高效液相色谱仪的使用及运行性能测试
Agilent1100高效液相色谱仪操作规程
Agilent1100高效液相色谱仪操作规程操作说明：1.开机前准备：1.1仪器设备：Agilent 1200LC ● G1322A (在线脱气机)。
● G1311A (四元泵)。
● G1329A（标准型自动进样器）。
● G1316A（柱温箱）。
● G1315A（DAD检测器）。
● 色谱柱 1.2溶剂准备：● 有机相必须是色谱级纯。
● 水相必须是二次蒸馏水或用二级蒸馏水配置的缓冲盐溶液、酸碱溶液。
● 流动相使用前必须过0.45μm的微孔滤膜。
有机相和水相微孔滤膜的选择参考下表。
产品类别代表产品品系产品特点纤维素酯类混合纤维素水相成孔性能好，亲水性好，材料成本低。
膜（CN-CA）可耐稀酸。
不适合于酮类、酯类、强酸、强碱类液体过滤。
尼龙6 通用具有亲水性，较耐碱不耐酸。
在酮、酚、聚酰胺类（PA-6）醚及高分子醇类不被腐蚀。
聚砜（PS）通用良好的化学和热稳定性，耐辐射，机械聚砜类强度高。
有机PDEF耐化学腐蚀，耐氧化，耐高温，疏聚偏氟乙烯/PDEF/PTFE 水性（酒精处理后变清水性），PTFE耐酸聚四氟乙烯膜碱性强。
具有良好的化学稳定性，耐酸碱和各种聚烯烃类聚丙烯膜有机有机溶剂。
价格便宜，但孔径分布宽。
（PP）耐高温，耐有机溶剂、耐生物降解等。
无机材料陶瓷、玻璃通用 BP、金属膜2.基本操作步骤: (一)、开机：1、打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序（部分安装程序不需要运行Bootp）。
2、打开 1200 LC 各模块电源。
3、待各模块自检完成后，双击“仪器1 联机”图标，化学工作站自动与1200LC通讯，进入的工作站画面如下所示。
4、从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面, 点击“视图”菜单中的“仪器实际值”，“在线光谱”，“化学工作站状态”，“系统视图”,“样品视图”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。
5、把流动相放入溶剂瓶中。
Waters高效液相色谱仪标准操作规程
XXXXXXXXXX部仪器设备标准操作规程1 目的：建立Waters高效液相色谱仪标准操作规程。
2 范围：Waters高效液相色谱仪。
3 责任：化验室操作者。
4 规程：4.1 型号与主要性能指标4.1.1 型号4.1.1.1 主机Waters2695分离单元、Waters2489紫外/可见光检测器。
4.1.1.2 工作站Empower2。
4.2 主要技术指标:4.2.1 泵流量设定：0.000和0.010到10.000毫升/分，增量为0.001毫升/分。
流量准确度：±1%或10μL/分，取其中的较大值（0.200到5.000毫升/分），反压为600psi下的脱气甲醇。
４.2.2 检测器：光源：氘灯。
波长范围：190～700nm波长精度：±1nm4.2.3 柱温箱：温度设定范围：20～60℃，间隔：1℃控温精度：±5℃4.2.4 工作站计算机：Dell OPTIPLEX330（操作系统Windows XP）。
4.2.5 打印机：HP LaserJet P1008打印机。
5 操作条件：5.1 电源要求：950VA（最大值）线电压：85到132Vac或180到250Vac频率：47到63Hz5.2 环境条件：温度：4～40℃，相对湿度：20～80%。
5.3 机房内应清洁无尘，无易燃、易爆和腐蚀性气体，室内排风良好。
5.4 仪器应平稳放置在工作台面上，便于操作，周围无强烈的机械震动和电磁干扰，仪器接地应良好。
6 操作前准备:6.1 配制所需流动相。
6.2 配制和制备所需的对照品溶液和供试品溶液。
6.3 将色谱柱连接到色谱仪管路系统上。
7 操作步骤：7.1 打开交流稳压电源开关，稳压电源上电压表指示并稳定至220V。
7.2 将“2695分离单元”电源开关（位于左侧面板的面板顶部）推到（开）I 位置即可启动“2695分离单元”, 启动诊断程序将启动。
启动诊断程序的初始部分成功后，前面板上将显示Main（主）屏幕。
高效液相色谱紫外检测器需要信噪比指标 液相色谱如何操作
高效液相色谱紫外检测器需要信噪比指标液相色谱如何操作紫外检测器是高效液相色谱中常用的检测器，目前市场上生产厂家及型号很多，厂家通常接受检测器的噪音，基线漂移等技术参数作为产品的灵敏度性能评价指标。
考虑到样品的紫外吸取响应值紧要与样品有关，与仪器的紫外检测器是高效液相色谱中常用的检测器，目前市场上生产厂家及型号很多，厂家通常接受检测器的噪音，基线漂移等技术参数作为产品的灵敏度性能评价指标。
考虑到样品的紫外吸取响应值紧要与样品有关，与仪器的关系不大，一般认为这可以基本反映仪器在灵敏度方面的性能。
本文在试验的基础上证明对同一样品各检测器的响应值实际上也存在不同程序的差异，说明仅使用噪音和基线漂移的指标不能精准显示仪器在灵敏度方面的性能差异，因此，提出用信噪比来评价仪器的灵敏度性能。
2 灵敏度评价指标设置的目的和依据高效液相色谱及其紫外检测器紧要用于化学样品的分析测试。
其评价指标必定与其用途相关联。
一个分析方法对检测器的要求紧要在灵敏度、选择性、精准明确度和精准性方面。
在色谱分析中灵敏度是特别紧要的指标。
对于灵敏度，在分析测试方法讨论中紧要使用信噪比、最低检测限，或最低定量限来评价。
其中信噪比是评价的核心，由于最低检测限和最低定量限通常用信噪比在2～3和10的量来定义。
但目前厂家通常接受检测器的噪音，基线漂移等技术参数作为产品的灵敏度性能评价指标。
这实际上是基于样品的紫外吸取响应值紧要与样品有关，与仪器关系不大的假设。
依据朗伯比尔定律，对于同样长度的检测池，同样浓度的样品溶液应当具有相同的吸光度。
这样，对同样浓度的样品溶液，检测器的响应值应当是相同的，所以上述噪音，基线漂移的参数应当可以用来评价检测器的灵敏度性能。
但是，试验中发觉，同一样品溶液在不同检测器中响应实际上存在明显差异，表1显示对于同一种样品溶液，不同厂家和型号检测器的响应值可能相差3倍以上。
这时，由于色谱分析紧要使用相对比较的间接测定方法，其使用实际上并没有受到多少影响。
高效液相色谱仪仪器确认指导原则
高效液相色谱仪仪器确认指导原则高效液相色谱仪（HPLC）是一种用于分离、鉴定和定量化学混合物中成分的分析仪器。
在使用HPLC进行分析时，需要遵循一些仪器确认指导原则，以确保实验的准确性和可靠性。
以下是一些常见的HPLC仪器确认指导原则：●系统稳定性测试：在每次使用HPLC系统之前，应进行系统稳定性测试，包括流速、压力、温度和检测器灵敏度等参数的测试。
这有助于确保HPLC 系统处于良好的工作状态。
●柱效应测试：对于液相色谱柱，应定期进行柱效应测试，检查柱的性能是否正常。
这可以通过分析已知的标准溶液或参考物质来实现，以确保柱的分离效果和分辨率。
●检测器校准：对于UV/VIS检测器、荧光检测器、电化学检测器等，应定期进行校准，以确保检测器的灵敏度和响应性能。
●溶剂纯度检查：在使用HPLC进行分析之前，应检查使用的溶剂的纯度。
使用纯度较低的溶剂可能会影响实验结果，因此应选择高纯度的溶剂，并定期进行纯度检查。
●标准曲线校准：对于定量分析，应根据需要制备标准溶液，并利用标准曲线对样品进行定量分析。
标准曲线应当定期进行校准和更新，以确保准确性和可靠性。
●数据记录和审查：在进行HPLC分析时，应当及时记录实验数据，并进行数据审查。
这有助于发现潜在的问题或异常，并及时采取纠正措施。
质量控制和验证：对于关键参数和流程，应建立质量控制和验证程序，确保实验结果的准确性和可靠性。
这包括校准、验证、质量控制样品的使用和记录等。
通过遵循这些仪器确认指导原则，可以确保HPLC分析的准确性、可靠性和重复性，并为实验结果的正确解释和数据分析提供可靠的基础。
赛默飞高效液相色谱使用方法
赛默飞高效液相色谱使用方法
赛默飞高效液相色谱（HPLC）是一种用于分离和分析样品的精密仪器。
具体的使用方法如下：
1.准备工作：
○确保仪器电源已开启。
○安装∗∗谱柱和其他相关配件。
○准备样品和流动相。
2.建立方法：
○进入液相色谱仪的操作界面，选择适宜的色谱柱。
○设置流动相的种类、比例和流速。
○设置样品进样体积和积分时间。
3.进样：
○将样品溶液注入进样器。
○按下开始按钮，液相色谱仪会自动进行分离和检测。
4.数据处理：
○分析结束后，仪器会自动生成色谱图。
○通过数据分析软件对色谱图进行处理，获取目标物质的保留时间、峰面积等数据。
5.清洗和维护：
○实验结束后，关闭仪器电源。
○清洗色谱柱和其他配件。
○定期检查仪器状态，确保正常运行。
需要注意的是，具体操作步骤可能因仪器型号和实验需求而有所不同。
在使用液相色谱仪时，请务必参考相应的说明书并进行培训。
。
高效液相色谱柱效能的测定
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
特点： 灵敏度高； 10-9g·mL-1 线性范围宽； 对流动相的流速和温度 变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
高效液相色谱柱效能的测定
一、实验目的： 1.学习高效液相色谱柱效能的测定方法。 2.了解高效液相色谱仪的基本结构及工作原理。 3.初步掌握高效液相色谱仪的操作及使用。
应的流动相并过滤脱气。 二、开 机 1.依次打开2130高压泵、检测器和计算机电源开关，
设定合适的检测波长。 2.双击桌面上的T2000P色谱工作站图标，进入工作站
系统。
三、编辑HPLC分析方法 1.双击“方法”图标，编辑HPLC分析方法。 2. 保存所编辑的HPLC分析方法。 四、样品分析与采集数据 1.在文件栏中选择分析方法文件。 2.手动进样: 在方法栏中依提示输入文件名称、样品
己烷（分析纯）、甲醇（色谱纯）、水为二次蒸馏 水
四、实验条件：
1.检测器：紫外光度检测器，测试波长254nm 2.流动相：甲醇：水(83：17)，流量0.8 ml/min 3.色谱柱：长250mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合
相(粒度5μm) 4.进样量：20 μL
五、实验步骤：
1. 根据实验条件，将仪器调至可进样状态，待基线平 稳后，即可进样。 2. 吸取标准使用液（含甲苯、萘、联苯各10ug/ml的 正己烷溶液）20μL，注入高效液相色谱仪。 3. 记录下色谱图。 4. 从色谱图中测得甲苯、萘、联苯的保留时间tR，半 峰宽Y1/2，计算对应的理论塔板数n及分离度R。
2、主要部件
（1）、进样装置
使用高压定量进样阀(六通阀)进样装进样体积 由定量管控制，进样准确，重现性好，适于定量 分析。
高效液相色谱仪工作流程
高效液相色谱仪工作流程高效液相色谱仪（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）是现代色谱分析技术中的关键仪器之一，广泛应用于生命科学、医学、制药和环境监测等领域。
HPLC不仅可以分离复杂混合物，还能测定化合物的纯度、分子量和化学反应动力学参数等。
本文将详细介绍HPLC的工作流程及其各个环节的具体内容。
一、概述HPLC分离方法是在特定的操作条件下，利用样品中化合物在流动相与固定相交互作用不同而分离纯化目标化合物的一种仪器分离方法。
常用固定相材料包括硅胶、活性炭、十八烷基硅胶和氨基硅胶等，而流动相则是要经过调节才能使各化合物分离，例如改变溶剂配比，改变温度等。
HPLC一般由液相泵、样品进样器、柱子、检测器和数据处理系统组成。
下面，我们将详细介绍每个环节的作用和工作流程。
二、液相泵液相泵是指在HPLC中负责将流动相（移动相）通过固定相（柱子）的系统中流动的一种泵。
通俗来讲，其功能是向上抬升活塞推动流动相流经柱子，使样品能与固定在柱子上的固定相发生相互作用从而分离出纯度更高的化合物。
液相泵可以提供稳定的流速和压力，是HPLC系统中关键的组成部分。
液相泵在HPLC系统中的具体工作流程如下：1. 设置流速，输入溶剂参数：首先需要在仪器控制软件上设置流速；还需要输入流动相的一些参数，如溶剂的种类、浓度和缩写等。
2. 启动液相泵：通过点击控制软件“启动”按钮将提供压力的泵浦启动。
3. 压力监控：液相泵将持续加压，直到达到预设的压力值。
在加压过程中，成分浓度的变化会导致压力的变化，这时可以通过压力监控系统及时调整流速来保持压力的稳定。
4. 柱前压力平衡：为确保柱子中样品能够顺利分离，开始运行HPLC之前首先需要在柱子中填充流动相，进行柱前压力平衡。
三、样品进样器样品进样器是HPLC系统中负责将待分析的化合物样品进给进HPLC柱中的一个系统，它的主要作用是将待测试的样品转化成具有高性能液相色谱分析所需的样品状态。
高效液相色谱仪校验规程完整
标准文件1、目的Objective：建立高效液相色谱仪内部校验规程，确保校验工作规范、顺利进行。
2、范围Scope ：本规程适用于本公司使用的高效液相色谱仪（紫外-可见光检测器/二极管阵列检测器）的校验。
3、职责Responsibilities：3.1 培训职责：本文件起草人或审核人或批准人负责对质量管理部全体人员培训。
3.2 QC：负责制定本规程，并对本规程的实施负责。
3.3 QA：负责监督和检查本规程的实施。
4、定义Definition：无。
5、程序Procedures：5.1 依据国家计量校验规程JJG 705-2002液相色谱仪，安捷伦液相说明书，岛津液相说明书。
5.2 备件及材料5.2.1水：HPLC级水。
5.2.2化学试剂：乙腈（HPLC）、丙酮（分析纯）。
5.2.3咖啡因标准品。
5.2.4咖啡因标样。
0.005 mg/ml, 0.010 mg/ml, 0.025 mg/ml,0.050 mg/ml,0.125 mg/ml和0.250 mg/ml 咖啡因水溶液。
5.2.5色谱柱：4.6mm×250mm，C18，5µm。
5.2.6 容量瓶：10ml。
5.2.7玻璃注射器。
5.2.8 限流阻尼管。
5.2.9 分析天平。
5.2.10 秒表。
5.2.11 热电偶5.3 校验项目及技术指标5.3.1泵性能的测试5.3.2柱温箱温度稳定性测试*备注：如药典专论规定的特定柱温，不在以上温度范围之内，则对分析该品种的仪器增加该温度点校验，校验项目和可接受指标相同。
5.3.3 检测器性能测试5.3.4进样器性能测试5.3.5梯度组成的测试*注：*表示该项目的内部校验取决于仪器的配置，有该配置则为必检项目。
5.4 校验方法5.4.1校验通则5.4.1.1 HPLC的内部校验由仪器所属部门经培训的使用者按本规程进行校验，其校验项目依仪器配置和使用范围而定。
5.4.1.2 政府部门每一年对HPLC进行校验，每六个月内部对HPLC进行一次校验；仪器配置的关键部件大修或更换后，可参考本规程对该部件相关的项目进行校验，以对仪器的性能进行确认。
液相色谱仪操作规程及参数检验操作方法
............................................................... (3)
SS——流量输出误差％； SR——流量稳定性％； Fm——Fm=(W2-W1)/(ρ∙t)，流量实测值，单位为毫升每分钟（mL/min）； W1 ——称量瓶重量，单位为克（g）； W2 ——称量瓶+流动相重量，单位为克（g）； ρ ——试验温度下流动相的密度，单位为克每毫升(g/mL)；
波长重复性应不大于1nm。 3.2.2 设备及试剂 f) 色谱数据工作站一台 g) 输液泵一台 h) 二通一个； i) 5mL 注射器一支； j) 标物:紫外波长标准溶液（标准波长为 235nm、257nm、313nm、350nm） k) 标物:紫外波长标准溶液空白液:0.05mol/L 硫酸溶液 3.2.3 试验程序
4
2.5 压力显示 2.5.1 要求: 输液泵压力显示与精密压力表差值小于±0.5MPa 2.5.2 设备及试剂: 包括: a) 需经过较准精密压力表一台 b) 堵头一个; c) 二通一个; d) 流动相:A 二次蒸馏水; e) 管路; 2.5.2 试验程序 开启输液泵,查看压力显示是否为 0,若为不 0,将压力调为 0,将输液泵出口管路与二通一接 口相接,精密压力表与二通另一接口相接,开启泵,以 5mL/min 流量运行,直至压力表读书开 始上升至 1MPa 左右(压力表管路体积较大),将流速调成 0.1mL/min,升至 5MPa 时调节压力微 调装置,使压力显示与精密压力表一致。 2.6 清洗装置测试 2.6.1 要求
高效液相色谱的原理及操作规程
色谱概述
分离是个物理过程
固定相（Stationary Phase） 流动相（Mobile Phase） 进样（Injection） 洗脱（Elution） 相互作用（Interaction）
色谱概述
用液体作为流动相的色谱称为液相色谱（LC） 与气相色谱法相比，高效液相色谱法具有很多优点：
1.高效液相色谱柱所用的固定相粒度很小（10µm以下），因此它的分离 效率很高。 2.高效液相色谱中的流动相可以选择不同极性的液体，由于它与固定相 都能对组分产生一定的亲和力，从而提高了分离效率。 3.高效液相色谱法可以应用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的化合 物的分离分析中。 4.高效液相色谱可以在室温条件下进行分析，而气相色谱一般都要在较 高温度下进行
高效液相色谱的原理 及操作规程
色谱概述
色谱法的原理：
是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸 附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分 在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离 两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase),有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流 动相又叫洗脱剂,溶剂
配制样品
样品浓度要适中，不然可能导致测试结果不理想，一般对于液态的样 品可以用小烧杯装半杯溶剂，再滴加3-5滴样品搅拌均匀即可，固态 样品视溶解度情况决定
பைடு நூலகம்
洗针及取样
先用配制样品的溶剂洗针，然后再用配制好的样品洗针，最后再取样， 一般来说洗针次数最好不要少于15次
进样测试
将进样阀扳到下面，进样后再把进样阀扳回去，测试开始
HPLC的图形分析
色谱图(Chromatogram) : 色谱柱流出物通过检测器时所 产生的响应信号对时间的曲线 图,其纵坐标为信号强度,横坐标 为时间
HPLC仪器验证方案
HPLC仪器验证方案HPLC（高效液相色谱）仪器验证是确保仪器正常运行和产生可靠结果的重要步骤。
以下是一个1200字以上的HPLC仪器验证方案，包括设备验证、性能验证和方法验证。
一、设备验证设备验证是验证HPLC仪器的各个组成部分和设备参数是否符合规定要求的过程。
以下是设备验证的主要内容：1.仪器校准：校准仪器的参数（如流速、温度、压力）并与参考值进行比较，以确保精确度和准确性。
2.设备清洁和维护：定期清洁仪器的各个部件，如针尖、柱头和流动通道，以确保仪器正常运行和消除污染的风险。
3.电源和地线：检查电源接头和插头是否正常连接，并确保地线连接良好，以避免电气故障和触电风险。
4.仪器参数设置：根据标准和方法要求，设置仪器的参数，如波长、检测器灵敏度和积分时间等，以确保仪器能够正确执行分析过程。
5.故障检测和保护：测试仪器的自动诊断和保护功能，如温度过高、压力异常和泄漏等故障的检测和报警系统，以及自动停止流程和保护仪器。
二、性能验证性能验证是验证HPLC仪器的参数和性能是否符合规定要求的过程。
以下是性能验证的主要内容：1.流速准确性：使用标准物质，验证仪器的流速准确性，测量仪器的流速与参考值之间的偏差。
2.重复性和精密度：通过多次重复测量相同样品，并计算测量结果的变异系数以验证仪器的重复性和精密度。
3.检测限和线性范围：使用标准物质，测量仪器的检测限和线性范围，并与规定要求进行比较。
4.分离度：使用混合物标准物质，检验仪器的分离度和分辨率，并与规定要求进行比较。
5.峰对称性：使用对称性标准物质，检验仪器的峰对称性，并与规定要求进行比较。
三、方法验证方法验证是验证HPLC仪器的分析方法是否能够正确、准确和可靠地分析样品。
以下是方法验证的主要内容：1.选择合适的标准物质：选择能够准确、快速和可靠地分析样品的标准物质，并制定合适的样品前处理方法。
2.优化分析方法：通过调整仪器参数和条件，优化分析方法，使得样品能够在较短的时间内获得准确的结果。
高效液相色谱法操作规程(2015版药典)
范围：原料、中间体、成品检验。
责任：检验员、QA监控员、化验室主任、质保科科长、质量部负责人。
内容：高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
1.1色谱柱反向色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常用的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。
常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多空微球等填充剂；对应异构体的分离通常使用手性填充剂。
色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2~8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
高效液相色谱仪校验规程
标准文件1、目的Objective：建立高效液相色谱仪内部校验规程，确保校验工作规范、顺利进行。
2、范围Scope ：本规程适用于本公司使用的高效液相色谱仪（紫外-可见光检测器/二极管阵列检测器）的校验。
3、职责Responsibilities：3.1 培训职责：本文件起草人或审核人或批准人负责对质量管理部全体人员培训。
3.2 QC：负责制定本规程，并对本规程的实施负责。
3.3 QA：负责监督和检查本规程的实施。
4、定义Definition：无。
5、程序Procedures：5.1 依据国家计量校验规程JJG 705-2002液相色谱仪，安捷伦液相说明书，岛津液相说明书。
5.2 备件及材料5.2.1水：HPLC级水。
5.2.2化学试剂：乙腈（HPLC）、丙酮（分析纯）。
5.2.3咖啡因标准品。
5.2.4咖啡因标样。
0.005 mg/ml, 0.010 mg/ml, 0.025 mg/ml,0.050 mg/ml,0.125 mg/ml和0.250mg/ml咖啡因水溶液。
5.2.5色谱柱：4.6mm×250mm，C18，5µm。
5.2.6 容量瓶：10ml。
5.2.7玻璃注射器。
5.2.8 限流阻尼管。
5.2.9 分析天平。
5.2.10 秒表。
5.2.11 热电偶5.3 校验项目及技术指标5.3.1泵性能的测试5.3.2柱温箱温度稳定性测试*备注：如药典专论规定的特定柱温，不在以上温度范围之内，则对分析该品种的仪器增加该温度点校验，校验项目和可接受指标相同。
5.3.3 检测器性能测试5.3.4进样器性能测试5.3.5梯度组成的测试*注：*表示该项目的内部校验取决于仪器的配置，有该配置则为必检项目。
5.4 校验方法5.4.1校验通则5.4.1.1 HPLC的内部校验由仪器所属部门经培训的使用者按本规程进行校验，其校验项目依仪器配置和使用范围而定。
5.4.1.2 政府部门每一年对HPLC进行校验，每六个月内部对HPLC进行一次校验；仪器配置的关键部件大修或更换后，可参考本规程对该部件相关的项目进行校验，以对仪器的性能进行确认。
高效液相色谱法检验操作规程
陕西香菊药业集团有限公司GMP管理文件1. 目的：建立高效液相色谱法的标准操作规程，保证正确操作。
2. 依据：《中华人民共和国药典》2010年版一部。
3. 范围：本标准适用于高效液相色谱法的操作。
4. 责任人： QC检验员对本标准的实施负责。
5. 内容：5.1. 定义及概述：5.1.1. 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，进行分离测定的色谱方法，注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离,并依次进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号5.1.2. 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。
常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对；色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
5.1.3. 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外-可见检测器。
色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
5.2. 高效液相色谱仪的使用要求：5.2.1. 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。
5.2.2. 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
5.2.3. 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
5.3. 操作前的准备：5.3.1. 流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水，可用重蒸水。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。
同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。
因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
高效液相色谱仪使用与操作规程(学生用PPT培训课件
目录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的安装与调试 • 高效液相色谱仪的使用步骤 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 安全注意事项 • 高效液相色谱仪的发展趋势与展
望
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 广泛应用于化学、制药、食品、 环保等领域。
检测器技术升级
发展高灵敏度、高稳定性和高可 靠性的检测器，提高检测精度和
可靠性。
应用领域拓展
新药研发
高效液相色谱技术在药物分析、药物代谢和药物 动力学等领域发挥重要作用。
环境监测
用于检测水体、土壤和空气中的污染物和有害物 质，为环境保护提供有力支持。
食品安全
用于检测食品中的农药残留、添加剂、毒素等有 害物质，保障食品安全。
确保实验室环境干燥、 清洁，避免仪器受潮 或落尘。
操作时应避免剧烈振 动仪器，以防损坏内 部组件。
仪器安全
定期检查仪器管路是否漏液，若 有漏液应及时处理。
仪器应放置在通风橱内，以防气 体泄漏对实验人员造成危害。
仪器使用完毕后应关闭所有电源， 并按照仪器说明书进行保养。
数据安全与保密
操作过程中避免无关人员靠近 仪器，以防误操作导致数据丢 失或损坏。
仪器保养与校正
01
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04
定期对仪器进行全面检查，包 括泵、进样阀、色谱柱和检测
器等部件。
根据仪器使用情况，适时清洗 或更换泵内滤网、色谱柱和检
测器。
按照厂家推荐，使用专用工具 和材料进行保养和校正。
定期对仪器进行性能验证，确 保其准确性和可靠性。
L-2000高效液相色谱仪操作使用方法和注意事项
L-2000高效液相色谱仪操作使用方法和注意事项Liquid Chromatograph型号L-2000厂商日本HITACHI公司性能特点液相色谱仪配有紫外检测器，波长范围190～900nm，波长带宽6nm。
仪器配备四元泵，可使流动相进行高压混合梯度洗脱。
基本功能对一般的中性及弱酸、弱碱性有机物进行分离分析。
应用范围有机合成、药物分析、环境样品、化工厂品纯度分析、天然有机化合物的分析等。
操作规程：1.检查1～4号瓶，准备好预先经过滤并超声脱气20min以上的所用流动相，并保证实验过程中各液体足用。
2.打开稳压电源开关→待电压稳定后打开组织器后总开关→检测器开关→泵开关→检查仪器自检情况。
3.设定检测器的波长：按输入波长数值4.泵的准备：逆时针旋转旁通阀→按将%B、%C、%D设为0排A通道气至回液管内无气泡关泵）5.同上操作分别将B、C、D通道内的气体排空→关闭旁通阀（顺时针关到底）。
6.设定工作方式及条件→打开计算机→工作站7.开泵始工作→待基线稳定后进样→搬动六通阀→进样→等出峰完全后，停止采集保存色谱图，再将六通阀手柄转回到“LOA D”，拔出注射器。
8.实验结束后，根据色谱柱类型用相应的流动相清洗柱30分钟，若使用过缓冲液，还要用经过滤并超声脱气的水清洗管道泵头，以防堵塞。
9.退出色谱工作站→关闭各模块电源开关→清洁实验工作面。
10.关闭仪器总电源开关，经由负责人验收，并在使用记录本上登记签字后方可离开。
注意事项：1.使用仪器前必须仔细阅读仪器使用说明书。
2.必须在熟悉仪器使用人员的指导下操作仪器。
3.按仪器使用要求准备测试样品，不得测试不符合要求的样品。
4.小心操作，防止样品污染和腐蚀仪器。
5.仪器要保持干燥、清洁，每次使用完毕应盖上防尘罩。
高效液相色谱法操作规程
高效液相色谱法操作规程目的：建立高效液相色谱法的操作规程，以规范操作过程，确保检验结果准确可靠。
适用范围：原辅料、中药饮片责任人：质量管理部主任、检验员内容：高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等作为流动相，用高压输液泵压入装有固定相的色谱柱中，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪、积分仪或数据工作站记录色谱图。
1 适用范围高效液相色谱法适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物等的定性、定量分析。
中国药典主要用于药品的含量测定，有关物质检查、杂质限度检查和鉴别等。
2 仪器高效液相色谱法主要由输出液泵系统、进样器系统、分离系统、检测系统及数据处理机（或兼有组分收集系统）等组成。
使用时应按仪器的说明书进行操作。
3 仪器的校正3.1 高效液相色谱仪的柱箱控温精度、基线噪声、基线漂移、灵敏度可检测限，线性范围的检定均按仪器说明书的技术要求进行校验，应符合规定。
3.2 以紫外--可见光检测器为检测器的实验室通用液相色谱仪的检定，所用各种标准物质应使用经国家技术监督部门批准颁发的标准物质。
3.3 泵的耐压试验将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，流量设为1ml/min，按说明书要求启动仪器，待压力平稳后保持10min，用滤纸检查各管路接头处应无湿迹。
卸下色谱柱，堵住泵出口端（压力传感器以下），使压力达到最大允许值的90%，保持5min，应无泄漏。
3.4 泵流量设定值误差（Sω）、流量稳定性误差（SR）的试验。
在3.3试验条件下，按下表设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集10-25min，称重，按式(1)、(2)计算Sω和SR。
Sω=（Fm —Fω）/F×100 (1)SR =（Fmax —Fmin）/F×100 (2)式中：Sω——流量设定值误差，%；Fm——（W2-W1）/P.t，流量的实测值，ml/min；W2——容量瓶+流动相的重量，g；W1——容量瓶的质量，g；F——流量设定值，ml/min；Pi——实验温度下流动相的密度，g/cm3；T——收集流动相的时间，min；SR——流动相稳定性误差，%；Fmax——同一组测量中流量最大值，ml/min；Fmin——同一组测量中流量最小值，ml/min。
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高效液相色谱仪的使用及运行性能测试
实验目的
1.了解高效液相色谱仪的基本原理和结构。
2.掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。
3.掌握测试高效液相色谱仪运行性能的指标和方法，验证各部件及整机的性能。
实验器材
高效液相色谱仪，LC-ATvp高压泵、SCL-10Avp程序控制器、SPD-M10Avp二极管阵列检测器、CTO-10Asvp温度控制器。
Shim-packVP-ODS C18 150×4.6mm分析柱、20μl进样器、AS3210型超声波发生器。
无水甲醇和双蒸水各500ml（脱气处理）、萘、咖啡因（均为色谱纯或分析纯）。
实验原理
高效液相色谱法是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。
由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
仪器描述
高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
LC-2010和Agilent1100型为单泵型，适于单一流动相的洗脱；LC-10Avp型为双泵型高效液相色谱仪，适于程序洗脱。
单泵型高效液相色谱仪的结构示意见图9-1。
实验步骤
（一）高效液相色谱仪的基本操作步骤（以岛津LC-10A为例）
1.依照顺序开机，自检完毕后进入操作模板；
2.设定洗脱程序、检测器的条件及测定报告；
3.完成实验过程，打印试验结果，依照顺序关机。
（二）性能测试
高效液相色谱仪的性能检查分为单个部件的验证和整机验证。
验证时一般先验证泵、柱温箱、自动进样器的性能，接着是检测器的性能，最后是整机的性能验证。
验证目的是检查并确认高效液相色谱仪运行性能是否符合要求。
1.验证标准
按照中华人民共和国国家计量检定规程，高效液相色谱仪各验证部件的验证项目的合格标准见表9-1。
表9-1 高效液相色谱仪各验证部件的验证项目的合格标准
验证部件验证项目合格标准
输液泵流量设定值误差Ss
0.5ml.min-1: < 5%；
1.0ml.min-1: < 3%
2.0 ml.min-1: < 2% 流量稳定性误差SR
0.5ml.min-1: < 3%；
1.0ml.min-1: < 2%
2.0 ml.min-1: < 2%
柱温箱柱温箱设定值误差ΔTs< ±2℃柱温箱控温稳定性Tc ≤1℃
自动进样器进样量准确度误差≤±2%
检测器基线噪声≤2×10+5AU
最小检测浓度≤1×10-7g.ml-1(萘的甲醇溶液) 基线漂移≤5×10-4AU.h-1
整机性能定性测量重复性误差RSD≤0.5%
2.验证步骤
（1）输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定
将仪器的各部分联接好，以甲醇为流动相，流量设为1.0mL.min-1，按说明书启动仪器，待压力平稳后保持10分钟，按表16-2设定相应数值，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集，称重。
按式(1)、式(2)计算SS和SR，结果填入数据记录与处理的表9-3中。
表9-2 流量、次数、收集时间表
流量设定值（mL/min）0.5 1.0 2.0
测量次数 3 3 3
流动相收集时间（min）10 5 5
（3）自动进样器进样量准确度误差的检定
取1.5ml进样瓶装入1ml水，用天平精密称定其重量，然后置于自动进样器上让其进样10次，每次50μl。
进样完成后再精密称定其重量，由重量差计算进样量准确度，结果填入数据记录与处理的表16-5中。
（4）检测器的检定
①检测器基线噪声和基线漂移的测定取C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml.min-1，检测器波长设定为254nm，开机预热，待仪器稳定后（约60min）记录基线60min，从30min内基线上读出噪音值；从60min基线上读出基线漂移值。
②检测器最小检测浓度的测定取C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为
1.0ml.min-1，检测器波长设定为254nm，开机预热，待仪器稳定后取1×10-7g.ml-1的萘/甲醇溶液进样20μl，记录色谱图，由色谱峰峰高和基线噪声峰峰高算按照下列公式计最小检测浓度CL。
CL=(2×Nd×C)/H
式中: CL：最小检测浓度，g.ml-1；Nd：基线噪声峰峰高，mm；
C：标准溶液浓度，g.ml-1；H：标准溶液峰峰高，mm。
实验结果填入数据记录与处理的表16-6中。
（5）整机性能的检定
取C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml.min-1，检测器波长设定为254nm（当选用萘时）或272nm（当选用咖啡因时）,柱温设定为40℃。
开机预热待仪器稳定后取0.1mg.ml-1的萘/甲醇溶液或0.02mg.ml-1的咖啡因甲醇溶液进样10μl，连续进样6次，记录其峰面积和保留时间，以保留时间计算其定性测量重复性误差，以峰面积计算其定量测定重复性误差。
实验结果填入数据记录与处理的表9-7中。
数据记录与处理
将上述的实验数据记录于下列各表，并进行相应的数据处理，得出检定结论。
（1）输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定
表9-3 输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定结果
液相色谱仪型号：泵型号：流动相：色谱柱：鉴定日期：检定人：复核人：
Fs 0.5 ml.min-1 1.0 ml.min-1 2.0 ml.min-1
1次2次3次1次2次3次1次2次3次
W1
W2
t
T
ρT
Fm=(W2-W1)/ ρT·t
SS＝(Fm－FS)/FS×100%
平均SS
F=(Fm1+Fm2+Fm3)/3
Fmax
Fmin
SR＝(Fmax－
Fmin)/F×100%
此项检定结论：（2）柱温箱柱箱温度设定值误差ΔTS 和控温稳定性TC 的检定表9-4 柱温箱柱箱温度设定值误差ΔTS 和控温稳定性TC 的检定结果
液相色谱仪型号：柱温箱型号：数字温度仪型号：
T设定35℃45℃
时间读数时间读数
稳定时
第1次
第2次
第3次
第4次
第5次
第6次
第7次
T平均
T最大
T最小
ΔTs=T平均-T设定
Tc =T最大-T最小
此项检定结论：
（3）自动进样器进样量准确度误差的检定
表9-5 自动进样器进样量准确度误差的检定结果
液相色谱仪型号：自动进样器型号：检定温度：℃
进样前进样瓶加水的总重W1（g）进样后进样瓶加水的总重
W2(g)
水的密度ρ
(g/ml)
进样量准确度误
差(%)
进样量准确度误差=[(W1-W2)-(50×10×10-3×ρ)]/（50×10×10-3×ρ）×100% 此项检定结论：（4）检测器的检定
表9-6 检测器的检定结果
液相色谱仪型号：检测器型号：色谱柱：
流动相：流速：萘甲醇标准溶液浓度C：配制人：配制日期：基线噪声Nd 基线漂移H 最小检测浓度CL
最小检测浓度的计算: CL=(2×Nd×C)/H
此项检定结论：
（5）高效液相色谱仪整机性能的检定
表9-7 整机性能的检定结果
液相色谱仪型号：检测器型号：色谱柱：检测波长：nm流动相：
流速：标准溶液类型：浓度：配制人：配制日期：
定性测定（保留时间）定量测定（峰面积）
第1次
第2次
第3次
第4次
第5次
第6次
平均值
测量误差的RSD
备注：测量误差的RSD采用EXCEL函数表格计算
此项检定结论：高效液相色谱仪的验证结果分析和综合评价
根据实验测定结果，讨论说明高效液相色谱仪整体运行性能状况。