实时荧光定量PCR原理及应用 (2)

目的基因
Δ Ct1
Normalizer
Ct
Ct
Δ Ct2
看家基因
应用之二：基因表达差异分析
基因表达差异＝2
Δ Ct1
/2
Δ Ct2
＝2
Δ Ct1 - Δ Ct2
应用之二：基因表达差异分析
定量PCR RNA抽提 cDNA产物 系列稀释
RT
两个基因的扩增效率
应用之二：基因表达差异分析
1
2
3
4
应用之二：基因表达差异分析
特点：
¾ 特异性高：只有引物和探针都和同一模板结合时 才能检测 ¾完全实时监测：一分子荧光信号对应一条DNA链 的产生 ¾多通道检测：可以在一次反应中同时检测多个不同 目的基因序列
Taqman 三通道实验
Daniel Candotti - Cambridge, UK
HCV (FAM)
RNA virus 65bp amplicon
实时荧光定量PCR原理及应用
张达威-技术支持 上海吉泰生物科技有限公司
主要内容
• 荧光定量PCR原理
• 荧光定量PCR方法与应用
实时荧光定量PCR
z 定义：实时监测PCR扩增反应 z 方法：利用荧光信号 z 目的：估算特异性模板的初始浓度 z 优势： 灵敏度高 动态范围宽 重复性好 高通量
传统PCR定量
Stratagene 公司简介
Stratagene 公司成立于1984年,致力于 发展生命科学领域的创新产品与科技. 总部位于美国 La Jolla, California .在欧 洲与日本设有分公司. 2007年被Agilent公司收购，成为 Agilent公司旗下品牌。
Mx3000P 整体设计
• 使用SYBRGreen进行一步法RT-PCR的条 件优化 • MgCl2的浓度，4-8mM • 模板浓度，总RNA或mRNA：1pg-1ug
荧光定量PCR仪的硬件条件
激发光源 样品 检测设备
热循环－加热、制冷
荧光定量PCR仪应满足的要求
• 光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染 料 • 能分开不同荧光素的激发光与发射光波长 • 能检测的灵敏度与动态检测范围 • 准确的温度控制和良好的孔间温度均一性.
• Taqman探针长度25-32bp，Tm在68-72℃ 之间，确保比引物的Tm值大5-10℃ • GC含量在30-80%，避免出现多个重复碱基 • 5’端不能为G，G能淬灭荧光信号 • Taqman探针要靠近上游引物，最好只有一 个碱基距离。 • 避免探针与引物间形成二级结构 • SNP位点应设计在探针中间位置
C(t)值与阈值
[DNA]
阈值threshold 检测极限
Ct Ct Ct Cycle
扩增曲线
•平台期
•Fluorescence
•指数扩增期
•基线 •阈值
•Ct •Cycle Number
•dR
荧光定量PCR计算原理
• 起始模板浓度的对数 与C(t)值成反比
如何定量
① 绘制标准曲线 ② 所测样本C(t)值 ③ 定量
•特异性的PCR产物
引物二聚体
First derivative of the raw fluorescence multiplied by –1
® TaqMan
•Donor dye (Reporter) •Acceptor dye (Quencher)
Probes
游离的探针
•Light
•Light Emission •Energy transfer
应用之三：SNP分析
两条探针分别针对不同等位基因
T A G A
G C
T C
应用之三：SNP分析
FAM
FAM TET TET
1
2
应用之三：SNP分析
1
2
Thank you！
选择吉泰，选择成功！
试验设计与优化
• PCR是精确性很高的实验，实验前我们需 要完整的实验设计方案，而且实验条件对 结果影响也很大。 • PCR扩增效率：保证实验的精确性和重复 性。 • 影响扩增效率的因素：扩增子长度；扩增 子GC含量；扩增子、引物、探针二级结构； PCR各组分反应浓度；模板浓度。
•Ta q •Light
引物和探针与模板结合，发生FRET
•Light Emission
Taq酶延伸并水解探针，荧光报告集团被释放—
•Ta q
荧光信号累计增加
Taqman探针法
Taqman探针：
是与目的序列互补的寡聚核苷酸，5‘端标 记荧光报告集团，3’端标记荧光淬灭集团，探针完整时不 发出荧光，水解后发出荧光。
实时PCR体系优化 • 基本参数的优化
• MgCl2的浓度，DNA：2-5mM;mRNA：48mM。 • 模板浓度，系列稀释梯度模板，CP在15-30 之间。而CP值的确定经验上是SYBRGreen 荧光信号是本底的2倍，杂交探针荧光强度 是本底的0.3倍。
• 使用SYBRGreen测定DNA的优化 • MgCl2的浓度，2-4mM • 模板浓度，DNA：50ng-5pg；质粒：106 拷贝 • 引物浓度，0.3uM • 退火浓度，比计算出的Tm小5℃
¾ 传统的PCR定量是一种终点法的检测： ¾ 动态范围受限 检测重现性极差 定量不准确 低通量 不能实时得到结果
Gel-based quantification
11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference
Real-time quantification
HIV-1 (HEX)
RNA Virus 74bp amplicon
HBV (CY5)
DNA virus 81bp amplicon
实时定量PCR应用
¾绝对定量 ¾相对定量 ¾SNP分析
应用之一：病原体检测与定量
绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝数－病原 体的多少） • 标准品（如质粒）：做系列梯度稀释 • 待测样本 • 阴性对照（NTC）
引物设计原则
• 扩增片段100-200bp • 引物长度18-30bp，Tm在58-62℃之间，上 下游引物Tm值不超过2℃ • GC含量在30-80%，避免出现多Hale Waihona Puke Baidu重复碱基， 3’端不为G或C。 • 避免引物内二级结构，引物间二聚体出现。 • 跨外显子设计引物，消除基因组DNA扩增
探针设计原则
发射光滤镜轮
激发光滤镜轮
热盖
热循环系统
石英卤钨灯 光纤扫描臂
仪器优势
¾石英卤钨灯的激发光源：超长的激发光范围350750nm ¾多通道设计，滤光片可灵活定制 ¾卓越的孔间均一性和温度控制，72℃时+0.25℃ ¾光学扫描设计: 避免边缘效应；光电倍增管增加检 测的灵敏度 ¾内置芯片，具有断电保护功能 ¾人性化的软件，实时监测，直观易用，功能强大
应用之一：病原体检测与定量
1
2
3
4
应用之一：病原体检测与定量
应用之二：基因表达差异分析
相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的 倍数 •两种样品：Calibrator（对照，如正常组织） 与Sample（待测样品） •两个基因：目的基因与看家基因
应用之二：基因表达差异分析
Calibrator Gene of Interest Ct Sample Ct
¾开放的平台，选择你心仪的试剂与耗材 ¾完善的售后支持，您的满意是我们最大的目 标
SYBR green 是一个很好的初级化学试剂，价格上存在优势， 在试验验证和问题分析上非常有用。
SYBR Green 熔解曲线
当产物的从双链完全变成单链时 SYBR Green变为游离状态 荧光值迅速变为体系背景值
•Raw Normalized Fluorescence
SYBR Green熔解曲线
Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference
传统PCR与实时定量PCR
终点检测
重复性好 精确度高 误差小
Ct
阈值与CT值
• 阈值threshold ：在荧光信号指数扩增阶段， 在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值， 一般荧光阈值的缺省设置是 3-15 个循环的 荧光信号的标准偏差的10 倍。 • CT=cycle threshold即阈值循环数：荧光信 号达到阈值设定值时PCR所经历的循环数。
TaqMan® Molecular Beacons
Taq
Taq
SYBR Green I dye (dsDNA-binding dye)
•dsDNA + free dye •弱的荧光信号
•与双链小沟结合 •荧光增强↑1,000x)
SYBR Green法作用机理
SYBR Green:
¾最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm ¾染料只与双链DNA小沟结合，单链不结合 ¾游离时荧光信号非常低，结合后荧光信号强度增强1000倍 ¾ 不能区分引物二聚体，单链二级结构，非特异性产物 ¾需要做熔解曲线分析产物的单一性
通过已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线，根据样品 的Ct值，依据 Log起始拷贝量与Ct的线性关系，就可以计 算出样品中所含的模板量
荧光定量PCR方法
¾ 荧光染料法 ¾ 荧光探针法
•荧光检测原理
•light •light
波长
染料和探针
DNA binding
SYBR Green I™
Probe based detection