免疫组化结果判断及常见问题的分析
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2.染色的不均一性 阳性细胞的染色分布不均，片状或点状散在分布 染色强弱不等，颜色深浅反映抗原量的多少
3.排除人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。
4.颗粒性显色 DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。
精选
5
免疫组化标准化照片
CK10 ER CD44v6
精选
6wenku.baidu.com
精选
7
精选
8
精选
9
精选
10
精选
11
合格的免疫组化染色切片 是正确判断染色结果的基础和前提
不合格的免疫组化染色切片 容易导致误判
精选
12
C-erbB-2
优
中
良
精选
差
13
ER
4
2
3
精选
1
14
PR
子宫内膜PR染色，修复不足
子宫内膜PR染色，修复良好
精选
15
二、染色结果的判断
编号 1 2 3 4 5
精选
24
3、图象处理系统功能
几何形态学定量分析 细胞核、浆的大小、面积、核浆比； 细胞分布密度、个数； 血管、 腺体的面积、密度；间质的面积 免疫组织化学分析 按着色灰度分类，计算阳性、阴性细胞的面积含量 DNA倍体分析 计算正常细胞及肿瘤细胞DNA 含量，给出倍体参数、DNA参数分布 直方图 AgNOR分析 颗粒分析：数目、大小、面积、比例
染色过弱原因
抗体浓度过低，孵育时间过短 滴加试剂时缓冲液未沥干 过度蛋白封闭 抗原被破坏
室温太低，<15℃
对策
提高浓度，延长时间
滴加试剂前沥干多余水分
缩短封闭时间
新鲜组织及时固定，固定 时间不要超过24小时 适当延长孵育时间
精选
47
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
精选
CD34
21
K-ras
精选
VEGF
22
附：定量分析——图象处理系统
1、图象处理：
利用仪器按照不同的目的进行图象的修正、变 换、特征提取和测量。 1）“狭义”指消除图象的模糊不清部分，校正 畸变。 2）“广义”包括对图象的结构分析，提取特征 进行测量。
精选
23
2、图象处理系统组成
图象输入（显微镜、扫描仪） 图象处理运算（病理图文分析软件） 图象、数据输出
对策
改善条件，重取材 确定抗体种属无误 不得使用过期的试剂盒 更换适配的显色系统 严格遵守操作规程
精选
45
无色或浅色片
MCL理想的 CD5着色。所有的 瘤细胞都着色很强。散在的T细 胞着色比瘤细胞深。
精选
MCL的CD5染色不足 (一抗浓 度太低)。 MCL瘤细胞几乎都 没有着色。
46
3. 染色过弱原因及其对策
PCNA
精选
S-P×400
S-P×40017
阳性细胞百分比
计数100个瘤细胞，其中 阳性细胞的比例：
＜5%
（－）
5%~30% （＋）
30%~50% （ ＋ ＋ ）
＞50%
（＋＋＋）
精选
P53
18
Barnes法
A：瘤细胞显色有无及深浅 0（不着色） 1（浅黄色） 2（棕黄色） 3（棕褐色）
B：显色细胞的比例 1（1%~10%） 2（11%~50%） 3（51%~80%） 4（＞80%）
评分=A×B 0分：阴性 1~4分：弱阳性 ＞4分：强阳性
PCNA
精选
19
阳性面积百分比
40×10视野，选取5个视野，计算阳性区域面积占整个参考 面积的百分率。
胶原染色
精选
20
Weidner法（MVD计数）
1. 孤立的棕黄色细胞族代表一条 微血管。
2. 低倍镜下找到组织内密度最高 区域。
3. 40×10视野下计数微血管数目。
精选
25
精选
26
四、免疫组化异常着色及对策
1.非特异性着色及其对策
非特异性着色原因 操作过程冲洗不充分 内源性过氧化物酶
内源性生物素 电荷吸附 抗体不纯
切片制片不当 加试剂后切片干燥
对策 每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭 使用生物素阻断试剂盒阻断
非免疫动物血清封闭
采用单克隆抗体
改善取材和制片
免疫组化结果判断 及常见问题分析
武汉大学病理学教研室 杨飞
精选
1
精选
2
肝脏：CK8理想着色，胆管上皮细胞强阳性， 肝细胞呈不同层次阳性。
精选
3
pan CK（AE1/AE3） 在肝脏理想的染色，采用了热修复。 肝细胞膜、胆管强而清晰的着色。背景干净。
精选
4
一、特异性染色的判断
1.特定的定位 细胞阳性——根据靶抗原不同而呈现胞膜型、胞浆型 或胞核型 间质阳性——表现为细胞外着色，局限性或弥散性
防止切片干燥
精选
27
内源性生物精选素—肾小管
28
内源性生物素—淋精巴选结转移性甲状腺腺癌
29
蜕膜组织部分胞核PR阳性，血管内红细胞过氧化物酶显色
精选
30
嗜酸性粒细胞中精细选胞色素显色
31
吞噬细胞内 含铁血黄素
精选
32
坏死组织着色：AE1/AE3
精选
33
坏死组精织选 着色
34
交叉反应：乳腺ki-67组织细胞胞浆着色
阳性片 － ＋ － ＋ ＋
待检片 － ＋ ＋ － ＋
阴性对照 － ＋ － － －
结论 操作失误，抗体失效
非特异性着色 阳性片不含靶抗原 待检片不含定位抗原 待检片含定位抗原
精选
16
三、结果分析
1-day CM
阳性强度 20×10视野下，随机选
取5个视野，测100个阳性 细胞的平均光密度即为此 4-day CM 片的阳性强度。
精选
35
黑色素瘤，细胞内含黑色素，呈紫黑色，HE染色
精选
36
灶状着色：机械原因着色
精选
37
全片着色
Cyclin D1 套细胞淋巴瘤
精选
38
全片着色
精选
39
边缘着色
精选
40
“阴阳脸”着 色
精选
41
气泡
精选
42
非特异性着色及其对策
非特异性着色原因 操作过程冲洗不充分 内源性过氧化物酶
内源性生物素 电荷吸附 抗体不纯
切片制片不当 加试剂后切片干燥
对策 每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭 使用生物素阻断试剂盒阻断
非免疫动物血清封闭 采用单克隆抗体 改善取材和制片 防止切片干燥
精选
43
无信号片
精C选D30
44
2. 染色的假阴性及其对策
染色假阴性原因
组织处理不当（固定、浸蜡） 一抗与二抗种属连接错误 抗体失效 显色系统不相适配 操作不当，遗漏重要步骤
3.排除人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。
4.颗粒性显色 DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。
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5
免疫组化标准化照片
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11
合格的免疫组化染色切片 是正确判断染色结果的基础和前提
不合格的免疫组化染色切片 容易导致误判
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C-erbB-2
优
中
良
精选
差
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ER
4
2
3
精选
1
14
PR
子宫内膜PR染色，修复不足
子宫内膜PR染色，修复良好
精选
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二、染色结果的判断
编号 1 2 3 4 5
精选
24
3、图象处理系统功能
几何形态学定量分析 细胞核、浆的大小、面积、核浆比； 细胞分布密度、个数； 血管、 腺体的面积、密度；间质的面积 免疫组织化学分析 按着色灰度分类，计算阳性、阴性细胞的面积含量 DNA倍体分析 计算正常细胞及肿瘤细胞DNA 含量，给出倍体参数、DNA参数分布 直方图 AgNOR分析 颗粒分析：数目、大小、面积、比例
染色过弱原因
抗体浓度过低，孵育时间过短 滴加试剂时缓冲液未沥干 过度蛋白封闭 抗原被破坏
室温太低，<15℃
对策
提高浓度，延长时间
滴加试剂前沥干多余水分
缩短封闭时间
新鲜组织及时固定，固定 时间不要超过24小时 适当延长孵育时间
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K-ras
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附：定量分析——图象处理系统
1、图象处理：
利用仪器按照不同的目的进行图象的修正、变 换、特征提取和测量。 1）“狭义”指消除图象的模糊不清部分，校正 畸变。 2）“广义”包括对图象的结构分析，提取特征 进行测量。
精选
23
2、图象处理系统组成
图象输入（显微镜、扫描仪） 图象处理运算（病理图文分析软件） 图象、数据输出
对策
改善条件，重取材 确定抗体种属无误 不得使用过期的试剂盒 更换适配的显色系统 严格遵守操作规程
精选
45
无色或浅色片
MCL理想的 CD5着色。所有的 瘤细胞都着色很强。散在的T细 胞着色比瘤细胞深。
精选
MCL的CD5染色不足 (一抗浓 度太低)。 MCL瘤细胞几乎都 没有着色。
46
3. 染色过弱原因及其对策
PCNA
精选
S-P×400
S-P×40017
阳性细胞百分比
计数100个瘤细胞，其中 阳性细胞的比例：
＜5%
（－）
5%~30% （＋）
30%~50% （ ＋ ＋ ）
＞50%
（＋＋＋）
精选
P53
18
Barnes法
A：瘤细胞显色有无及深浅 0（不着色） 1（浅黄色） 2（棕黄色） 3（棕褐色）
B：显色细胞的比例 1（1%~10%） 2（11%~50%） 3（51%~80%） 4（＞80%）
评分=A×B 0分：阴性 1~4分：弱阳性 ＞4分：强阳性
PCNA
精选
19
阳性面积百分比
40×10视野，选取5个视野，计算阳性区域面积占整个参考 面积的百分率。
胶原染色
精选
20
Weidner法（MVD计数）
1. 孤立的棕黄色细胞族代表一条 微血管。
2. 低倍镜下找到组织内密度最高 区域。
3. 40×10视野下计数微血管数目。
精选
25
精选
26
四、免疫组化异常着色及对策
1.非特异性着色及其对策
非特异性着色原因 操作过程冲洗不充分 内源性过氧化物酶
内源性生物素 电荷吸附 抗体不纯
切片制片不当 加试剂后切片干燥
对策 每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭 使用生物素阻断试剂盒阻断
非免疫动物血清封闭
采用单克隆抗体
改善取材和制片
免疫组化结果判断 及常见问题分析
武汉大学病理学教研室 杨飞
精选
1
精选
2
肝脏：CK8理想着色，胆管上皮细胞强阳性， 肝细胞呈不同层次阳性。
精选
3
pan CK（AE1/AE3） 在肝脏理想的染色，采用了热修复。 肝细胞膜、胆管强而清晰的着色。背景干净。
精选
4
一、特异性染色的判断
1.特定的定位 细胞阳性——根据靶抗原不同而呈现胞膜型、胞浆型 或胞核型 间质阳性——表现为细胞外着色，局限性或弥散性
防止切片干燥
精选
27
内源性生物精选素—肾小管
28
内源性生物素—淋精巴选结转移性甲状腺腺癌
29
蜕膜组织部分胞核PR阳性，血管内红细胞过氧化物酶显色
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30
嗜酸性粒细胞中精细选胞色素显色
31
吞噬细胞内 含铁血黄素
精选
32
坏死组织着色：AE1/AE3
精选
33
坏死组精织选 着色
34
交叉反应：乳腺ki-67组织细胞胞浆着色
阳性片 － ＋ － ＋ ＋
待检片 － ＋ ＋ － ＋
阴性对照 － ＋ － － －
结论 操作失误，抗体失效
非特异性着色 阳性片不含靶抗原 待检片不含定位抗原 待检片含定位抗原
精选
16
三、结果分析
1-day CM
阳性强度 20×10视野下，随机选
取5个视野，测100个阳性 细胞的平均光密度即为此 4-day CM 片的阳性强度。
精选
35
黑色素瘤，细胞内含黑色素，呈紫黑色，HE染色
精选
36
灶状着色：机械原因着色
精选
37
全片着色
Cyclin D1 套细胞淋巴瘤
精选
38
全片着色
精选
39
边缘着色
精选
40
“阴阳脸”着 色
精选
41
气泡
精选
42
非特异性着色及其对策
非特异性着色原因 操作过程冲洗不充分 内源性过氧化物酶
内源性生物素 电荷吸附 抗体不纯
切片制片不当 加试剂后切片干燥
对策 每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭 使用生物素阻断试剂盒阻断
非免疫动物血清封闭 采用单克隆抗体 改善取材和制片 防止切片干燥
精选
43
无信号片
精C选D30
44
2. 染色的假阴性及其对策
染色假阴性原因
组织处理不当（固定、浸蜡） 一抗与二抗种属连接错误 抗体失效 显色系统不相适配 操作不当，遗漏重要步骤