重组蛋白制备

六、重组质粒鉴定方法
1）PCR鉴定 利用目的基因特异性的引物，重组质粒作为模板，利用 PCR进行鉴定。若能扩增出DNA产物，则重组质粒含有目 的基因；反之不含目的基因，为空质粒。
2）限制性酶切鉴定 利用插入目的基因时所用的限制性内切核酸酶消化重组 质粒，若能产生对应大小的DNA片段，重组质粒含有目的 基因；反之不含目的基因，为空质粒。
His标签和金属螯合亲和层析

金属螯合层析原理：基于蛋白质表面的一些特 定的氨基酸残基侧链，尤其是组氨酸，在中性 和弱碱性条件下可以和固定化的金属离子相互 作用，如Ni2+、Zn2+和Co2+，从而分离蛋白质。

His标签是目前应用最为广泛的亲和标签。
His标签优缺点


优点： • 标签分子量小，一般不影响目标蛋白的功能； • 可用于变性/非变性纯化； • 免疫原性相对较低，可直接用于抗体制备； • 可应用于多种表达系统，纯化条件温和； • 可和其它亲和标签共同构建双亲和标签。 缺点： • 融合蛋白易形成包涵体，包涵体蛋白难于溶解； • 包涵体溶解后不能正确复性； • 层析时螯和的金属离子容易泄漏； • 非特异性结合会造成制品纯度不高。
模板双链DNA的变性：～94℃ 引物与单链模板的退火：～55℃ 引物的延伸：～70℃
一个PCR循环(PCR cycle)包括变性—退火—延伸三个步骤；
理论上可使靶序列数量增加一倍。
30个循环后，可获得106个靶分子
PCR循环
PCR反应五要素

DNA聚合酶：影响PCR反应的产量 引物：影响PCR反应特异性的关键因素 dNTP：影响PCR反应扩增效率的关键因素 模板：决定PCR反应成败的关键环节之一
三、克隆载体－质粒
质粒的相关概念 可以在宿主细胞内进行复制的环形DNA分子。 不同质粒在宿主细胞内的分子数(拷贝数)不同。 在体外不能复制、传代；但DNA可长期保存生命活 力。微生物基因组DNA不再具有生命活力。 根据宿主细胞差异，质粒分为多种类型。 根据用途差异，质粒分为:克隆载体和表达载体。 人工构造的质粒具有的必需功能元件：复制起始 区、抗性筛选标记、多克隆位点。
几丁质结合肽
IMPACT系统使用几丁质结合肽（来源于环状芽 胞杆菌）作为融合标签，表达的融合蛋白可以 用几丁质亲和层析纯化，利用内含肽（intein） 的特异性原位剪切直接获得目标蛋白。 最大优点：不需使用蛋白酶来去除融合标签。 包括以下几类：

巯基诱导的N端剪切系统； 巯基诱导的C端剪切系统； pH诱导的C端剪切系统； 可用于蛋白质环化的双内含肽系统。

蛋白纯化
重组蛋白纯化标签

6XHis：6个连续组氨酸 GST：谷光甘肽转移酶 Chtin Binding Domain：几丁质结合结构域 Maltose Binding Protein：麦芽糖结合蛋白 Biotinated peptide：生物素化多肽链 Step Tag II：短肽序列，生物素功能类似物 FLAG（DYKDDDDK）：短肽序列， S tag：短肽序列，结合S tag 抗体 T7 tag：短肽序列，结合T7 tag 抗体

连接反应获取重组环状DNA分子
五、DNA转化反应



DNA转化原理 在某些特殊生理条件下，宿主细胞可以高效吸收外源DNA，从而将外 源DNA转入特定宿主菌。 DNA转化方法 1）化学转化：用某些二价金属离子，例如50mM CaCl2，处理宿主 细胞，使宿主细胞处于高效吸纳外源DNA的生理状态，称之为感受态。 之后将外源DNA转化进入宿主菌细胞。 2）电转化：高电压瞬时处理（电击）宿主菌，可使宿主菌处于极 高效吸纳外源DNA的生理状态。电转化效率是化学转化效率的10－ 100倍。 主要应用 将可自我复制的外源DNA，如各种质粒，转入宿主菌，并在宿主菌 内繁殖这些质粒，实现相应质粒的大规模制备。

阿拉伯糖表达系统： 大肠杆菌RNA聚合酶负责转录pBAD启动 子控制的外源基因转录。属于严紧型表达 系统，目标蛋白mRNA分子的转录过程可以 通过诱导物的调控来达到严格的开放/关闭 状态，诱导物L-阿拉伯糖(L-arabinose)浓 度连续变化实现外源重组蛋白表达水平的 连续调控。无诱导物时，pBAD启动子控制 的外源基因的转录受araC蛋白抑制。
3）DNA序列测定鉴定 将重组质粒进行DNA序列测定，在碱基序列水平验证插 入片段的存在。
蛋白诱导表达
蛋 白 诱 导 表 达
一、重组蛋白表达系统
原核表达系统： 表达载体中的重组蛋白表达元件是原核生物特有 的，表达宿主也是各种原核生物，例如大肠杆菌。 真核表达系统： 重组蛋白表达元件是真核生物特异性的，表达宿 主为各种真核生物，例如啤酒酵母、昆虫、哺乳动 物细胞。 无细胞翻译系统： 不需要宿主细胞，只需要把目的蛋白的mRNA加入 无细胞翻译系统，37度保温一段时间即可合成出毫 克级的目标蛋白质。优势主要是目标蛋白纯化简便 。
无细胞翻译系统

大肠杆菌无细胞翻译系统 即大肠杆菌细胞裂解液。大肠杆菌细胞有一定要 求，一般是核酸酶与蛋白酶缺失突变株，核酸酶缺 失大大降低了mRNA的降解，而蛋白酶的缺失降低了 合成的目标蛋白的降解，从而提高目标蛋白产量。 一般用于表达原核生物蛋白。 兔网织红细胞无细胞翻译系统 一般用于合成真核生物蛋白，可以保证有效的进 行蛋白翻译后的各种修饰。
基因克隆流程图
一、目的基因片段获取
1）聚合酶链式反应——PCR
2）反转录-聚合酶链式反应——RT-PCR
PCR
PCR： Polymerase Chain Reaction 多聚酶链式反应
ຫໍສະໝຸດ Baidu
美国Kary B.Mullis1985年建立 (1993诺贝尔化学奖获得者)
PCR反应的三个基本步骤


二、限制性酶切反应
反应原理 限制性内切核酸酶识别双链DNA的特异性序列， 并在此特异性序列处或附近切断双链DNA。 反应特点 切割位点具有碱基序列特异性，只在特定碱 基序列处切断双链DNA。 注意事项

a 不同限制性内切核酸酶反应缓冲液有很大差别， b 一部分限制性内切核酸酶活性受DNA识别序列甲基化修 饰影响
基因克隆所需通用材料


需要克隆的目的DNA片段。 克隆载体，用于接入目的DNA片段。 限制性内切核酸酶，消化目的DNA片段与克隆载 体，产生连接反应所需要的DNA粘性末端。 DNA连接酶，将目的DNA片段与克隆载体连接在 一起，构建重组载体。 大肠杆菌感受态细胞，用于筛选含有插入目的 DNA片段的阳性克隆。
如何获得重组蛋白？
重组蛋白制备
重组表达载体构建 目标蛋白重组表达 最高效的蛋白分离纯化方法——亲合纯化

重组表达载体构建
基因克隆
基因克隆(Gene Cloning):
亦称分子克隆技术。将某特定基因或DNA
片段插入到载体分子中,并筛选获得纯化
(克隆)重组子的技术。
基因克隆程序
1）目的基因片段获得 2）目的载体的获得 3）目的基因与载体DNA的限制性酶切 4）酶切目的基因与载体DNA片段的连接重组 5）连接重组质粒转化大肠杆菌 6）含目的基因插入片段的重组子鉴定

原核表达系统
根据原核表达载体中用于表达重组蛋白的必需元 件的差异，主要是启动子、识别并结合启动子的 RNA聚合酶、诱导物的差异，常用的原核表达系 统有: T7-lacI表达系统 由T7RNA聚合酶结合在T7启动子上，转录合成 目标蛋白的mRNA分子。诱导物为isopropyl-βD-thiogalactoside（IPTG，异丙基-b-D-硫代半 乳糖苷 ），无诱导物时，T7启动子控制的外源 基因的转录受lacI蛋白抑制。 代表：PET系列载体

Mg2+：影响PCR反应扩增的特异性和产量
RT-PCR

以RNA作为模板，反转录酶合成互补DNA
（cDNA）

以cDNA作为模板，PCR指数扩增目的基因
片断。与普通PCR相同。
反转录反应
反应原理：反转录酶以RNA为模板指导互补DNA链合成。 反应组分：polyT引物，dNTPs，mRNA模板 反应特点：特异性以mRNA作为模板。 注意事项：防止核酸酶A（RNase A）污染 ，RNase A会 降解RNA模板，使反转录反应失去模板而失败。 与PCR区别： 1）PCR反应为链式反应，产物以指数方式扩增；反转录 为线性扩增，且只能合成一条与RNA互补的DNA链。 2）PCR为热循环反应，DNA聚合酶具有热稳定性；反转 录为常温反应，反转录酶不具有热稳定性，高温使反转 录酶失去酶活性。

基于几丁质与几丁质结合结构域的亲合纯化
麦芽糖结合蛋白（MBP）


此系统使用交联直链淀粉的亲和介质纯化，用麦芽糖进 行竞争性洗脱。 优点：
•
• • • •
MBP不含有半胱氨酸残基，不会干扰目标蛋白形成正确的 二硫键； 使用的介质价格低廉； 可在温和条件下洗脱融合蛋白； 加上其分泌信号，可以进行分泌表达在细胞周质； 这一系统最显著的特点是与MBP进行融合表达可以改善目 标蛋白的溶解性，促进正确折叠，提高活性蛋白的回收率
表达载体
含有一个启动子序列,能有效地促使插入的目的 基因进行转录,进而翻译出该插入基因编码的蛋
白产物的载体。
表达载体的启动子通常与其受体同源,如以大肠 杆菌为受体的表达载体,其启动子来源于大肠杆 菌系统;在痘苗病毒中表达的启动子则来源于痘 苗病毒。
表达质粒构成元件

复制起点 抗生素选择标记基因 多克隆位点 用于DNA序列测定的区域 重组蛋白表达元件 1）启动子（promotor）：RNA聚合酶结合位点，负责转录合成外源插 入基因的mRNA分子。 2）S-D序列：核糖体结合位点（ribosome binding sequence，RBS） ，核糖体结合在mRNA分子的RBS上，起始蛋白翻译，合成重组蛋白质 。 3）阻遏蛋白编码基因（repressor） 4）转录调控序列（阻遏蛋白结合序列） 5）转录终止序列（terminator） 6）纯化标签编码序列
选择亲和标签时需考虑的因素

亲和标签是否会影响目标蛋白的结构和功能（小） 蛋白质的稳定性 亲和标签所融合的位置（N端，C端） 是否需在变性条件下进行亲和纯化（标签适合否）


亲和标签对表达水平的影响（标签、蛋白、系统）
是否需标签具有鉴定功能 亲和洗脱的条件（不使蛋白变性） 亲和介质和缓冲液的费用 是否在亲和纯化后去除标签
谷胱甘肽巯基转移酶蛋白标签(GST)





最早使用的亲和标签。 目标蛋白加于GST的C端，再利用谷胱甘肽亲和介质 进行纯化，或固定在亲和介质上进行蛋白质-蛋白质 互作研究。 因GST分子量较大，且以二聚体的形式存在，一般都 需要去除融合标签。 此系统必须依赖于GST的正确折叠。 GST融合蛋白常用来免疫动物生产抗体，及作为载体 蛋白进行一些蛋白的结晶。
pUC18质粒图谱
pUC18多克隆位点
四、DNA连接反应

反应原理：DNA连接酶催化DNA分子3’羟基（3’-OH）与5’ 磷酸基团（5’-P）间形成磷酸二酯键


反应组分：DNA连接酶及相应辅基，DNA分子。
DNA连接种类： 1）ATP作辅基的DNA连接酶，例如T4DNA连接酶，pfu DNA 连接酶 2）NAD＋作辅基的DNA连接酶，例如大肠杆菌DNA连接酶 应用： 1）DNA重组构建重组质粒 2）DNA连接反应检测单核苷酸多态性

色氨酸－lacI表达系统（Trp-lac）：
大肠杆菌RNA聚合酶转录Ptrp启动子控制
的外源基因转录。诱导物为IPTG，无诱导
物时，外源基因的转录受lacI蛋白抑制。
真核表达系统



酵母表达系统 啤酒酵母，可表达在啤酒酵母细胞内的表达载体上编码 的重组蛋白；甲醇酵母，表达的重组蛋白的编码基因与 各种必需的表达元件已整合到甲醇酵母基因组中。 昆虫表达系统 具有昆虫特异性的启动子，外源基因处于启动子下游。 哺乳细胞表达系统 哺乳细胞病毒特异性启动子，外源基因处于该启动子下 游，调控外源基因转录过程。 生物加工厂 转基因动物，基因组中整合了目标蛋白的编码基因与表 达元件，转寄因鸡、猪、牛、羊等