病毒分离培养的细胞培养法

第18章病毒分离培养的细

胞培养法

•细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛，除用作病毒的病原分离外，还可研究病毒的繁殖过程及其细胞的敏感性（细胞的病理变化及包涵体的形成）。观察病毒感染时细胞新陈代谢的改变，探讨抗体与抗病毒物质对病毒的作用方式与机制，以及研究病毒干扰现象的本质和变异的规律性，可用于病毒的分离鉴定，抗原的制备及疫苗，干扰素的生产

、病毒性疾病诊断和流行病学调查等

一、细胞培养用于病毒研究的优点：

1、没有隐性感染)

2、没有免疫力)

3、容易选择易感细胞)

4、接种量大)

5、培养条件易于控制)

6、提高了疫苗的产量和质量)

7、加速病毒分离过程)

8、真核基因病毒载体的理想宿主

)

•动物可能带有某些病毒的隐性感染，往往有干扰作用和假阳性出现。细胞培养一方面是来源于动物部分组织，减少了隐性感染的机会，另一方面组织培养细胞可进行预先检查而加以克服。

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•动物经隐性感染获得免疫力，对接种病毒会发生抵抗，但由于后天免疫一般不表现在细胞抵抗力的增加，因此离体细胞无免疫力，利于病毒生长。

)

•细胞来源方便，可供作病毒敏感性的筛选，可以从中选择最敏感的细胞以满足实验要求，同时还利于从单一细胞水平上研究病毒的繁殖过程和病毒一细胞的相互关系。

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•动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制，细胞不仅可以大量生产，而且还可较久地持续培养，便于病毒生长，特别是对那些生长缓慢或需在新环境中逐渐适应的病毒更为有利。

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•由于细胞培养可以用人工控制温度、气体、pH、培养基成分，因此可采用大规模生产方式来生产细胞和病毒及其细胞产物。

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•细胞的大量生产可满足疫苗产量的需求，而且异性蛋白少，引起变态反应机会少。疫苗中污染菌少或无，可随制随用，成本低，来源方便，便于贮存，且效力均匀，易标准化。

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病毒分离采用细胞培养不仅阳性率高，而且分离过程可显著加速早出结果，但应用对该病毒敏感的细胞。

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二、用细胞培养分离病毒、繁殖

和滴定病毒

(一)接种标本的处理：

1、粪便标本

2、肛门拭子

3、咽漱液及咽拭子

4、组织悬液

(二)病毒的细胞培养

1、病毒在细胞中的生长现象

（1）细胞病理性改变(CPE) ：包括细胞的裂解、聚集和融合

（2）包涵体的形成

（3）代谢生长抑制

（4）细胞转化、出现“转化灶”

2、病毒的分离：不同的病毒对细胞敏感性不同，应选用敏感细胞分离不同的病毒

+代表25%以下细胞发生病变，

++代表50%左右细胞发生病变，

+++代表75%左右，细胞发生病变，

++++代表100%左右细胞发生病变。

表2-13 分离培养病毒常用的细胞培养

类型名称

原代细胞培养猴肾细胞、人胚肾、肺细胞、人羊细

胞、鸡胚成纤维细胞、兔肾、狗肾细

胞等

二倍体细胞株WI-38(人胚肺细胞株)HL-8(恒河

猴胚细胞株)

传代细胞系Hela细胞(人子宫颈癌细胞系)、

Chang C/I/L/K(人结肠C、肠I、

肝L与肾K细胞系)、(绿猴肾细胞系)

BHK-21（幼地鼠肾细胞系）等

3、病毒的效价测定：TCID50(亦称50%组织培养物感染剂量)。

（1）CPE法：产生++的最高病毒稀释度（2）蚀斑(又叫空斑) 法：用pfu/ml表示（蚀斑单位）

4、病毒的生产及病毒抗原制备（疫苗生产），细胞大量培养后加入病毒，扩增病毒

5，中和抗体的测定：

利用中和抗体可抑制病毒增殖，可采用CPE 抑制试验、蚀斑减少试验、代谢抑制试验、血凝抑制试验测定

6、干扰素效价测定：

常用微量细胞病变抑制法

三、病毒的鉴定技术

病毒蚀斑技术

细胞培养系统中的中和试验

(一)病毒蚀斑技术

•病毒蚀斑(又叫空斑)如同噬菌体的噬斑，一个蚀斑为一个病毒体的繁殖后代品系。在细胞培养中做蚀斑是一种较精确地测定病毒感染力的方法，将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1小时后，在单层细胞上复以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。但由于琼脂的限制只能感染邻近的细胞，形成“蚀斑”的退化细胞区，经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞已退化不着色，形成不染色区域。凡是能在细胞培养物中产生细胞死亡破裂现象（CPE）的病毒都可采用蚀斑技术来分离和测定。

)

(二)病毒蚀斑抑制试验

•用抗血清作用病毒后可抑制病毒蚀斑能力方法有两种：

•1、一般来说，凡是抵抗力强，容易控制蚀斑滴度的病毒（如少数虫媒病毒和肠道病毒等），皆可用“固定病毒”、“稀释血清”的方法进行。

•2、反之，凡是抵抗力弱，不易控制空斑滴度的病毒（如大多数虫媒病毒等）皆可改用为“固定血清”、“稀释病毒”的方法进行。

)

(三)细胞培养系统中的中和试验：

•在细胞培养中进行中和试验可用于病毒实验室诊断，首先从病人分离的病毒可用于已知特异免疫血清来中和此病毒，抑制细胞培养上的CPE或蚀斑形成等能力，以助鉴定病毒，另外患者的急性和恢复期血清中抗该病毒的抗体明显升高，可作为此病毒患者之诊断

。

四、用细胞培养法制备病毒血清

学抗原

用于许多病毒中和试验、血凝试验、补体结合试验、凝集及沉淀反应的抗原，可用组织培养之材料制备。