大鼠胰岛细胞原代培养

大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,无菌取出胰腺,置于4℃Ｈａｎｋｓ液中,用眼科小剪刀将胰腺剪成1ｍｍ3大小的组织块,加入0.5ｇ·Ｌ-1胶原酶,37℃恒温水浴振荡消化15ｍｉｎ,将已消化至细颗粒状组织吸出,并用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化,余下未消化完全的组织加入少量37℃Ｈａｎｋｓ液,用粗口径吸管轻轻吹打,直至大部分组织被消化成细颗粒状,用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化。混合前后两部分的消化产物,用Ｈａｎｋｓ液低速离心洗涤3次后,将组织置于含100Ｕ·ｍｌ-1青霉素,100ｍｇ·Ｌ-1链霉素,11.1ｍｍｏｌ·Ｌ-1葡萄糖,10ｍｍｏｌ·Ｌ-1Ｈｅｐｅｓ和7%的胎牛血清的完全ＲＰＭＩ1640培养液中,用150目(108μｍ)尼龙筛网过滤,以除去未被消化的组织和结缔组织。将已分离好的胰岛细胞和细胞团,置于含上述培养液内的培养瓶内培养。24ｈ后,吸出未贴壁的细胞悬液,低速离心以收集细胞,显微镜下计数后,以每孔一定数量胰岛细胞团接种于24孔细胞培养板内,继续培养48ｈ后用于实验。

我分离胰岛细胞后,用DTZ染色,发现溶液中含有许多小颗粒,放入温箱中也未发生变化,镜下观察没有看到文献中所说的红染细胞。我是将100mg双硫腙粉末溶于10mlDMSO中，用滤纸过滤，用时用KRBB缓冲液稀释100倍。胰岛细胞分离是将成年大鼠胰腺用胶原Ⅴ酶消化后，过150目网取滤过液，再过400目网取网上细胞，加入L-DMEM培养。方法是我根据文献稍作改动后实施的。胰岛细胞分离和染色对于我都是第一次做，请高手指点一下。

溶液中如果有紫黑色小颗粒，那就是DTZ，过滤除的不净。没有红染的细胞就是没有胰岛啊。还有，我总觉得150目太密了，很多胰岛都滤不过去吧

大鼠胰岛细胞原代培养

一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks 悬浮，离心，重复1~2次，再用培养基洗2~3次，用培养基悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng/mL 的碘乙酸的培养基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞，

胰岛细胞移植的研究进展

人类至今已有100多年用移植方法治疗糖尿病的历史，胰岛细胞移植治疗糖尿病存在两个障碍：组织来源不足和免疫排斥反应。

一．胰岛细胞的来源

1．同种的成人及胎儿胰岛成人胰岛一般取自新死亡的健康尸体，抗缺氧的能力较弱，且慢存在外分泌活性组织，死亡之后即迅速自溶，故应用较为困难。而胎儿胰岛对低温缺氧的耐受能力较强、免疫原性弱、胰岛组织丰富、含有干细胞、移植后可保持正常的生长增殖能力，因此成为较为理想的供体组织。

2．异种胰岛猪的组织来源广泛，血糖调定点与人相似，猪胰岛素与人胰岛素排列极为接近，且能在新鲜的人血清组织中存活增生，猪胰岛成为最有可能的异种供体。

3．胰腺导管细胞胰腺导管细胞具有极强的扩增和分化能力，可在适宜的外部刺激下通过快速增殖丧失其导管细胞表现型，从而还原成多潜能细胞并进一步分化成为胰岛细胞。

4．干细胞根据来源分为胚胎干细胞和成体干细胞。

5．基因技术产生的具有胰岛素代谢特征的新型细胞运用基因从组技术和转基因技术，将胰岛素基因直接或间接转入靶细胞，从而构建具有胰岛素代谢特征的新型细胞用于胰岛细胞移植。

二．胰岛细胞体外增殖及其影响因素

对人胎胰岛细胞培养条件的研究显示：RPMI1640培养基，11.1mmol/l葡萄糖,增加6倍氨基酸,PH7.2,以人/胎血清代替小牛血清,与某些细胞共同培养,这些因素均有利于人胎胰岛组织的生长和B细胞功能的维护。

三．胰岛细胞移植技术

1．胰岛细胞的分离和纯化分为机械分离消化法和胶原酶消化法。

2．胰岛细胞的保存组织培养是胰岛细胞保存的有效方法。胰岛在组织培养中至少可保存7 天，数周后仍能合成胰岛素，对葡萄糖刺激产生胰岛素分泌反应。

3．胰岛细胞移植的部位理想的移植部位应安全、血供丰富、植入细胞易于存活并发挥功能，可逃避免疫反应。按移植部位将胰岛细胞移植分为原位移植和异位移植。原位移植是基于胰岛素经门静脉进入肝脏这一生理基础来确定的，包括门静脉内、肝内、脾内、大网膜及腹腔内等部位的的移植。异位移植则指皮下，肌肉内、睾丸内、胸腔内、肾包膜下及脑内等部位的移植。目前多采用肝内门静脉注入的方法进行胰岛细胞移植。

4．胰岛的移植量一般认为胰岛的移植量至少要达到10—20%，才能维持正常血糖和糖基化血红蛋白水平。5．胰岛细胞移植的适应征

①.胰岛素依赖型糖尿病(IDDM,I型)和严重的非胰岛素依赖型糖尿病：为防止慢性并发症的产生，有人提倡早期胰岛细胞移植

②上腹部脏器晚期恶性肿瘤如晚期胰腺癌\肝癌.

③.慢性胰腺炎为解决疼痛全或次切除胰腺需行自体胰岛移植。

6．胰岛细胞移植的原则

①从获得供体胰腺到胰岛细胞分离与纯化的冷缺血时间需控制在8小时以内，而胎儿离开母体4小时内应立即取出胎胰进行消化分离

②胰岛分离纯化后应立即移植

③门静脉内移植相对较佳，包括经肠系膜上静脉插管入门静脉、内窥镜门静脉直接注入

④遗址量应大于8000—11000IEQ/Kg

⑤早期免疫抑制剂首选T淋巴细胞抗体

⑥可多次，足量进行移植

四．免疫排斥反应的预防

1．减轻胰岛免疫原性制备高纯度的胰岛能够去处抗原提呈细胞，有效地降低免疫原性。

2．免疫隔离胰岛移植物免疫隔离技术利用人工装置将移植的胰岛和受体的免疫系统隔离开来，能组止受体的淋巴细胞和抗体对胰岛组织的攻击，而不影响胰岛素和营养物质的自由出入。

3．抑制受体的免疫反应通过调节移植受体的免疫系统，从而达到胰岛细胞免疫耐受