优质课DNA的粗提取与鉴定

（三）除去滤液中的杂质
1. DNA的溶解性
方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为 2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节 NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶 液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。
思考：加入2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min，注意应沿一个方向， 目的是？ 目的是使DNA充分溶解 思考：过滤溶解有DNA的2mol/L的NaCl溶液，获得什么？ 含DNA的滤液 思考：这一步过滤的目的是？
含DNA的滤液，除去不溶的杂质
DNA的析出 将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤 是实验成败的关键。 加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。
实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一 个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠 绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的始终浓度 为0.1～0.2 mol/L。加水太多、溶液过稀，会使DNA 分子又重新溶解。
⑵ DNA不溶于酒精溶液 利用这一特点，
选择适当的盐浓度 就能使DNA充分溶解， 而使杂质沉淀； ⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 或者让其他成分溶解， DNA析出
在 NaCl 溶 液 浓 度 低 于 0.14 4、DNA的溶解性 当氯化钠的物质的量浓度为
2 mol/L 时 ， DNA 的 溶 解 度 随 mol ／ L 时， DNA 的溶解度最大， DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的 NaCl溶液中溶解度不 NaCl溶液浓度的增加而逐渐 浓度为 0．14 mol／L时，DNA 降 低 ； 在 0.14 mol/L 时 ， 的溶解度最低。利用这一原理， 同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使 DNA充分溶解， DNA 溶解度最小；当 NaCl 溶 可以使 DNA 在盐溶液中溶解或 液浓度继续增加时， DNA 的 析出 而使杂质沉淀，或者相反 溶解度又逐渐增大。
⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ① 蛋白酶——水解蛋白质， 对DNA没有影响 ② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃ 而DNA在80℃以上才会变性
③ 洗涤剂——瓦解细胞膜， 但对DNA没有影响
（二）DNA的鉴定 试剂： 二苯胺 条件： 沸水浴 现象： 沸水浴条件下， DNA与二苯胺反应呈现蓝色
讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分 可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌 的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核 膜的破裂)，从而释放出DNA。
2、植物细胞 ① 植 物 细 胞 需 要 先 讨论：加入洗涤剂和食 用 一 定 的 洗 涤 剂 溶 盐的作用分别是什么？ 解细胞膜
思考：搅拌的目的(玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌) 卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA
2. DNA的鉴定
⑴ 向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液5ml
⑵ 其中一支试管中加入DNA丝状物，用玻璃棒搅拌，使 丝状物溶解
⑶ 向两支试管中各加入二苯胺试剂4ml ⑷ 混匀后，置于沸水浴中加热5min ⑸ 待试管冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化 观察现象：
获得DNA黏稠物。除去溶液中的杂质
为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
1、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除
去在高盐中不能溶解的杂质；
2、用低盐浓度使DNA析出，能除去溶
解在低盐溶液中的杂质。
因此，通过反复溶解与析出DNA，就能
够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？
方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA 与蛋白质分开；
方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，
使蛋白质变性，与DNA分离
（四） DNA的析出与鉴定
1、DNA的析出 与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95％)， 静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物
——粗提取DNA
用玻璃棒沿一个方向搅拌， 卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水
本实验两次析出DNA
第一次：用0.14 mol／L 的NaCI溶液析出DNA，过滤 除去溶液中的杂质 第二次：用冷却的95％的酒精，获得含杂质较少的 DNA丝状物（利用DNA容易酒精溶液，但是细胞中的 某些蛋白质则溶于酒精）
实验成功的关键及注意事项
1.破碎细胞，释放DNA的过程中，若是血细胞，加水后必须充分搅 拌，不应少于5min；若是菜花，则应与研磨液混合，研磨时间不 少于10min
2.加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏
3.二苯胺配制时间过长，变成浅蓝色，影响鉴定效果 4.析出含DNA的黏稠物时，蒸馏水一次快速加入，影响实验结果
5.实验中有多次搅拌，但是其目的及操作方法是不同的，操作时不注 意区分，影响实验结果（注意：搅拌都沿一个方向进行）
②实例：提取洋葱 DNA 时，在切碎的洋 葱中加入一定的洗涤 剂和食盐，进行充分 的搅拌和研磨，过滤 后收集研磨液
答：洗涤剂是一些离子去 污剂，能溶解细胞膜，有 利于DNA的释放；食盐的 主要成分是NaCl，有利于 DNA的溶解
讨论：如果研磨不充分，会对 实验结果产生怎样的影响？
答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全， 提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝 状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等
①根据DNA在NaCl溶液中的溶 ②如何通过控制 NaCl溶液的浓 解度曲线图，思考在什么浓 度使 DNA 在盐溶液中溶解或析 度下 ， DNA 的溶解度最小？ 出？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是 如何变化的？
⑵ DNA不溶于酒精溶液
DNA不溶于酒精溶液， 但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 将DNA与蛋白质进一步分离。
但是，选用DNA含量相对较高的组织，成功的可 能性更大
材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）
思考题：能否选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料？为什么？
不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
1、动物细胞
动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞 液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌， 过滤后收集滤液即可
本实验中有三次过滤 ,获得什么？ • ⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液 • 获得含核物质的滤液 • ⑵过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液 • 获取纱布上的DNA粘稠物 • ⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液 • 得到含DNA的滤液
实验中有五次用玻璃棒搅拌?分别有什么作用?
• 第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液
加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA
• 第二次搅拌加2mol/LNaCl溶液的滤液
• 目的是使DNA充分溶解在2mol/LNaCl溶液中
• 第三次搅拌加蒸馏水至0.14mol/LNaCl溶液
• 稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物
• 第四次搅拌放入2mol/LNaCl溶液中纱布上的粘稠物
2.用冷酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的95%的酒精必须经过预冷后才 能使用
3.在用玻璃棒搅拌时，玻璃棒不能直接插烧杯底部，并且搅拌要轻 缓，以便获得较完整的DNA分子
4.由于玻璃表面带电荷，DNA中的磷酸基业带电荷而被吸附于玻璃 表面，故实验中用塑料杯和试管可减少损失
实验现象不明显的原因分析
1.材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够
注意：在析出DNA的黏稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至 溶液中黏稠物不再增加
思考：加蒸馏水的目的是？ 调节NaCl溶液物质的量为接近0．14mol/L，使DNA黏 稠物最大限度的析出 思考：这一步搅拌的目的是？（轻轻地沿一个方向不停地均与搅拌） 稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物
思考：这一步过滤含DNA黏稠物的0．14mol/L的 NaCl溶液，获得什么？ 获得DNA黏稠物（ 纱布上的DNA黏稠物） 思考：过滤的目的？
一、基础知识
（一）提取DNA的方法
1.提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法，分离具有 不同物理或化学性质的生物大分子
2.提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在 物理和化学性质方面的差异，提取DNA， 去除其他成分。
3.DNA等大分子的理化性质 ⑴ DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成 分在不同浓度的NaCl溶 液中溶解度不同
溶解丝状物的溶液变为蓝色
三、操作提示
1 、以血液为实验材料时，每100ml血 液中需要加入 3g 柠檬酸钠，防止血液 凝固。 2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和， 否则容易产生大量的泡沫，不利于后 续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅 拌时，动作要轻缓，以免加剧 DNA 分 子的断裂，导致 DNA 分子不能形成絮 状沉淀。 3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影 响鉴定的效果。
思考：加入蒸馏水的目的是什么？ 加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA
思考题：搅拌的目的（注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛， 防止打碎DNA ）
加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA 思考：这个步骤过滤获得什么？ 获得含核物质的滤液（获取含DNA的滤液）（注意：此时释放 出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用3——4 层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质） 思考：滤液中可能含有哪些细胞成分？ 可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质（为了纯化提取的DNA需要 将滤液作进一步处理）
• 使DNA黏稠物充分溶解在2mol/LNaCl溶液中
• 第五次搅拌体积分数为95%的酒精
卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA
本实验两次用蒸馏水
第一次：加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从
而释放出DNA
第二次：调节NaCl溶液物质的量为0．14mol/L，使 DNA黏稠物最大限度的析出
二、实验设计
（一）实验材料的选取 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 （三）除去滤液中的杂质(纯化) （四） DNA的析出与鉴定
（一）实验材料的选取 从下列材料中选取2～3种
菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌Βιβλιοθήκη Baidu、菠菜； 鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；
在液体培养基中培养的大肠杆菌
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑 原则：