二苯胺显色法测定DNA含量
DNA 的定量测定
实验六DNA 的定量测定（二苯胺法）一实验目的学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。
二实验原理强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。
其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。
DNA(脱氧戊糖基）H+HO CH2C CH2CH2蓝色化合物DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。
在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。
当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。
三试剂和器材（一）器材1．粗制DNA。
2．坐标纸。
3．试管1.5 cm *15 cm （*7）4．吸管0.20 ml (﹡2) 、0.50ml(*3) 、1.0ml(*2)。
5．722 型（或7220 型）分光光度计。
6．恒温水浴锅。
（一）试剂1．DNA 标准液（200μg/ml）: 取DNA钠盐用5 mmol/L的NaOH配成200μg/ml 的溶液。
2．二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯, 需在70% 乙醇中重结晶2次）1克溶于100 ml 分析纯的冰醋酸中，再加入10ml 过氯酸（A.R., 60% 以上），混匀待用。
当所用药品纯净时，配成试剂应为无色，临用前加入1ml1.6% 乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱中，一周内可使用），贮于棕色瓶。
3．DNA样液：将实验所得的DNA粗品用蒸馏水溶解，定溶至50 ml，控制其DNA含量在100μg/ml左右。
四操作方法1．标准曲线的绘制按表1 加入各种试剂，混匀，于60 ℃恒温水浴保温45 min，冷却后，在595 nm波长下，于722型分光光度计比色测定，以吸光度对DNA浓度作图，制定标准曲线。
2．样品的测定吸取DNA样液1.0 ml，加入蒸馏水1.0 ml，混匀。
生化实验报告--DNA定量测定(二苯胺法)
DNA的定量测定-二苯胺法一、实验目的1.学习和掌握用浓盐法从动物肝脏中提取DNA的原理和方法；2.学习和掌握用二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。
二、实验原理1．DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。
2．在DNA浓度为20-200μg/ml的范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。
三、实验仪器试管移液管7220分光光度计四、实验试剂1、DNA标准液（200ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。
2、二苯胺试剂：A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。
贮于棕色瓶中。
B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可五、实验验步骤1.标准曲线的绘制加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。
2.样品测定吸取DNA样液1.0ml，加入蒸馏水1.0ml，混匀。
然后加入二苯胺溶液4.0ml, 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。
根据实验数据制得标准曲线如下：由上表可知样液的吸光度y=0.115，则由标准曲线得出DNA样液的浓度x=18.49μg/ml。
故样品中DNA的质量=18.49×6÷1.0=110.94μg七、实验分析1. 测定DNA含量的方法还有哪些原理?荧光法，用Pico Green荧光染料，测定DNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。
2. 实验中加入乙醛的目的?甲醛引起DNA的断裂损伤,DNA在酸性条件下加热，在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度.。
DNA的提取及含量测定实验
[实验目的及要求]
1.学习和掌握用浓盐法从动物肝脏中提取DNA 的原理和方法； 2.学习和掌握用二苯胺法测定DNA含量的原理 和方法。
[实验原理]
Hale Waihona Puke 1．DAN的提取 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存 在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及细胞质中。动植物的 DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液，但在0.14mol/l的盐溶液 中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/l盐溶液，可利用不 同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中 分别抽提出来。 2 DAN的含量测定 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊 醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。在 DNA浓度为20-200μg/ml的范围内，吸光度与DNA浓度成正比， 可用比色法测定。
5 2.0
蒸馏水 /ml 二苯胺试 剂/ml
A595nm
2.0 4.0
1.6 4.0
1.2 4.0
0.8 4.0
0.4 4.0
0 4.0
样品的测定 吸取样品1.0mL，加入蒸馏水1.0ml，混匀。 然后准确加入二苯胺试剂4.0ml，混匀，于 60℃恒温水浴保温45min，冷却后，选595nm 波长，于722型分光光度计上比色测定，根据 测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。
[实验仪器及用品]
实验器材：猪肝、722型分光光度计、匀浆器、 离心机、恒温水浴锅。 实验试剂：0.1mol/l NaCL-0.05mol/l柠檬酸钠 溶液、0.015mol/L NaCL-0.0015mol/L柠檬酸 三钠溶液、95%乙醇、NaCl固体、5%SDS、 氯仿、DNA标准液、二苯胺试剂。
二苯胺的使用
⼆苯胺的使⽤DNA的鉴定 本实验中鉴定DNA的⽅法为⼆苯胺法(配⽅见下述的“药品配制”)。
⼆苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸⽣成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和⼆苯胺作⽤⽽显现蓝⾊(溶液呈浅蓝⾊)。
鉴定时溶液蓝⾊的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。
⼆苯胺试剂的配制A液： 15 g⼆苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,⽤棕⾊瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使⽤。
B液： ⼄醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制： 将0.1 mL B液加⼊到10 mL A液中,现配现⽤。
DNA粗提取与鉴定的另⼀种⽅法1.材料⽤具新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)。
塑料烧杯,量筒,玻璃棒,尼龙纱布,陶瓷研钵,试管,试管架,试管夹,漏⽃,酒精灯,⽯棉⽹,三⾓架,⽕柴,⼑⽚,天平。
研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,⼆苯胺试剂,蒸馏⽔。
2.⽅法步骤(1)DNA的粗提取 ①准备材料 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放⼊冰箱冷冻室,⾄少24 h。
②取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。
③研磨 将碎菜花放⼊研钵中,倒⼊10 mL研磨液,充分研磨10 min 。
④过滤 在漏⽃中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤⼊烧杯中(有条件的学校可将滤液倒⼊塑料离⼼管中进⾏离⼼,⽤1000r/min的旋转频率,离⼼25 min,取上清液放⼊烧杯中)。
在4 ℃冰箱中放置⼏分后,再取上清液。
⑤加冷酒精 将⼀倍体积的上清液倒⼊两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并⽤玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。
沉淀35 min后,可见⽩⾊的DNA絮状物出现。
⽤玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。
(2)DNA的鉴定 ①配制⼆苯胺试剂 取0.1 mL B液,滴⼊到10 mL A液中,混匀。
②鉴定 取4 mL DNA提取液放⼊试管中,加⼊4 mL ⼆苯胺试剂,混匀后观察溶液颜⾊(不变蓝)。
⽤沸⽔浴(100 ℃)加热10 min 。
5-二苯胺显色法测定DNA含量ppt
实验操作
以0.01N NaOH 为空白管，在260nm和280nm波长处测定样品液的吸光度，求出样 品液的A260/A280比值和DNA浓度。
核酸紫外吸收光谱的测定
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在 260nm波长处。吸收紫外光的性质 是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质， 不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。 蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm波长 处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对 核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与 280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。 A260/A280 ≈1.8 > 1.8 < 1.8 表示DNA纯 RNA含量高 蛋白含量高
一般性实验-5
二苯胺显色法测定DNA含量
Hale Waihona Puke 实验原理 DNA的α-脱氧核糖在酸性条件下转变成ω-羟基-r酮基戊醛，与二苯胺共热后 形成蓝色化合物，该化合物在595nm处最大吸收。 每ml含20－400µg范围内光密度与DNA的浓度成正比。反应液中加入少量乙 醛，可提高反应的灵敏度。
DNA
H＋
二苯胺 HO－CH2－C－CH2－CH2－CHO ＝ O 蓝色化合物
岛津UV-120分光光度计
双波长分光光度计，该种机采用两个光源，可在可见光和紫外区对物质进行 分析，钨丝灯发出光的适宜范围在360－1000nm，氘灯发出光的适宜范围在 150－400nm。 通过两种光源的切换，可以在两种波长范围内使用。 使用石英杯作为比色杯。
二苯胺试剂鉴定DNA
二苯胺试剂：鉴定DNA。
二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中，再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化，再使用。
B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制:将0。
1 mL B液加入到10 mL A液中，现配现用。
DNA的粗提取与鉴定实验原理1。
DNA在NaCl溶液中的溶解度,是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为0。
14 mol／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理,可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2。
DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液.利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA遇二苯胺(沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
注意事项1。
步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入.2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具鸡血细胞液（5～10 mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1 g／mL 的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol／L和0．015 mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个，50 mL，500 mL，各2个），漏斗，试管(20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒(100 mL，1个），纱布，镊子,滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
实验原理：1。
析出溶解在NaC1溶液中的DNA.2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。
3。
DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色.方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。
5 min2．溶解DNA:3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢4．过滤：取黏稠物5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢.3 min6．过滤：取滤液。
7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。
二苯胺试剂鉴定DNA
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载二苯胺试剂鉴定DNA地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容二苯胺试剂:鉴定DNA。
二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。
B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制:将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。
DNA的粗提取与鉴定实验原理1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。
利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。
注意事项1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。
2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具鸡血细胞液（5～10 mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1 g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol／L和0．015 mol ／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个， 50 mL， 500 mL，各2个），漏斗，试管（20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100 mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
实验原理：1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。
二苯胺试剂鉴定DNA的原理
二苯胺试剂鉴定DNA的原理二苯胺试剂鉴定DNA的原理一、定义二苯胺试剂（Diels-Alder Reagent）是一种有机化学试剂，用于识别DNA特定序列的定向性反应，也称为定向碱基异构酶（DBA）试剂。
该反应原理的应用有助于鉴定DNAsites的结构以及多段和复合份额的识别。
二、原理二苯胺试剂的反应受特定的DNA序列控制。
当两个特定的DNA序列（A和B）结合在一起时，二苯胺试剂不会发生反应。
当两个相邻的DNA同源片段（测序DNA被称为probe DNA）与目标DNA结合时，二苯胺试剂将发生化学反应，从而形成定向碱基异构化反应（DBAR）。
当两个DNA同源片段（A和B）以相反的方向连接在一起并且probe DNA与target连接在一起时，将发生相反的DBAR反应，从而允许研究人员确定多段复合份额结构和激活片段的位置。
三、步骤1. 准备试剂：用于鉴定DNA序列的二苯胺试剂主要包括：四氢三唑，苯胺试剂，deoxyuridine triphosphate（dUTP），十六烷基三甲基溴化氢，二硫代乙酸盐，硫酸铵，三氟异丙醇，氯化钠和氯仿。
2. 生物实验：首先，把一定量的DNA与二苯胺试剂，孵育物质以及制剂混合物一起混合搅拌，使其充分接触。
所得的混合物应放在微孔板的特定位置，经过30分钟的反应，可完成DNA的定向碱基异构化反应。
3. 检测结果：在用正片胶将实验测试物涂覆之后，用UV波长或紫外可见对应射线下照射，发现接受了二苯胺化学反应和定向碱基异构化反应的物质和连接物会吸收紫外线，通过经典的水滴检测法即可看到反应得到的结果。
四、应用二苯胺试剂技术可以用于鉴定DNA特定序列的结构，可以识别多复制份额DNA结构，可以用于对染色体进行谱系定向标记，可以用于精确的基因组生物学和染色体学研究。
二苯胺试剂鉴定DNA
二苯胺试剂鉴定DNA二苯胺试剂鉴定D N A Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】二苯胺试剂:鉴定DNA。
二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。
B液:乙醛的体积分数为%的溶液。
配制:将 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。
DNA的粗提取与鉴定实验原理1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为mol／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。
利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。
注意事项1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。
2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具鸡血细胞液（5～10 mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol／L 和0．015 mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个，50 mL， 500 mL，各2个），漏斗，试管（20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100 mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
实验原理：1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。
2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。
在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。
方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。
5 min2．溶解DNA：3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢4．过滤：取黏稠物5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。
真核生物基因组DNA的提取和含量测定
实验报告课程名称： 生物化学实验 实验名称： 真核生物基因组DNA 的提取和含量测定 指导老师： 同组学生姓名： 廖杰 成绩：__________________真核生物基因组DNA 的提取和含量测定【实验原理】 制备具有生物活性的大分子核酸，必需采取温和的制备条件，避免过酸、过碱的反应环境和剧烈的搅拌，防止核酸酶的作用，并要求在低温下进行操作 。
一、 真核生物基因组DNA 的提取本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法破碎组织细胞。
DNP 在L NaCl 中不溶解,而RNP 可溶解。
用无菌水溶解沉淀，加入蛋白酶消化液（含有蛋白酶K 和SDS ）。
１温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA 的完整性， ２可以变性Dnase ，３还可以去除部分的蛋白。
４使核蛋白体从DNA 上解离。
然后加RNase 以去除RNA ，再用苯酚:氯仿抽提法反复抽提提取DNA 苯酚:氯仿抽提法：酚、氯仿是有机溶剂，能有效地使蛋白质变性。
纯酚在与水混合时处于下层。
然而有机相和水相会难于分开。
专业： 药学 姓名： 阿卜杜合力力 学号： 56 日期： 地点： 生化实验室 装订 线若使用酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重较大，可在很大程度上解决这个问题，促进两相的分离。
异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。
变性蛋白一般集中在两相之间的界面层，而脂类则有效地分配在有机相中，核酸则被留于上层水相。
该法其具有操作条件比较温和，能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性，可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。
但其操作步骤较为繁琐，去除蛋白质需要反复进行多次。
砷盐、氟化物、柠檬酸、EDTA等可抑制DNase的活性；皂土等可抑制RNase 的活性。
收集上清液后用乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液溶解DNA，并用紫外吸收法测定DNA的含量及纯度。
二、紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度1．紫外分光光度法测定核酸含量：由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，吸光度A值为1相当于大约50μg /ml双链DNA。
二苯胺法测定DNA含量
实验12 二苯胺法测定DNA 含量一、目的学习和掌握测定DNA 的定糖法（二苯胺法）的原理和操作技术。
二、原理脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm 处有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范围内，光密度与DNA 的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。
除DNA 外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。
HO CH 2C — CH 2 CHO 蓝色化合物 酸性条件 二苯胺 Oω—羟基—γ酮基戊醛三、材料、试剂和器具 （一）试剂1、DNA 标准溶液：取小牛胸腺DNA 用0.1N 氢氧化钠溶液配制成200微克/毫升的溶液。
2、DNA 样品液：（自己提取）控制其DNA 含量在50~100微克/毫升左右。
3、二苯胺试剂：称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸2.75毫升，混匀备用。
临用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。
（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1，2，5毫升）3、恒温水浴4、可见光分光光度计四、操作步骤（一）DNA 标准曲线的制作==加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D 595nm 值。
）以光密度为纵坐标，DNA 含量（ug/ml ）为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定取2支试管，各加0.2~0.5毫升的待测液（内含DNA 应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。
根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA 的含量，按下式计算出样品中DNA 的百分含量。
DNA 含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数10010)(/(%)6⨯⨯⨯=g DNA 新鲜鲜肝总体积毫升含量产率五、注意事项1、二茉胺法测定DNA 含量灵敏度不高，待测样品中DNA 含量低于50mg/L 即难以测定。
脱氧核糖核酸定量测定--改良二苯胺法
脱氧核糖核酸定量测定——改良二苯胺法一、目的学习用定糖法测定脱氧核糖核酸(DNA)的含量。
二、原理在强酸环境下加热，可以使DNA 中嘌呤碱与脱氧核间的糖苷键断裂。
因而DNA 酸解后生成嘌呤碱基、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸。
脱氧核糖在酸性条件下脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺作用后显示蓝色，在595毫微米有最大吸收。
用二苯胺法测定DNA 含量时灵敏度不高，待测样品中DNA 含量若低于50微克/毫升就难以测定。
如用乙醛增加二苯胺法测DNA 的发色量，并用乙酸戊酯把反应中形成的蓝色产物抽提到有机溶剂相内，如此进行测定灵敏度显著提高。
按此改良二苯胺法，待测样品中DNA 含量在10~150微克/毫升范围内，光密度与DNA 量成正比关系。
样品中含少量RNA不影响测定，而蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛亦能与二苯胺形成各种有色物质，故干扰测定。
三、实验材料，仪器和试剂1、实验材料DNA标准溶液：于分析天平上精确称取纯的鱼精DNA，并以水配成100微克/毫升的溶液(DNA 在水内较难溶，可隔夜配制)。
待测DNA：以水配成约50微克/毫升的溶液。
2、仪器移液管、72型分光光度计、电热恒温水浴箱、温度计3.试剂4%二苯胺冰醋酸溶液：20克二苯胺(分析纯)加少量冰醋酸(分析纯)微热至全部溶解后，再以冰醋酸定容到500毫升，只限当天使用。
0.16%乙醛水溶液:取40%乙醛0.4毫升,加水至100毫升。
20%过氯酸:71.4毫升70%过氯酸(HClO₄,分析纯)加水至250毫升。
乙酸戊酯(化学纯)或乙酸异戊酯(化学纯)。
四、操作步骤1、标准曲线制作按下表在各管内分别加入不同量的100微克/毫升DNA标准溶液，然后每管加水使体积均达2毫升。
向各管加入2毫升20%过氯酸与4毫升4%二苯胺冰醋酸溶液，混匀后再加0.2毫升0.16%乙醛水溶液并充分摇匀。
56₄保温一小时后，流动水冷却，并向各管反应混合液内加2毫升乙酸戊酯，试管加塞，剧烈振摇，使反应生成蓝色物质充分地被抽提到乙酸戊酯相内。
生化实验 肝组织中DNA含量的测定新
肝组织中DNA含量的测定
【目的要求】
1.熟悉DNA含量测定的原理
2.了解二苯胺测定脱氧核糖的原理和方法
【原理】
DNA中的脱氧核糖以二苯胺法测定之。
脱氧核糖在酸性条件下脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺反应生成蓝色的物质，在595nm处有最大吸收。
当待测样品中DNA含量在10~150mg/ml范围内时，O.D值与DNA浓度成正比。
用分光光度计测得反应液O.D值，即光密度（特定波长下的吸光度）从而可知样品中RNA的含量。
反应式如下：
【仪器与试剂】
仪器：
751分光光度计，721分光光度计，恒温水浴箱。
试剂：
5%HClO4 、20%HClO4、4%二苯胺冰醋酸溶液、DNA标准液（100μg/ml）
【实验步骤】
1.取实验一含DNA的溶液直接作为待测样品液，无需稀释。
2.按表操作（请严格按照表格确定试剂添加顺序）
3.待各管冷却后，以空白管调零点，以595nm比色，读取光密度（O.D）值。
重
复测量3-5组数据，取平均值。
4.计算每克肝组织中DNA的含量,单位为微克/每克肝组织。
【思考题】
如何根据数据计算出DNA的含量，请写出公式，解释意义并将其含量计算出来。
dna浓度测定原理
dna浓度测定原理
DNA浓度测定的原理主要有两种：紫外分光光度法和脱氧核糖核酸-二苯胺法。
1. 紫外分光光度法：由于核酸分子（DNA或RNA）含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比。
因此，通过测定不同波长的紫外线吸收值，可以计算出核酸样品的浓度。
此外，通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值
（A260/A280），还可以估计核酸的纯度。
纯的DNA制品的比值为，RNA的比值为。
若比值高于，则可能有RNA污染，低于则有蛋白质污染。
对于很稀的核酸溶液，可用荧光光度法进行测定。
在荧光染料溴化乙锭(EB)插入DNA的碱基对平面之间并与之结合后，DNA样品能在紫外光的激发下产生桔红色荧光。
荧光强度与被结合的EB的量成正比，而被结合的EB 的量又与核酸分子长度和含量成正比。
2. 脱氧核糖核酸-二苯胺法：在酸性环境中，脱氧核糖与二苯胺试剂一起加热会产生蓝色化合物。
生成的蓝色化合物在595nm处有最大吸收值。
此方法测定的是样品中的总磷量，若样品中含有无机磷杂质，需通过对照组扣除无机磷含量。
该方法灵敏度相对较高，但易受蛋白质和核苷酸影响。
这两种方法各有特点，可以根据具体情况选择适合的方法进行DNA浓度测定。
DNA的定量测定
二苯胺法的原理
强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间 的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。 其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛， 此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。 DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。
六、思考题
1、 DNA含量测定的方法有哪些？ 各有何优缺点？
2、简述二苯胺法测DNA的基本原 理。
分光光度计
开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波 长调至测试用波长。仪器预热20分钟。 预热后，打开试样室盖（光门自动关闭），调 节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”，盖上试样 室盖，将盛有参比溶液的比色皿架置与校正位 置，使光电管受光，调节透过率“100%”旋钮， 使数字显示为“100.0”。连续几次调整“0”和 “100%”，仪器即可进行测定工作。 将选择开关置于“A”，调节吸光度调零旋钮， 使得数字显示为“.000”，然后将被测样品移入 光路，显示值即为被测样品的吸光度值。
DNA含量＝
待测样品中测得的DNA的mg数 待测样品液中样品的g数
X 100
注意事项
糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都对实验有干扰，测定前应 尽可能除去。 取样准确 选定一台分光光度计后，所有测定工作都在同一台上完成，以避 免不同仪器间的系统误差 二苯胺不容于水，取用和盛放二苯胺溶液的器皿应干燥，和DNA溶 液反应时迅速混合
DNA +
NH
100℃
冰醋酸，少量硫酸
蓝色复合物
试剂和器材
试剂
1mg/mL DNA标准溶液、二苯胺试剂
器材
可见分光光度计、恒温水浴锅、分析 天平
实验过程
标准曲线的制作
二苯胺法测定dna含量[精华]
![二苯胺法测定dna含量[精华]](https://img.taocdn.com/s3/m/8f93a43dcec789eb172ded630b1c59eef8c79afb.png)
实验12 二苯胺法测定DNA 含量一、目的学习和掌握测定DNA 的定糖法（二苯胺法）的原理和操作技术。
二、原理脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm 处有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范围内，光密度与DNA 的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。
除DNA 外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。
HO CH 2C — CH 2 CHO 蓝色化合物酸性条件 二苯胺Oω—羟基—γ酮基戊醛三、材料、试剂和器具（一）试剂1、DNA 标准溶液：取小牛胸腺DNA 用0.1N 氢氧化钠溶液配制成200微克/毫升的溶液。
2、DNA 样品液：（自己提取）控制其DNA 含量在50~100微克/毫升左右。
3、二苯胺试剂：称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸2.75毫升，混匀备用。
临用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。
（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1，2，5毫升）3、恒温水浴4、可见光分光光度计四、操作步骤（一）DNA 标准曲线的制作取8支试管，编号，按下表加入试剂 ==加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D 595nm 值。
）以光密度为纵坐标，DNA 含量（ug/m l ）为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定取2支试管，各加0.2~0.5毫升的待测液（内含DNA 应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。
根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA 的含量，按下式计算出样品中DNA 的百分含量。
DNA 含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数10010)(/(%)6⨯⨯⨯=g DNA 新鲜鲜肝总体积毫升含量产率五、注意事项1、二茉胺法测定DNA 含量灵敏度不高，待测样品中DNA 含量低于50mg/L 即难以测定。
DNA的定量测定(二苯胺法)实验报告
DNA的定量测定（二苯胺法）实验报告一、实验目的掌握用二苯胺法定量测定DNA含量的基本原理和方法。
二、实验原理➢在酸性环境中加热，DNA被水解为嘌呤，脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸。
其中脱氧核糖在酸性条件下，脱水生成ω－羟基－y－酮基戊糖，后者与二苯胺作用呈现蓝色，在595nm处有最大光吸收。
当样品DVA的含量在40－400µg范围时，光密度与DNA的浓度成正比。
➢样品中含有少量RNA不影响测定结果，但是蛋白质，脱氧核糖，阿拉伯糖和芳香醛等能与二苯胺形成各种各样有色物质，干扰结果。
在反应中加入少量乙醛，可以提高反反应灵敏度。
三、试剂与仪器DNA标准液，二苯胺试剂，样品溶液试管与试管架，吸管与洗耳球，可见分光光度计四、DNA标准液曲线的制作与样品DNA含量的测定1.取8支洁净干燥的试管，按下表操作：五、实验结果与讨论由图可知，标准曲线为y=0.0098x，则求出的X1=40.71µg/ml,X2=39.39µg/ml平均DNA浓度为40.05µg/ml，含量n%=40.05/100%=40.05%分析：由实验的标准曲线求得的DNA浓度40.05µg/ml，在40－400µg范围内，光密度与DNA 的浓度成正比，用标准曲线求得的浓度为准确值，另外，由DNA的标准曲线的线性关系R2 = 0.9966，证明DNA光密度的关系密切，则求出的浓度也就比比较精确。
但本实验测得的DNA 含量比整体水平偏低，造成的原因可能是：①在吸取DNA溶液样品时，未充分摇匀，便吸取2.0mlDNA样液，造成DNA含量不均，造成实验存在误差，另外，在加完试剂后，未摇后便至于60度水浴保温，造成二苯胺与DNA的脱水物结合不充分，造成吸光值的偏低，从而造成后续的计算，样品DNA浓度偏低。
②进行分光光度测量时，可能由于比色皿未充分洗涤，有少量自来水的残留，相当于稀释了样品ＤＮＡ浓度，使测得ＤＮＡ吸光值偏低。
实验十三 DNA含量的测定
DNA标准曲线的制作和样品测定
管号
试剂
0 对照
1
2
3
4
5 样品1 样品2
DNA标准溶液ml 0.0 0.4 0.8 1.2 1.62.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0
0
0
二苯胺试剂ml
4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
4.0
OD595
按上表加完各试剂后，充分混匀。于60℃水浴中保温1h，冷却后于 595nm波长处以0管为空白调零，测定各管光密度（OD595nm）。以 DNA的含量为横坐标，光密度（吸收值）为纵坐标，绘制标准曲线。
注： 待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。 样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液。
实验方法
• A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀 释倍数，使A260值 在2.0左右（DNA此时的浓度约 为 100ug/ml 。 由 于 二 苯 胺 法 的 测 定 范 围 是 40-400ug/ml DNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结果）
• A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA 为2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样 品中混有蛋白质，则比值小于1.8。
• 定磷法（核酸的磷酸部分）
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷 键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱 氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，与 二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。 DNA在40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在 反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
离心机的使用
打开电源开关； 平衡放置离心管；盖上盖子。 调节时间旋钮至10min； 缓慢调节速度旋钮至9档，每5-10s上升1档； 离心完毕后机器自动停止，待完全停止后，打开盖子取出离心管。 离心管必须平衡后，才能启动离心机； 离心机的盖子必须盖紧；
离心过程中不要用重物撞击离心机；
兔肝脱氧核糖核酸（DNA）的提取和测定
实验目的 学习从动物组织中提取DNA及其含量、纯度测定的原 理和方法 掌握离心机的使用方法
实验原理
在0.15M的氯化钠溶液中脱氧核糖核蛋白的溶解度最低。 用0.15M氯化钠溶液洗涤可洗去其它物质。 沉淀用SDS处理，SDS使蛋白质与DNA解离，再用氯仿 －异丙醇抽提，将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解。 DNA溶液用乙醇沉淀析出。
加入15% SDS时要慢，边搅边滴加（两人配合）。
SDS的温度不能太低，易凝固。吸过SDS的吸管要及时清洗。
加入CHCl3/IAA液离心后，分为三层，由上到下为：无机相-蛋白
相-有机相。DNA溶解在无机相中，吸取无机相时动作要轻，不要
吸到蛋白相。
CHCl3/IAA会溶解有机玻璃，用完后不能竖直放置在试管架上，必
加 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA至4ml 轻搅 10min 加塞反复 倒置抽提 10min 重复 一次
DNA析出
逐滴加入0.5ml 15% SDS
用玻棒挑出
搅拌10min
去塞！离心
挑取DNA至一离 心管(小烧杯)用10ml 0.01N NaOH溶解
加1ml 5M NaCl
吸取上清液 勿吸到中间层！
要等离心机完全停止转动后再打开盖子。
二苯胺显色法测定DNA含量
实验原理
DNA的α-脱氧核糖在酸性条件下转变成ω-羟基-r酮基戊
醛，与二苯胺共热后形成蓝色化合物，该化合物在 595nm处最大吸收。每ml含20－400µ g范围内光密度与 DNA的浓度成正比。用标准曲线法测定DNA含量。 用生物分光光度计（用紫外光度法）分析DNA含量与 纯度
注意事项
尽可能避免DNA的断裂 1. 匀浆时应保持低温，且匀浆时间应短； 2. 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管口应粗短并成钝口。 保持DNA活性，避免酸碱或其他变性因素使DNA变性。 搅动不要太大，以免使DNA断裂。 整个实验过程应在低温条件下进行。 搅拌时动作要轻，反复倒置抽提，不可激烈振荡。
实验操作
1. 弃上清留沉淀
兔肝
离心
1X SSC洗 两次
加至8ml 1X SSC
3.弃上清留沉淀 （脱氧核糖核蛋白）
称取4 g 加 8ml பைடு நூலகம்X SSC
离心
匀浆、过滤
2.弃上清留沉淀
取8ml匀浆液 离心
加至 8ml 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA
沉淀
等体积氯仿-异 丙醇混合液
加约2倍 体积 95% 乙醇
相当于该光密度值DNA的含量。
核酸紫外吸收的测定
核酸在220-320nm处呈特征性吸收，在260nm处有最 大吸收，测A260/A280可得知核酸的大致纯度。 A260/A280 ≈1.8 > 1.8 < 1.8 表示DNA纯 RNA含量高 蛋白含量高
实验操作
以0.01N NaOH 为空白管，调零，按“blank”。样品池中加 入样品，按“sample”，记录样品液的A260/A280比值和DNA浓度。
实验操作
取8支试管，按实验指导的表格加入试剂。 加毕置沸水浴10分钟，取出冷却；以0号管（空白管）调零点，于 595nm波长比色。 以光密度为纵坐标，DNA含量（µ g/ml）为横坐标，绘制标准曲线. 将实验中所得到的兔肝DNA溶液作为待测样品，取两只试管，分别标 “U”和“B”，按表加入试剂。 混匀，置沸水中10min, 取出冷却。 在595nm处，以B管调零，测得待测液的光密度值，从标准曲线上查出