1) 成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为 6 -8
um ，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱 性。
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淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
(2) 淋巴母细胞：
细胞体积增大，约 20 - 30 um ，形态不整齐，常有小突出，核 质染色疏松，有核仁 l - 2 个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。
MTT实验方法
MTT实验⽅法⼀、原理黄⾊的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进⼊细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于⽔的蓝紫⾊的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被⼆甲基亚砜（DMSO）溶解，⽤酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
⼆、实验步骤（实⽤于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180µl，3000-10000个/孔。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6-24⼩时。
3）加⼊待筛样品20µl，继续培养44⼩时。
4）⼩⼼吸去上清，加⼊80µl新鲜RPMI 1640培养液，再加⼊20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）然后吸掉上清，每孔加⼊150 ul⼆甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
7）同时设置调零孔（培养基、MTT、⼆甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、⼆甲基亚砜），每组设定3复孔。
8）计算抑制率＝[(对照-空⽩)-(给药-空⽩)]/(对照-空⽩)X100%.有依据吗MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。
MTT为黄⾊化合物，是⼀种接受氢离⼦的染料，可作⽤于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞⾊素C的作⽤下tetrazolium环开裂，⽣成蓝⾊的formazan结晶，formazan结晶的⽣成量仅与活细胞数⽬成正⽐（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。
还原⽣成的formazan结晶可在含50%的N,N-⼆甲基甲酰胺和20%的⼗⼆甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利⽤酶标仪测定490 nm 处的光密度OD值，以反映出活细胞数⽬。
T淋巴细胞转化实验
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。 3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 4. 器材 超净台、96孔细胞培养板、 CO2培养箱、高压
灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶联免疫检测仪等。
No Image
操作步骤
分离外周血
100l/孔
单个核细胞1106/ ml
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操作步骤
分离外周血
100l/孔
单个核细胞1106/ ml
培养板 培养板 （含PHA） （无PHA）
5%CO2 37℃ 56h
加入3H-TdR 10l/孔
5%CO2 37℃ 16h
收集培养细胞于滤膜上
液体闪烁器计数cpm
结果判断
以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程度：
刺激 (S 指 I实 对 ) 数 验 照 c cp p 均 均 m m 组 组 值 本 值 本 c c底 底 p p 值 值 m m
应剂量一般 10m1，培养瓶内液体总量不要超过 2m1 ，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验前应 先测定。
二、MTT比色法
实验目的
熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验 的原理及其操作方法。
实一验、原原理 理
T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖，其 胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲基 噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催化形成 蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异丙醇或 溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞增殖活 化的程度呈正相关。
采取哪些措施可减少实验误差，使结果可信？
三、3H-TdR掺入法
实验目的
熟悉3H-TdR掺入法进行淋巴细胞转化试 验的原理及其操作方法。
MTT法检测淋巴细胞
9.除置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解外， 可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放 孵箱15分钟溶解结晶。 10.至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于 DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值， 就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492，选 用TMB显色液则用450）；而对于SDS和酸化异丙醇， 则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。
现代应用 实验原理
实验步骤
注意事项
细胞筛 选培养
药物药 效实验
现代 应用
药物毒 性检测
基因工 程
实验原理：
1. MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基 四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。 2.检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外 源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 （DMSO）能溶解细胞中的甲臜结晶 ，用酶联免疫 检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映 活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成 的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物 活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。 淋巴细胞体外转化代表着细胞免疫功能，因此测定 淋巴细胞体外增殖反应是研究细胞免疫功能的重要 手段和指标。
5. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来， 导 致每孔中的细胞数量不等，吹打次数100左右，就可以 吹打均匀了。 6. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹 下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。 7. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现 细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆， 一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分 散会产生接触抑制，影响细胞的生长。 8. 96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于 具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致 培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同， 为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种 细胞，而不作为指标检测孔。
淋巴细胞转化试验(MTT)
淋巴细胞转化试验(MTT)一、淋巴细胞转化试验（mtt）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（mtt）可以做为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。
当有活细胞存有时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可以将淡黄色的mtt转换成紫兰色的甲n，将结晶的甲n熔化释放出来后，可以根据夫基的od值充分反映活细胞的数量和活性，从而推断出试样样品的水平。
（二）材料：mtt、电子天平、pbs液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，co2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。
用称取50mg的mtt，溶10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤器除菌，无菌ep管灌装，－20℃贮藏留存。
丝裂原：pha、cona、pwm或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎骨折处决，75%乙醇煮沸3分钟，抽出小鼠放在无菌纸上，左腹两端朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下两端提出诉讼腹膜，包住后上翻，曝露脾脏，用镊子提出诉讼脾脏，眼科抠拆分脾脏下面的结缔组织，抽出脾脏。
放进器皿5mlhanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏置放不锈钢网（100或200目）上，放在器皿适度无菌hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾烧掉，用注射器针芯轻轻研压脾脏，做成单细胞悬液；经200目筛网过滤器，用hanks液洗脸3次，每次Vergt1000r/min5-10min，(或1500rpm，4-7min)。
抽出100ul，吸收后在细胞计数板上展开细胞计数，用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%nacl液+0.2ml细胞悬液，搅匀)，排序细胞存活率(应当在95％以上)。
调整细胞浓度为5?10/ml。
②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入5离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，重新加入400u/ml胶原酶（iii型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤器，获得单细胞悬液。
MTT法检测细胞活性及其应用
MTT法检测细胞活性与其应用一、实验目的1.掌握MTT法的基本原理和操作,学会应用MTT法解决简单的实际问题.2.巩固动物细胞培养的知识,熟练相关操作.3.学会酶联免疫检测仪〔简称酶标仪〕的操作方法.二、实验原理1.MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒〔Formazan〕并沉积在细胞中,而死细胞无此功能.二甲基亚砜〔DMSO〕[三联溶液]能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比.该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以与肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是灵敏度高、经济.2.细胞冻存与复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力.目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤.复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤.3.从动物机体中取出的相关组织通过胰蛋白酶或胶原蛋白酶可以将其分散成单个细胞.再放于适宜的培养基中,可以使这些细胞生长繁殖以供实验所需.该实验对无菌要求极高,以培养出满足实验条件的细胞.4.酶联免疫检测仪测定的原理是在特定波长下检测被测物的吸光值.酶标仪实质就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计.三、实验材料,器材与试剂材料：Hela细胞〕,冰箱〔4℃、-20℃、-70℃〕,器材：恒温水浴锅,超净工作台,培养箱〔37℃,5%CO2液氮冰箱,灭菌锅,烧杯,培养瓶,滴管,酒精灯,镊子,离心机,24孔培养板,96孔培养板,摇床,酶标仪,倒置显微镜,移液枪〔带枪头〕,15mL离心管,冻存管〔1-2mL〕,红血球计数板,记号笔,0.22μm滤膜,铝箔纸.试剂：二甲基亚砜〔分析纯〕,甘油,10%胎牛血清,胰蛋白酶〔0.5%〕,双抗〔青霉素,链霉素 1万单位/mL〕,磷酸缓冲液〔配制见附录1〕,MTT〔 3-〔4,5-二甲基噻唑-2〕-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名：噻唑蓝.〕〔配制见附录2〕,DMEM 培养液<配制见附录3>,无菌水,抗肿瘤药物〔具体待定〕四、实验步骤A.Hela细胞复苏1.从液氮容器中取出从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化；2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上DEME培养液,混匀；3. 离心,1000rpm,5min；4. 弃去上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度至1×104个/mL,部分接种培养瓶,37℃培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液,继续培养,此后定期更换培养液,维持细胞正常活性.B.MTT检测复苏细胞的细胞活性Hela细胞计数用血细胞计数板的四个角上的方块.1. 接种培养瓶同时,将其余部分接种于96孔细胞培养板,7组,每组5孔,每孔100μL,37℃培养箱静置培养；2.培养24h后,向每孔内加入用磷酸缓冲液配制的0.5%MTT〔5mg/mL〕20uL,37℃培养箱内培育；3.4h后终止培养,将孔内培养液小心吸出.每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解.同时每行第一孔设置为调零孔〔培养基、MTT、二甲基亚砜〕.用酶标仪OD570nm处测量各孔吸光值；C.细胞生长曲线制作接B.2,B.3步骤,连续测量7天,根据测量结果绘制细胞生长曲线.[横坐标生长时间,纵坐标吸光度值.]D.探究某药物对于细胞活性的影响1.将之前培养于培养瓶中的细胞用0.5%胰蛋白酶洗脱,加入DEME培养液制成细胞密度为1×106个/mL的细胞悬液；2.设置空白对照组与5个不同药物梯度的实验组,分别加载96孔培养板内〔5个梯度剂量按药物种类待定〕,每个剂量分别设置5个平行孔,每孔加入细胞悬液100μL〔在加药的前一天下午完成铺板〕；3.次日上午按预先设置的药物梯度加药,后置37℃培养箱培养24h；4.每孔加入20μLMTT溶液,继续培养4h〔若药物能与MTT反应,可以先离心后弃去上清液,用PBS冲洗2-3遍后再加入MTT溶液〕5终止培养,小心吸去孔内培养液；6.每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解,用酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光度；7.同时设置调零孔〔培养基、MTT、二甲基亚砜〕,对照孔〔细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜〕.E.Hela细胞冻存1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2.取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；3.离心1000rpm,5min；4.去除胰蛋白酶与旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5.将细胞分装入冻存管中,每管1～1.5 ml；6.在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间与操作者；7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时,可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时,则可迅速浸入液氮中.也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内.五、实验结果Hela细胞复苏情况良好,生长曲线绘制较好,成功验证肿瘤细胞对Hela细胞的作用.六、附录1.磷酸缓冲液配制方法NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO41.44g, KH2PO40.24g, 调pH 7.4,定容1L2.0.5%MTT溶液配制方法称取MTT0.5g,溶于100mLPBS中,用0.22μm滤膜除菌,放4℃避光保存.配制和保存过程中,容器最好用铝箔纸包住.。
淋巴转化实验实验报告
一、实验目的1. 了解淋巴细胞转化的基本原理和方法。
2. 掌握淋巴细胞转化实验的操作技能。
3. 通过实验结果分析，了解不同刺激条件下淋巴细胞转化能力的变化。
二、实验原理淋巴细胞转化是指在外界刺激（如抗原、丝裂原等）作用下，淋巴细胞由静息状态转化为增殖状态的过程。
在此过程中，细胞数量增加，功能增强。
淋巴细胞转化实验是研究淋巴细胞活性和功能的重要方法。
三、实验材料1. 试剂：RPMI-1640培养液、胎牛血清、肝素钠、PHA（植物血凝素）、刀豆蛋白A（ConA）、抗凝剂、胰蛋白酶等。
2. 仪器：细胞培养箱、显微镜、离心机、酶标仪等。
3. 样本：人外周血。
四、实验方法1. 采集抗凝血：每个10ml注射器吸入100ul肝素钠抗凝剂（20mg/ml），每个样品无菌采血5-8ml。
将采集的血液保存在4℃环境。
2. 细胞分离：将采集的血液置于室温下，加入等体积的RPMI-1640培养液，混匀后加入等体积的Ficoll分层液，离心后吸取单个核细胞层。
3. 细胞洗涤：将细胞悬液以1000r/min离心5min，弃上清，加入RPMI-1640培养液重悬细胞，再次离心洗涤。
4. 细胞计数：取适量细胞悬液，加入细胞计数板，计数细胞数量。
5. 细胞培养：将细胞悬液调整至2×10^5个细胞/ml，分为两组，分别加入PHA和ConA，每组设3个复孔。
6. 培养与观察：将细胞培养于37℃、5%CO2的培养箱中，培养48h后，在显微镜下观察细胞形态变化。
7. 结果分析：采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞增殖情况，计算淋巴细胞转化率。
五、实验结果1. 光镜观察：加入PHA和ConA的细胞组，细胞体积增大，细胞核增大，细胞质增多，呈典型的转化细胞形态。
2. ELISA检测：加入PHA和ConA的细胞组，细胞增殖明显，转化率分别为（±SD）30.2%±2.5%和28.6%±3.1%。
六、实验讨论1. 淋巴细胞转化实验是研究淋巴细胞活性和功能的重要方法。
T淋巴细胞转化试验
T淋巴细胞转化试验（T lynrphocyte transformation test）正常机体的T淋巴细胞在体外培养过程中，受到特异性抗原或有丝分裂原（植物血凝素或刀豆素等）刺激，细胞的代谢和形态可发生一系列变化。
主要表现为电荷的改变，细胞内蛋白质和核酸合成增加，及以细胞形态可转化为淋巴母细胞。
为此，在体外利用各种刺激剂激发淋巴细胞，根据其转化程度可测定T淋巴细胞的应答功能。
这类方法称为淋巴细胞转化试验（lymphocyte leansformstoin test）简称淋转试验，在临床上现已作为测定人体细胞免疫功能的指标之一。
细胞免疫缺陷时，这种转化功能也降低。
目前最常用植物血凝素（PHA）作为分裂原来检测淋巴细胞转化功能，称PHA刺激淋巴细胞转化试验。
体外引起T淋巴细胞转化的刺激物种类颇多，大致有以下几类：（1）非特异抗原刺激物，如从豆类中提了的植物血凝素（PHA）和刀豆素A（ConA）等，通称为促有丝分裂素（mitogen）。
（2）特异性抗原刺激物，如结核菌纯化蛋白衍生物（purifeg protein derivative 简称PPD）等。
（3）组织抗原和抗血清，如同种白细胞，抗淋巴细胞血清等。
上述各种刺激物中以PHA应用最广，在体外淋巴细胞培养中，可使正常人外周血液中T淋巴细胞几乎均起转化，其所引起的淋巴细胞转化率大大超过特异性抗原的作用。
但这种反应与机体是否致敏无关，因此是属于非特异性的淋转试验。
特异性抗原仅能使相应抗原致敏的淋巴细胞发生转化，转化率一般在5-30%左右。
虽然T淋巴细胞对非特异性和特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，所发生的分裂和增殖反应却是相同的。
因此根据PHA激活T淋巴细胞分列增殖反应的程度，可以推测T淋巴细胞识别特特异性抗原后的增植反应。
从而利用PHA 刺激淋巴细胞转化试验一项非常特异性体外免疫学检测指标，在一定程度上可作为刺激原，因此一般称为PHA淋巴细胞转化试验。
MTT法检测番鸭外周血淋巴细胞转化功能的研究
动物医学进展,2005,26(1):75277Progress in Veterinary MedicineMTT法检测番鸭外周血淋巴细胞转化功能的研究林锋强,胡奇林3,陈少莺,陈仕龙,程晓霞,朱小丽(福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350003)中图分类号:S852.4;S858.32文献标识码:A文章编号:100725038(2005)0120075203摘 要:为了建立番鸭淋巴细胞转化检测的MTT法,筛选细胞浓度、刀豆蛋白C onA浓度和培养时间3个参数对试验条件进行了研究。
结果确定了MTT法检测番鸭淋巴细胞转化能力的最佳培养条件,细胞浓度5×106个/ m L在20μg/m L C onA的RMPI1640完全培养基40℃培养60h。
试验表明,该方法可用于番鸭体外细胞免疫功能的检测。
关键词:MTT;番鸭;淋巴细胞转化淋巴细胞转化试验的原理是T淋巴细胞在有丝分裂原(如C onA,PH A)的刺激下,引起细胞内新的DNA合成及细胞分化,从而发生一系列增殖变化,如细胞体积增大、细胞浆增加、核仁明显、染色质疏松等,称为淋巴母细胞。
该试验主要用于体外检测T 淋巴细胞的生物学功能,反映机体的细胞免疫水平[1]。
常用方法有放射性同位素标记法和形态学方法[2]。
放射性同位素标记法需要特殊的仪器设备,较多的人力和物力,并且难以进行大批量的样品检测。
形态学方法主观性强,费时费力[2]。
目前多采用比色法(MTT法)检测淋巴细胞的转化功能,此法操作简便,便于大批量样品检测[3]。
目前,尚未见 收稿日期:2004206230 基金项目:福建省科技厅资助项目(2001Z061) 作者简介:林锋强(1976-),男,福建福州人,助理研究员,硕士,主要从事免疫学和分子生物学研究。
3通讯作者阶段。
最初(1941)是用比较良性的野外毒株给鸡群中的中雏接种,使其自然传播而获得全群免疫,以减少经济损失。
此法接种反应较重,并有长期散毒的危险。
MTT细胞测试
MTT的配制
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻 融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现 配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
/s/blog_6259e64e0100fyt8.html
2010-5-5
MTT法_sophiafang_新浪博客
页码，2/7
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养液，小心用PBS冲2-3吸去孔内培养液。
6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处
测量各孔的吸光值。
7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、
MTT法 什么是MTT?
MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二
甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。
什么是MTT法?
又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外 目击街头劫持人质
MTT 溶液的配制方法
通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红
以MTT比色法检测鸡脾淋巴细胞转化效果
以MTT比色法检测鸡脾淋巴细胞转化效果
李祥瑞;金红;王秀丽;卢景良
【期刊名称】《畜牧与兽医》
【年(卷),期】1996(28)1
【摘要】本研究运用ＭＴＴ比色法以正交试验对鸡脾脏淋巴细胞转化的最佳条件（ｃｏｎＡ量、血清种类和浓度）进行了研究。
结果表明，无论血清种类和浓度如何，低剂量ＣｏｎＡ（２．５～１０μｇ／ｍｌ）可以获得较好的转化效果。
当ＣｏｎＡ的量确定时，低浓度鸡血清（０．５％～１．２５％）的转化效果优于高浓度（２％～３％）：５％犊牛血清优于任何浓度的鸡血清；无血清培养基优于血清培养基。
其最佳组合为无血清ＲＰＭＩ１６４０培养基加ＣｏｎＡ２．５μｇ／ｍｌ。
【总页数】3页(P3-5)
【关键词】淋巴细胞转化;检测法;鸡;脾;比色法
【作者】李祥瑞;金红;王秀丽;卢景良
【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室【正文语种】中文
【中图分类】S831.1
【相关文献】
1.MTT法检测鸡外周血淋巴细胞增殖性反应的最佳条件探讨 [J], 杨发龙;岳华;罗薇;杨晓燕
2.羔羊外周血单个核细胞转化MTT比色法最佳检测条件的筛选 [J], 张冰冰;赵魁;贺文琦;王栋;臧德跃;陈克研;王改丽;高丰
3.MTT法测定自制多糖注射剂对鸡胚成纤维细胞和鸡脾淋巴细胞增殖的最适浓度[J], 刘俊玲;董鹤娟
4.MTT比色法检测孕牛淋巴细胞转化的效果 [J], 黄志坚;邱承亮
5.鸭外周血液淋巴细胞转化MTT比色法检测的研究 [J], 王君伟;UNeumann 因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验
1.实验步骤：
1.1.调整淋巴细胞浓度：
a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min；
b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将
脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研
钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料
离心管；
c)离心1500rpm, 5min；
d)用Hank’s液洗2次；
e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀
后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡；
f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。
（假定4个大方格内总数为N，则
该细胞悬液的浓度为n=105*N）
1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。
以
100μl/孔加入96孔细胞培养板中。
（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。
）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。
不同品种的动物也有一定的不同。
1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防
止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。
细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。
1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。
每过24小时需取
出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。
1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。
1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去
细胞培养液，纸巾吸干。
加入DMSO，150ul/孔。
充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解）
1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。
2.实验仪器和材料：
2.1超净工作台（用前紫外灯照15-25min），酒精灯，酒精棉球；
2.2烧杯（250ml，用来盛放小鼠），酒精75%，2个
2.3培养液瓶（100ml），5个
2.410ml移液管或小量筒（50 ml），2个
2.51640培养液，胎牛血清，庆大霉素；
2.6小平皿（若干），剪刀，镊子，
2.7Hank’s液，1ml注射器，200目铜网；
2.810ml塑料离心管，离心机，胶头滴管；血球计数器，盖玻片，冰醋酸染液，
显微镜；
2.9刺激物Con-A、PHA（T细胞）和LPS（B细胞）；
2.1096孔培养板；50ul，200ul，1ml吸头和相应量程的可调移液器；
2.11CO2培养箱，倒置显微镜；
2.12MTT，0.22微孔滤器；离心机（可用于96孔板离心），异丙醇，盐酸，酶
标仪。
3.试剂配备
3.1培养液在1640培养液中加入10%小牛血清、庆大霉素（终浓度30ug/ml）。
（小牛血清融化后，离心1500rpm, 5min，以便除去热灭活后形成的沉淀）培养液配好后，放4℃保存（拧紧瓶盖，否则CO2逸出，PH升高，颜色变紫）。
3.21.5%冰醋酸
4.2ml 36%冰醋酸，加入9
5.8ml超纯水，放于4℃保存。
3.3MTT 用培养液稀释至2mg/ml，充分溶解后，过0.22微孔滤膜。
3.4酸性异丙醇96ml异丙醇,加入4ml 1M盐酸。
(1M盐酸称1g 36-38%盐酸
（0.1ml）,加生理盐水至10ml)。