MLVA分型技术和实验操作步骤
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18
MLVA方法的好处
• 上述的优点
• 具有弹性 flexibility. • 不需要参考菌株作为参照
19
第二部分
发展一种新的MLVA方法
20
系统测试筛选多态性VNTR
基于序列的比较 初筛 得分大于70，拷贝数大于3，同源性大于75% 选择出114位点
多态性VNTR位点的 PCR鉴定和筛选
现实的模板扩筛选 33血清型和21个猪链球菌2型 36个电泳行为不同
2 1
3 2
3 3
1 0
36 26
ST1 ST81
+ + - - -
1.7 1
10
分析软件：BioNumerics
• 命名MLVA型：MT1-MT85
• 评价各位点的分辨力：
Nei’s index = 1-Σ (allele frequency)2 • 评价MLVA方法的分辨力： Simpson's index = 1 - Σ [nj (nj-1)]/[N (N-1)]
• • • • 多位点可变数目串联重复序列分析 可变数目串联重复：VNTR： MLVA方法：即VNTR的数组 例如：
其他特征
MLVA1型别 菌株 血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST
MLVA1型 735 MLVA14 1046
2 15
6 3
6
2 10 9
3
MLST
• 结果无偏性unambiguous results • 有相应的数据库支持 international databases
• 区分度低，Low discrimination power • 高花费，high cost: sequencing • 不适合常规检测和暴发调查，unsuitable for routine surveillance and epidemiological studies
• 短期研究
– 了解病原菌的适应性 – 感染溯源
2
分子分型方法
• 序列或分类资料为基础的等位基因： • 多位点序列分析（multilocus sequence typing，MLST） • 多位点可变数目串联重复序列分析（Multiple-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis,MLVA） • • 图像分析： • 脉冲场凝胶电泳（PFGE) • 随机扩增多态性DNA分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD) • 扩增片断长度多态性分析（amplified fragment length polymorphism, AFLP） • 核糖体分型（ribotyping） • 等
• 江苏 1998暴发疫情 • 25 感染/14 死亡
Yu, H., H. Jing, Z. Chen, et al. 2006. Human Streptococcus suis outbreak, 四川, China. Emerg.Infect.Dis. 12:914-920
31
中国猪链球菌PFGE型别
14
用毛细管电泳来判断片段大小 用500liz内标标定扩增片段大小用 genemap软件分析毛细管电泳图
15
MLVA聚类分析
• Bionumerics 软件（version 4.64 ）
• 效用均等的分类资料的分析方法 （ UPGMA） (unweighted pair group method
A1
TR2-FAM TR4-HEX
2.0
1.5
0.3u
0.7
56℃
40秒
30
毛细管电泳
A2
TR1- FAM TR3-HEX
13
扩增条带大小判断：
• （一）毛细管电泳： • 1.引物标记 • 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物 （FAM 、HEX 和TAMRA ） • 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标 （ABI自带） • （二）普通电泳分析 • （三）测序分析
核酸测序 确定重复模式
确认重复序列和重复单元数 14个确定指标
区分效能评价
9个指标的MLVA策略
21
串联重复的鉴定
TRF 软件
（Tandem Repeats Finder software）
://minisatellites.u-psud.fr/
• • • • 匹配赋2分 不匹配-3分 碱基缺失-5分 最小报告分值50分
4
VNTR
• VNTR：可变数目出那里重复序列， Variable Number of Tandem Repeats •
重复单元
AACTTTACGTTC AAATTAACGTTC AAATTAACGTTC AAATTTACCTTG
侧 翼 序 列
5
18bp*3
• AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGC TGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGG GCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCA GGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGA
100 bp
VNTR和等位基因
下游序列
VNTR 重复 Primer-F
atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgat
上游序列 Primer-R
重复拷贝数 =
扩增大小-上下游序列 重复单元的大小
取整：就近取整或去除小数取整
8
串联重复序列可变重复数目的判定
9
MLVA方法
• SmaI酶切：ST7型分为单一的PFGE-01型 • 2005，2006年和2007年中国ST7菌株： PFGE-01型
Ye, et al. 2006. Emerg.Infect.Dis.
32
猪链球菌MLVA指标和特征
cod e Location in GZ1 Locus§ Matches In GZ1 % Tm℃
多位点可变数目串联重复序列 （MLVA）分型技术和操作步骤
李 伟
中国CDC 传染病所 传染病预防控制国家重点实验室 PulseNet China第一期培训 2010-06-19
1
病原菌分子分型的目的
• 长期研究 病原菌的遗传进化
– 病原菌适应来自宿主的高选择性压力 – 因点突变、重组（包括基因转移）等遗传变异
PCR primers:
CTCCCACACCCAGGACAC PCR CGGCCTACCCAACATTCC
230 bp
strain H37Rv : 215 bp
300 bp 200 bp
Gel migration
strain CDC1551 : 230 bp
测序分析
230 bp 215 bp 200 bp 7
98HAH12 SC84
22
串联重复的鉴定
23
串联重复的鉴定
Indices 1858865--1858900 1862974--1863158 1867321--1867363 Period Size 12 46 16 Copy Number 3.0 3.9 2.6 Consensus Size 12 46 16 Percent Matches 70 78 70 Percent Indels 0 4 7 Score 52 228 52 A 36 22 25 C 5 23 25 G 33 12 13 T 25 40 34 Entropy (0-2) 1.79 1.89 1.93
using arithmetic averages)
• 等分权重 • 分类图/最小生成树的形式展现 • 多态性指数： Simpson’s index
16
MLVA方法的应用
• • • • • • • • • • • • • • Neisseria meningitidis(23) Streptococcus pneumoniae(20), Streptococcus uberis(12), Salmonella Enteritidis(10), Salmonella enterica(5,35), Listeria monocytogenes(28,29,39), Legionella pneumophila(33), Clostridium perfringens(37), Leptospira interrogan(38,38), Escherichia coli O157:H7(30,46), Clostridium difficile(43), Burkholderia pseudomallei(42), Pseudomonas aeruginosa(32), Shigella spp(13) et.al..
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
LN1
GX2
CQ1
GZ2
SC17
SC84
4380032
4380026
RC4716
Gx407
27
28
多种重复模式
TR2
Indices 217182--217298 217182--217291 217221--217313 Period Size 24 15 39 Copy Number 4.5 8.1 2.4 Consensus Size 24 14 39 Percent Matches 61 57 94 Percent Indels 18 18 1 Score 96 77 171 A 27 27 25 C 16 17 16 G 35 35 34 T 21 20 23 Entropy (0-2) 1.94 1.94 1.95
17
分型方法评价标准
• • • • • • • • • • • 区分度(discriminatory power) 数字化数据库 适合实验室间比对（compare between laboratories） 重复性（Reproducible） 流行病学相关性（epidemiological concordance） 方便快速（convenience and rapidity ） 稳定性（stability） 容易解释（easy to interpret） 花费 技术难度
•
（二）普通电泳分析
•
（三）测序分析
12
模板制备： DNA提取模板 水煮模板
MLVA实验步骤-PCR
2个PCR体系/多重PCR体系：
指标 体系 （20ul） Buff er dNTP 上下游引 物 10uM（个 ul） 0.2 0.3 2.0 1.5 0.2 0.3 0.3u 0.7 57℃ 40秒 30 毛细管电泳 酶 模板ul Tm 延伸时 间 循环数 片段大小 判断方式
24
串联重复的鉴定
25
26
inserted a small segment
泳道 菌号
1 SC22
2 NJ25
3 9802
4 9801
5 GZ1
6 89-1591
7 P1/7
8 R735
9 ATCC43765
10 11611
11 HASS-73
12 Baidu NhomakorabeaC061001
13 SC06238
14 06GZ1
217185--217309
12
9.7
12
58
14
87
27
16
34
21
1.95
29
第三部分
MLVA方法在猪链球菌分型中的应用
30
猪链球菌暴发疫情
• 2005年-四川人感染猪 链球菌暴发疫情 • 215人感染、39人死亡 • 波及四川36个县的202 个村庄 • 重庆， 贵州， 广东， 江西也发现病例
• 聚类分析 • 构建最小生成树
11
MLVA 实验操作
• • • • • • • • 一、模板制备：DNA提取模板或水煮模板 二、PCR 扩增 多重PCR反应 三、扩增条带大小判断： （一）毛细管电泳： 1.引物标记 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ） 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带）
VNTR产生的原因：聚合酶的滑链复制
6
VNTR 位点的确定
TRF 软件（Tandem Repeats Finder software）， ://minisatellites.u-psud.fr/
Strain H37Rv: 4 x 15 bp Strain CDC1551: 5 x 15 bp
215 bp
Tandem repeat sequence
CGTTAAGCAAATCCTAGACAAAATAGGAAATCGAAGCAGATAGCTTCAATCAAGGAGATTT ATCTTTTTGCCAGAATTTGTAGCTCGAATTCAACTAAGATTAAGATAGAGGA AGCAGCCTGTAGTTGAGGCACCTGTAGAGGAAGTTGTAG CAAGAAAAAATGGTCCATTCTCGCCGTTGCGCCTTTCCAGTTTCTTGGGCG ATATTGAAACCTCTGAAAAACAGATGCCAAGTATTGTGAACGACAATGTCGTAACACCTGA AAAGCAAATGGCTAATAAAGAGAACGATA AAGGTCCGGTGGACCTTTTTATCATGAGCATGAAAACAAGAAAGCGAATT CGTTGCTGGTACCGTAGCAGTTGCATCAGT AAAATATAGA CCAGAAGAGCCAAAACAAGACGCTCCACAAGCGCCATCAACACCGGAAAAACAAACAGAA GAACCGAACAAGGAAGAACCTAAGAAAACACCACAAGCGCCATCGACTCCGGAA AAACAACCAGAAGTACCGGAATCACCAAACCCAGAGACACCAGACGCGCCATCGA CTCCAAAAGATGAACCGCAAGCTCCATCAATCCCAGAAGAAAAACCAAAAGTA GAGCA
菌株名称 GZ1 P1/7 05ZYH33
血清型 2 2 2 2 2
来源 (CP000837) (www.sanger.ac.u k) (NC_009442) (NC_009443)
ST 型 ST1 ST1 ST7 ST7 ST7
• 以猪链球菌为例： • 鉴定了750,749,790,784 • 测序菌株基因组串联重复位点的比较
MLVA方法的好处
• 上述的优点
• 具有弹性 flexibility. • 不需要参考菌株作为参照
19
第二部分
发展一种新的MLVA方法
20
系统测试筛选多态性VNTR
基于序列的比较 初筛 得分大于70，拷贝数大于3，同源性大于75% 选择出114位点
多态性VNTR位点的 PCR鉴定和筛选
现实的模板扩筛选 33血清型和21个猪链球菌2型 36个电泳行为不同
2 1
3 2
3 3
1 0
36 26
ST1 ST81
+ + - - -
1.7 1
10
分析软件：BioNumerics
• 命名MLVA型：MT1-MT85
• 评价各位点的分辨力：
Nei’s index = 1-Σ (allele frequency)2 • 评价MLVA方法的分辨力： Simpson's index = 1 - Σ [nj (nj-1)]/[N (N-1)]
• • • • 多位点可变数目串联重复序列分析 可变数目串联重复：VNTR： MLVA方法：即VNTR的数组 例如：
其他特征
MLVA1型别 菌株 血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST
MLVA1型 735 MLVA14 1046
2 15
6 3
6
2 10 9
3
MLST
• 结果无偏性unambiguous results • 有相应的数据库支持 international databases
• 区分度低，Low discrimination power • 高花费，high cost: sequencing • 不适合常规检测和暴发调查，unsuitable for routine surveillance and epidemiological studies
• 短期研究
– 了解病原菌的适应性 – 感染溯源
2
分子分型方法
• 序列或分类资料为基础的等位基因： • 多位点序列分析（multilocus sequence typing，MLST） • 多位点可变数目串联重复序列分析（Multiple-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis,MLVA） • • 图像分析： • 脉冲场凝胶电泳（PFGE) • 随机扩增多态性DNA分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD) • 扩增片断长度多态性分析（amplified fragment length polymorphism, AFLP） • 核糖体分型（ribotyping） • 等
• 江苏 1998暴发疫情 • 25 感染/14 死亡
Yu, H., H. Jing, Z. Chen, et al. 2006. Human Streptococcus suis outbreak, 四川, China. Emerg.Infect.Dis. 12:914-920
31
中国猪链球菌PFGE型别
14
用毛细管电泳来判断片段大小 用500liz内标标定扩增片段大小用 genemap软件分析毛细管电泳图
15
MLVA聚类分析
• Bionumerics 软件（version 4.64 ）
• 效用均等的分类资料的分析方法 （ UPGMA） (unweighted pair group method
A1
TR2-FAM TR4-HEX
2.0
1.5
0.3u
0.7
56℃
40秒
30
毛细管电泳
A2
TR1- FAM TR3-HEX
13
扩增条带大小判断：
• （一）毛细管电泳： • 1.引物标记 • 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物 （FAM 、HEX 和TAMRA ） • 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标 （ABI自带） • （二）普通电泳分析 • （三）测序分析
核酸测序 确定重复模式
确认重复序列和重复单元数 14个确定指标
区分效能评价
9个指标的MLVA策略
21
串联重复的鉴定
TRF 软件
（Tandem Repeats Finder software）
://minisatellites.u-psud.fr/
• • • • 匹配赋2分 不匹配-3分 碱基缺失-5分 最小报告分值50分
4
VNTR
• VNTR：可变数目出那里重复序列， Variable Number of Tandem Repeats •
重复单元
AACTTTACGTTC AAATTAACGTTC AAATTAACGTTC AAATTTACCTTG
侧 翼 序 列
5
18bp*3
• AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGC TGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGG GCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCA GGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGA
100 bp
VNTR和等位基因
下游序列
VNTR 重复 Primer-F
atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgat
上游序列 Primer-R
重复拷贝数 =
扩增大小-上下游序列 重复单元的大小
取整：就近取整或去除小数取整
8
串联重复序列可变重复数目的判定
9
MLVA方法
• SmaI酶切：ST7型分为单一的PFGE-01型 • 2005，2006年和2007年中国ST7菌株： PFGE-01型
Ye, et al. 2006. Emerg.Infect.Dis.
32
猪链球菌MLVA指标和特征
cod e Location in GZ1 Locus§ Matches In GZ1 % Tm℃
多位点可变数目串联重复序列 （MLVA）分型技术和操作步骤
李 伟
中国CDC 传染病所 传染病预防控制国家重点实验室 PulseNet China第一期培训 2010-06-19
1
病原菌分子分型的目的
• 长期研究 病原菌的遗传进化
– 病原菌适应来自宿主的高选择性压力 – 因点突变、重组（包括基因转移）等遗传变异
PCR primers:
CTCCCACACCCAGGACAC PCR CGGCCTACCCAACATTCC
230 bp
strain H37Rv : 215 bp
300 bp 200 bp
Gel migration
strain CDC1551 : 230 bp
测序分析
230 bp 215 bp 200 bp 7
98HAH12 SC84
22
串联重复的鉴定
23
串联重复的鉴定
Indices 1858865--1858900 1862974--1863158 1867321--1867363 Period Size 12 46 16 Copy Number 3.0 3.9 2.6 Consensus Size 12 46 16 Percent Matches 70 78 70 Percent Indels 0 4 7 Score 52 228 52 A 36 22 25 C 5 23 25 G 33 12 13 T 25 40 34 Entropy (0-2) 1.79 1.89 1.93
using arithmetic averages)
• 等分权重 • 分类图/最小生成树的形式展现 • 多态性指数： Simpson’s index
16
MLVA方法的应用
• • • • • • • • • • • • • • Neisseria meningitidis(23) Streptococcus pneumoniae(20), Streptococcus uberis(12), Salmonella Enteritidis(10), Salmonella enterica(5,35), Listeria monocytogenes(28,29,39), Legionella pneumophila(33), Clostridium perfringens(37), Leptospira interrogan(38,38), Escherichia coli O157:H7(30,46), Clostridium difficile(43), Burkholderia pseudomallei(42), Pseudomonas aeruginosa(32), Shigella spp(13) et.al..
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LN1
GX2
CQ1
GZ2
SC17
SC84
4380032
4380026
RC4716
Gx407
27
28
多种重复模式
TR2
Indices 217182--217298 217182--217291 217221--217313 Period Size 24 15 39 Copy Number 4.5 8.1 2.4 Consensus Size 24 14 39 Percent Matches 61 57 94 Percent Indels 18 18 1 Score 96 77 171 A 27 27 25 C 16 17 16 G 35 35 34 T 21 20 23 Entropy (0-2) 1.94 1.94 1.95
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分型方法评价标准
• • • • • • • • • • • 区分度(discriminatory power) 数字化数据库 适合实验室间比对（compare between laboratories） 重复性（Reproducible） 流行病学相关性（epidemiological concordance） 方便快速（convenience and rapidity ） 稳定性（stability） 容易解释（easy to interpret） 花费 技术难度
•
（二）普通电泳分析
•
（三）测序分析
12
模板制备： DNA提取模板 水煮模板
MLVA实验步骤-PCR
2个PCR体系/多重PCR体系：
指标 体系 （20ul） Buff er dNTP 上下游引 物 10uM（个 ul） 0.2 0.3 2.0 1.5 0.2 0.3 0.3u 0.7 57℃ 40秒 30 毛细管电泳 酶 模板ul Tm 延伸时 间 循环数 片段大小 判断方式
24
串联重复的鉴定
25
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inserted a small segment
泳道 菌号
1 SC22
2 NJ25
3 9802
4 9801
5 GZ1
6 89-1591
7 P1/7
8 R735
9 ATCC43765
10 11611
11 HASS-73
12 Baidu NhomakorabeaC061001
13 SC06238
14 06GZ1
217185--217309
12
9.7
12
58
14
87
27
16
34
21
1.95
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第三部分
MLVA方法在猪链球菌分型中的应用
30
猪链球菌暴发疫情
• 2005年-四川人感染猪 链球菌暴发疫情 • 215人感染、39人死亡 • 波及四川36个县的202 个村庄 • 重庆， 贵州， 广东， 江西也发现病例
• 聚类分析 • 构建最小生成树
11
MLVA 实验操作
• • • • • • • • 一、模板制备：DNA提取模板或水煮模板 二、PCR 扩增 多重PCR反应 三、扩增条带大小判断： （一）毛细管电泳： 1.引物标记 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ） 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带）
VNTR产生的原因：聚合酶的滑链复制
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VNTR 位点的确定
TRF 软件（Tandem Repeats Finder software）， ://minisatellites.u-psud.fr/
Strain H37Rv: 4 x 15 bp Strain CDC1551: 5 x 15 bp
215 bp
Tandem repeat sequence
CGTTAAGCAAATCCTAGACAAAATAGGAAATCGAAGCAGATAGCTTCAATCAAGGAGATTT ATCTTTTTGCCAGAATTTGTAGCTCGAATTCAACTAAGATTAAGATAGAGGA AGCAGCCTGTAGTTGAGGCACCTGTAGAGGAAGTTGTAG CAAGAAAAAATGGTCCATTCTCGCCGTTGCGCCTTTCCAGTTTCTTGGGCG ATATTGAAACCTCTGAAAAACAGATGCCAAGTATTGTGAACGACAATGTCGTAACACCTGA AAAGCAAATGGCTAATAAAGAGAACGATA AAGGTCCGGTGGACCTTTTTATCATGAGCATGAAAACAAGAAAGCGAATT CGTTGCTGGTACCGTAGCAGTTGCATCAGT AAAATATAGA CCAGAAGAGCCAAAACAAGACGCTCCACAAGCGCCATCAACACCGGAAAAACAAACAGAA GAACCGAACAAGGAAGAACCTAAGAAAACACCACAAGCGCCATCGACTCCGGAA AAACAACCAGAAGTACCGGAATCACCAAACCCAGAGACACCAGACGCGCCATCGA CTCCAAAAGATGAACCGCAAGCTCCATCAATCCCAGAAGAAAAACCAAAAGTA GAGCA
菌株名称 GZ1 P1/7 05ZYH33
血清型 2 2 2 2 2
来源 (CP000837) (www.sanger.ac.u k) (NC_009442) (NC_009443)
ST 型 ST1 ST1 ST7 ST7 ST7
• 以猪链球菌为例： • 鉴定了750,749,790,784 • 测序菌株基因组串联重复位点的比较