烟草组培苗实验步骤
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烟草叶片的组织培养
一、实验原理与实验步骤
在植物组织培养中,主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生,使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞,通过脱分化形成愈伤组织,并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织,大致要经历三个时期:起动期、分裂期和形成期。
植物材料:烟草植株
药品:(2,4-D、NAA、6-BA浓度均可)、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞
仪器:玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0)、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子
二、实验方法与步骤
注意:
1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取,分别将各种化合物称量后,除CaCl2·2H2O单独配制外,其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解,用玻璃棒搅拌促溶,倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,置小口瓶中保存,贴上标签注明化合物名称(或编号),浓缩倍数,配制日期和配制者姓名,CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。
2、微量元素母液的配制
按要求浓缩100倍的数值称取,分别将各种化合物称量除铁盐(FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O)作为一组单独配制外,其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后,定容在1000ml容量瓶中,置小口瓶中保存,贴上标签
3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中,加热,(很重要)不断搅拌,溶解后,两液混合,调PH至5.5加水定容至1000ml,置于小口瓶中,贴上标签。
4、有机物母液配制,按母液要求浓缩50倍,除蔗糖按3%单独临时称量外,其余分别称量后,溶解,定容在500ml容量瓶中,置于小口瓶中保存,贴上标签。5.母液最好在2~4℃的冰箱中贮存,特别是有机类物质,贮存时间不宜过长,无机盐母液最好在一个月内用完,如发现有霉菌和沉淀产生,就不能再使用。(1)制备母液和营养培养基时,所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求,化学药品必须是高纯度的(分析纯)。
(2)称量药物采用高灵敏度的天平,每种药品专用一药匙。
生长调节剂母液配制:
为了操作方便,节约时间,生长调节剂也可如同配制母液一样,先配成原液,这样配制培养基时只要稍加计算,按需要量取即可。
不同药品在配制时若不溶于水,可用少量不同的溶剂先溶解,萘乙酸(NAA),吲哚乙酸(IAA),赤霉素(GA3),2,4-D等生长素和玉米素(ZT)可先用少量95%酒精溶解,然后加水,如溶解不完全再加热。激动素(KT)和6-苄基嘌呤(BA)可溶于少量1mol/L的盐酸中,叶酸需用少量稀氨水溶解。
称取50mg生长调节物质,溶解后,在100ml的容量瓶中定容,配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg,配制后一般要求在低温(0~4℃)保存,配制培养基时如每升(1000ml)需添加的生长调节剂物质为0.5mg时,则取1ml母液即可。
三、培养基配制和灭菌
本次实验使用
(1)愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA1.0mg/L;(2)幼芽增殖培养基:MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L;
(3)生根培养基:MS+NAA0.2mg/L。
注意事项:上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后,加入相应激素所得,MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述
上述培养基均附加3%蔗糖,0.8%琼脂,pH5.8,培养温度25±2℃,光照强2000lx。母液吸取量的计算
配制培养基的升数
公式1:母液吸取量=母液体积(CC)×(配制培养基的升数/母液浓缩倍数)
公式2:母液吸取量=(培养基要求的含量/ 母液每CC的含量)(各种生长调节剂)
各种母液按顺序编号排列
A.大量元素;
B.CaCl2.2H2O;
C.微量元素;
D.铁盐;
E.有机物;
F.生长素萘乙酸(NAA):配制0.5mg/ml的NAA称取50mg,NAA用少量95%酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml;G..细胞分裂素、激动素(KT)配制0.5mg/ml的KT称50mgKT 用少量1N HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。
配制培养基(1000ml)
1.琼脂:称取5~7g琼脂,加入300ml蒸馏水,加热溶解直至完全溶解为止.
2.蔗糖3%用质量较好的白糖代替,称取30g白糖,溶于溶有琼脂的300ml蒸馏水
中。
3、各种母液的吸取(培养基1L)
(1)用50ml量筒量取大量元素母液(A)和CaCl2·2H2O母液(B)各100ml (2)分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素(C),铁盐(D)母液各10ml (3)用10ml移液管或吸管吸取有机物(H)10ml
(4)移取激素
将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中,混合均匀后,加热至80℃左右,用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求 5.8~6.0,过酸过碱则用1N NaoH和1N HCL调整。
分装:用一个接有胶管的分装器趁热装培养基,1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中,每个三角瓶约30ml左右(一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右)注:培养基勿碰瓶壁。
包装:分装好的三角瓶用封口膜包扎好,标明培养基代号即可进行灭菌。
用具清理和洗涤:各种母液按原位置摆整齐,用过的量筒,移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净,然后按次序放回原处。
四、培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌(高压蒸汽灭菌锅的使用方法)
具体操作步骤:
1.高压锅放水至平把架;
2.把包扎好的培养基装入高压锅;
3.盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀.
4.然后接通电源.
5.压力计升至0.05MPa时,打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)。
6.排除冷空气后,关闭放气阀,待压力升到0.11MPa位置时,开始计算灭菌时间,具体方法:当压力锅指针升至0.12MPa时,关闭电源,待指针下降至0.11MPa 时接通电源,不断重复此操作过程,维持20分钟。
7.灭菌时间达到20分钟后,除去电源,打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅