MLVA分型技术和实验操作步骤
不规则抗体筛查标准操作规程
不规则抗体筛查标准操作规程(一)检验目的检测受血者、孕妇等血清中是否存在抗A、抗B以外的不规则抗体，为交叉配血、ABO血型正确定型(不规则抗体干扰反定型)以及新生儿溶血病产前、产后诊断提供参考依据。
(二)检验原理1.盐水介质法IgM类不规则抗体可以在室温盐水介质中发生凝集反应，使用手工试管法就可以判断受检者血液中是否存在IgM类不规则抗体。
2.凝聚胺法利用多聚季胺盐类——凝聚胺携带很多正电荷，可以中和红细胞表面的负电荷，使红细胞之间距离减少，引起正常红细胞可逆性凝集。
无抗体致敏的红细胞被凝聚胺凝集，当加入中和液后，则凝集消散，而被不规则抗体致敏的红细胞被凝聚胺凝集，则不能消散，以此来判断受检者血液中是否存在不规则抗体。
3.微柱凝胶法微柱凝胶卡的微管中装填有葡聚糖凝胶颗粒和抗人球蛋白试剂，红细胞表面抗原与其对应的IgG抗体结合以后，在离心力的作用下不断向管底沉降，并与抗人球蛋白结合形成红细胞凝集，凝胶颗粒具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过凝胶颗粒，使其悬浮在凝胶上端，未凝集的红细胞则可以通过凝胶颗粒到达微管底部。
4.玻璃珠微柱法微柱卡的每一个微管中装填有直径均一的玻璃微珠和抗人球蛋白试剂(抗-IgG和抗补体C3)，红细胞表面抗原与其对应的IgG抗体结合以后，在离心力的作用下不断向管底沉降，并与抗人球蛋白结合形成红细胞凝集，玻璃微珠具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过玻璃微珠，使其悬浮在玻璃微珠层的上端，而未凝集的红细胞则可以通过玻璃微珠之间的微小空隙到达微管底部。
(三)适用范围适用于手工凝聚胺法、手工微柱凝胶法、手工玻璃珠微柱法、全自动微柱凝胶法、全自动玻璃珠微柱法不规则抗体筛查及鉴定试验。
(四)设备性能参数各种用于不规则抗体筛查试验的检测系统性能指标参见相应说明书。
(五)器材与试剂1.器材KA-2200血清学专用离心机、B600-A型低速离心机、WADiana全自动血型配血系统、SWING-SAXO血型配血系统、Techno全自动血型配血系统、Othro Au-toVuelnnova全自动血型配血系统、阅片灯箱、卡式专用离心机、孵育器、塑料软试管、塑料硬质试管(75m m×l2mm)、试管架、一次性塑料滴管、记号笔、移液器、一次性移液枪头。
MLVA分型技术和实验操作步骤
MLVA分型技术和实验操作步骤MLVA（Multiple Locus Variable-number Tandem Repeat Analysis）是一种常用的分子生物学技术，用于研究微生物的遗传多样性和分离株的亲缘关系。
MLVA技术通过分析微生物基因组中多个可变数目串联重复序列的变异程度，建立分型模式，从而快速鉴定、分类和追踪微生物株系。
下面是MLVA分型技术的基本操作步骤：1.样品处理：从分离出的微生物培养物中，提取基因组DNA作为起始材料。
可以使用商业DNA提取试剂盒或改良的酚氯仿法进行DNA提取。
2.靶位选择：根据所研究微生物的特征和遗传多样性要求，选择多个具有可变数目串联重复序列的基因位点作为靶位。
这些位点通常位于基因组的非编码区域，具有高度变异性。
3.扩增PCR：设计引物对靶位进行PCR扩增。
引物的设计应该充分考虑位点的特异性和扩增效率。
一般采用多重PCR反应，同时扩增多个靶位。
4.电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析。
根据扩增片段的大小，可以评估靶位的扩增成功与否，以及是否存在扩增产物的差异。
5.数据分析：根据凝胶电泳结果，将每个样品的扩增片段大小进行分析，得到每个靶位的相关数据。
可以使用软件进行数据处理和峰值分析，计算不同重复序列的长度和频率，构建分型模式。
6.分型模式构建：将每个样品的靶位数据整合到一个分型模式中，通过比较不同样品的分型模式，可以推断微生物株系的相似性和亲缘关系。
尽管MLVA技术相对简单，但在实验操作中需要注意以下几个关键点：1.引物设计：引物的选择和设计对于扩增特异性和效率至关重要。
建议使用多个引物对每个靶位进行扩增，以增加准确性和可重复性。
2.试剂质量控制：使用高纯度和质量良好的试剂，避免试剂污染对实验结果的干扰。
每次实验前进行负对照扩增以检测试剂是否受到污染。
3.PCR条件优化：对于不同的靶位可能需要优化PCR反应的温度和扩增周期数，以确保扩增效率和特异性。
2015年5月文献解读
组别
n
皮下出血
轻
常规组 改良组 X2值 p值 180 180 88 152 4.08 <0.01
中
32 21 3.77 <0.01
重
60 7 3.19 <0.01
统计学中x2，p值意义
卡方检验就是统计样本的实际观测值与理论推断值之间的偏 离程度，实际观测值与理论推断值之间的偏离程度就决定卡 方值的大小，卡方值越大，越不符合；卡方值越小，偏差越 小，越趋于符合，若两个值完全相等时，卡方值就为0，表 明理论值完全符合 结果的统计学意义是结果真实程度（能够代表总体）的一种 估计方法。专业上，p值为结果可信程度的一个递减指标，p 值越大，我们越不能认为样本中变量的关联是总体中各变量 关联的可靠指标。p值是将观察结果认为有效即具有总体代 表性的犯错概率。如p=0.05提示样本中变量关联有5%的可能 是由于偶然性造成的.结果0.05≥p>0.01被认为是具有统计 学意义，而0.01≥p≥0.001被认为具有高度统计学意义
引言
1.低分子肝素钙( low molecular weight heparin ，LMWH) 是一种新型 抗凝药.其分子量小，药效持续时间长、出血可能性小，无需监测凝血机 制，具有抗栓作用强、副作用小的优点.已广泛应用于临床，常用于预防 和治疗血栓栓塞性疾病。 2.临床通常选择腹壁前外侧皮下注射途径给药。但若操作不当，极易引 起注射部位疼痛、皮下出血，甚至皮肤坏死增加了患者的痛苦，也影响 了治疗效果. 3.本文通过长期临床观察及实践，针对患者注射低分子肝素钙引起疼痛 及皮下出血的原因进行了分析，并对注射方法的改进提出了切实可行的 方案，即: 腹壁垂直皱褶法皮下注射低分子肝素钙可有效减轻患者的疼 痛、减少皮下出血、皮下瘀斑等不良反应的发生率，在临床治疗和护理 中取得了良好的效果.
院内感染艰难梭菌的毒素检测及核糖体分型研究
院内感染艰难梭菌的毒素检测及核糖体分型研究章黎华;董丹凤;江岑;彭奕冰【摘要】目的了解艰难梭菌临床分离株的毒力情况,并运用核糖体分型技术进行流行病学研究.方法采集住院腹泻患者的未成形粪便标本,无水乙醇处理后接种CDMN选择培养基行艰难梭菌分离培养,并通过革兰染色、耐氧试验和凝集试验行菌落鉴定；提取菌株DNA,选择特异性引物用PCR法扩增毒素基因tcdA和tcdB；核糖体分型针对细菌基因组16S～23S rDNA间区序列进行扩增,并根据电泳带型的多态性实现分型.结果共计分离得44株艰难梭菌,3种毒素型分别为A+B+型、A-B+型和A-B-型,分别占 57％、34％和9％；18种核糖体型中以R8 型和R4 型为主,分别占 20％和18％.结论本研究临床分离的艰难梭菌菌株中,毒素型以A+B+型为主,核糖体分型存在相对优势的型别；无证据提示存在院内艰难梭菌感染的暴发流行.%Objective To investigate the virulence of Clostridium difficile clinical isolates, and conduct an epidemiologic study by PCR-ribotyping for the strains. Methods The unfonned stool samples from hospitalized patients with diarrhea were collected, and were inoculated onto CDMN selective culture media after pretreatment with dehydrated alcohol tor the culture of Clostridium difficile. Isolates were identified by Cram staining, oxygen tolerance test and agglutination assay. Bacterial genome DNA was extracted from the Clostridium difficile strains, and toxin gene tcdA and tcdB were amplified by PCR with specific primers. Meanwhile, PCR-ribotyping was performed through amplification of the genomic 16S-23S rDNA intergenic spacer region sequence, followed by electrophoresis to distinguish different ribotypes according to the polymorphism of thebands. Results Forty-four Clostridium difficile strains were divided into 3 toxin types: A + B + strains, A - B + strains and A - B - strains, which accounted for 57% , 34% and 9% , respectively. All the strains belonged to 18 ribotypes. mainly rihotype R8 (20%) and ribotype R4 ( 18%). Conclusion fn the study, the Clostridium difficile clinical isolates were mainly A + B + strains, and there existed relatively predominant ribotypes. but no evidence suggested nosoeomial outbreak of Clostridium difjicile infection.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2012(032)011【总页数】4页(P1436-1439)【关键词】艰难梭菌;感染;毒素;核糖体分型【作者】章黎华;董丹凤;江岑;彭奕冰【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025【正文语种】中文【中图分类】R37艰难梭菌(Clostridium difficile)广泛存在于自然界和人与动物的粪便中，是一种专性厌氧的革兰阳性芽孢杆菌。
04多位点VNTR分析
多位点VNTR分析多位点VNTR分析（MLVA）是一种基于串联重复序列可变拷贝数（VNTR）对微生物分离株进行亚型分型的分子分型方法。
即使在高度相关的细菌菌株中，VNTR通常表现出大拷贝数目的不同。
对于一组选定的串联重复序列，拷贝数分析揭示了微观进化关系。
在实践中，选择的VNTR位点对于所研究的生物具有足够的互补性，并且在每个VNTR的串联重复序列外设计保守引物。
因此，每个PCR-扩增子的碱基对的大小是串联重复序列的大小加上两端的偏移的总和。
出于经济原因，有时会合并多个VNTR，即用相同的染料标记它们并以混合物的形式装入毛细管测序仪的同一列中。
条件是混合的VNTR PCR产物的大小范围不重叠。
例如，使用4种染料和2种不重叠的VNTR，每个毛细管电泳可以确定6种VNTR（一种染料包含用于大小计算的参考marker）。
Bionumerics中MLVA分析BioNumerics软件提供了用于多位点VNTR分析的全自动工作流程，该流程从原始毛细测序仪图谱文件或预处理峰表（Applied Biosystems和Beckman）开始。
最初必须在数据库中输入MLVA设置。
这涉及进入样品池的规则：样品池是在同一毛细管中一起加载的VNTR扩增产物的混合物。
这包括使用的不同染料以及（可选）具有不重叠大小范围的兼容VNTR。
因此，每个VNTR由池、染料和（可选）大小范围定义。
大小范围由重复长度、偏移量和复制范围定义。
因此，该软件确切知道应在哪个大小范围内查找特定的VNTR。
请注意，复制范围仅在不同的VNTR与同一染料合并的情况下才是必需的。
如果是原始色谱图文件（AB，Beckman），则该软件可以使用用户定义的解析字符串从文件名自动解析池、染料和菌株信息。
对于GeneMapper或Beckman峰表文件，将从制表符分隔的峰表中自动解析此信息（请参见下面的示例）。
稳健而可靠的方法，与仪器类型无关由于仪器、染料和毛细管柱的不同，根据拷贝数测得的VNTR扩增子大小通常与理论大小有所不同。
食品中大肠杆菌生物检测方法的研究进展
食品中大肠杆菌生物检测方法的研究进展一、简述大肠杆菌作为食品中常见的微生物污染指标，其快速、准确的检测方法一直是食品安全领域的研究热点。
随着生物技术的不断发展，大肠杆菌的生物检测方法取得了显著进展。
这些方法不仅提高了检测速度和灵敏度，而且有助于更深入地了解大肠杆菌的生物学特性和污染途径。
本文将简述食品中大肠杆菌生物检测方法的研究进展，包括传统检测方法的优缺点、新型生物检测技术的开发与应用，以及未来发展方向。
传统的大肠杆菌检测方法，如多管发酵法和平板计数法，虽然操作简便、成本较低，但存在检测周期长、灵敏度低、易受干扰等缺点。
研究者们一直致力于开发新型的生物检测方法，以克服传统方法的不足。
基于分子生物学、免疫学、生物化学等原理的新型生物检测技术不断涌现，如脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点可变数衔接重复序列分析(MLVA)、气相色谱(GC)和高效液相色谱法(HPLC)、ATP生物发光技术、PCR检测技术等。
这些新型生物检测方法具有检测速度快、灵敏度高、特异性强等优点，能够在短时间内实现对大肠杆菌的准确检测。
PFGE和MLVA等技术可以实现对大肠杆菌的分子分型，有助于追踪污染来源和传播途径；GC和HPLC等色谱技术则可以通过分析大肠杆菌的代谢产物来评估其污染程度；ATP生物发光技术和PCR检测技术则具有快速、简便的特点，适用于现场检测和大规模筛查。
新型生物检测方法在实际应用中仍面临一些挑战，如技术成本较高、操作复杂、对实验条件要求严格等。
未来的研究应致力于优化这些技术的性能，提高实用性。
加强食品中大肠杆菌的生态学研究和风险评估，对于制定有效的食品安全控制措施也具有重要意义。
食品中大肠杆菌生物检测方法的研究进展为食品安全领域的监测和防控提供了有力支持。
随着新型生物检测技术的不断发展和完善，相信未来我们能够更加快速、准确地检测和控制大肠杆菌污染，保障人们的饮食安全。
1. 大肠杆菌在食品安全中的重要性在《食品中大肠杆菌生物检测方法的研究进展》“大肠杆菌在食品安全中的重要性”这一段落内容可以如此撰写：大肠杆菌在食品安全中占据着举足轻重的地位，其存在与否往往直接关联着食品的卫生状况和消费者的健康安全。
肺炎链球菌的检测与分型技术
2020/11/14
41
The Ct value corresponding to the detection level of RT-
PCR and MRT-PCR for pneumococcal serotyping
Serotype
RT-PCT
MRT-PCR
Combined with other serotypes
年龄组, 岁
458例死亡。死亡率 >65岁: 7.55/100 000 < 1岁: 0.71 / 100 000
*覆盖2800万 (占美国人口9%)
2020/11/14
13
/ncidod/DBMD/abcs/survreports/spneu06.pdf
欧洲1985 – 2006年<2岁儿童侵袭性肺炎球菌疾 病发病（发表的研究）
2020/11/14
8
沒有感染者
帶菌者
发病者
2020/11/14
9
肺炎链球菌疾病负担
突破血脑屏障 肺炎球菌菌血症
脑膜炎 脑脊液渗漏
鼻窦炎
突破呼吸道粘 膜纤毛防御系 统
中耳炎 鼻咽部移殖
腹膜炎 关节炎等
突破吞噬细胞防御系统
肺炎
2020/11/14 Salyers AA, Whitt DD. In: Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. 2nd ed. Washington, USA: 10 ASM Press; 1994. p. 322-31
12A
19F
6C
12B
20
7A
12F
21
7B
13
22A
沙门氏菌研究进展
3 沙门氏菌的致病性研究^p沙门氏菌广泛分布于自然界,是对人类和动物健康有极大危害的一类致病菌, 由它引起的疾病重要分为两大类;一类是伤寒和副伤寒,另一类是急性肠胃炎。
据世界卫生组织报道1985年以来, 在世界范围内由沙门氏菌引起的已确诊的患病人数显著增长, 在一些欧洲国家已增长5倍。
据资料记录, 在我国内陆地区细菌性食物中毒中, 有70%~80%是由沙门氏菌引起的。
因此, 开展食品中沙门氏菌的风险评估对有效管理食品的安全问题, 保护消费者健康具有重要的意义。
3.1 沙门氏菌感染途径的研究进展3.1.1 侵袭性沙门氏菌的侵入在肠道黏膜表面派伊尔氏结(PP)上的滤泡上皮细胞,被认为是沙门氏菌入侵的最佳起始部位。
滤泡上皮中稀疏分布着捕获抗原的微皱褶细胞(m icrofold cell, M细胞),M细胞被肠上皮细胞所包围。
M细胞的基顶面有短而不规则的微绒毛及微褶,是其胞饮的部位沙门氏菌具有2个侵袭途径:一个是通过PP上M细胞进入上皮下组织;另一个是直接侵袭M细胞进入上皮下组织,并且侵袭是通过细胞的基顶面来进行的。
当沙门氏菌黏附到M细胞或上皮细胞顶部后,运用Ⅲ型分泌系统将效应蛋白分泌到胞外并易位于宿主细胞,从而诱导宿主细胞肌动蛋白细胞骨架的重排。
这时细胞质形成一个向外突起将细菌包裹在细胞膜内,以细胞摄粒的作用进入细胞。
3.1.2 非侵袭性沙门氏菌的摄入过去一直认为,沙门氏菌是通过侵袭M细胞或肠上皮细胞进入宿主体内的,但已有研究结果表白,给小鼠口服侵袭力缺陷的鼠伤寒沙门氏菌后,在脾脏中发现有沙门氏菌的存在。
这意味着除了侵袭途径外,还存在另一种途径,就是肠黏膜组织中的树突状细胞(DC)对沙门氏菌的摄入。
在PP中,DC与M细胞接触较紧密。
DC可打开上皮细胞间的紧密联接,从上皮细胞间伸出树突,直接将肠腔中的细菌摄入。
在这一过程中,肠上皮屏障仍然保持完整,其中的分子机制是DC对紧密联接蛋白的表达和调控,如闭合素、闭合带Ⅰ、联接黏附分子等.3.2沙门氏菌致病机制的研究进展3.2.1 沙门氏菌感染途径和机制沙门氏菌可经口感染、粪—口途径传播,可通过被感染畜禽和啮齿类动物携带、排泄,污染环境、水源、饲料、食品,导致流行和传播。
微生物基因分型鉴定系统
微生物基因分型鉴定系统背景：分子生物学技术在近几年的迅速发展和普及，使得微生物学鉴定得以摆脱传统生化鉴定方法的局限，跨入新的历史进程。
较上世纪已经出现的生化鉴定法，基于分子生物学技术的微生物鉴定系统的优越性主要表现为：可鉴定的种属范围均大大扩展；可靠性和灵敏度显著提升；整体检测时间降低。
ThermoFisher 公司的MicroSEQ®自动微生物基因分型鉴定系统分型系统是目前技术最为成熟、应用最为广泛的基因分析鉴定系统，现已广泛应用在药品、食品及工业微生物的鉴定分析上，以下内容将对这一系统做更为全面的介绍。
2015版药典中指出，测序是微生物鉴定的最终解释方法1.在药品微生物鉴定领域的应用2008年度全球排名前25位的制药集团中，有22家集团已经将ThermoFisher公司的MicmSEQ®自动微生物基因分析鉴定系统用于其日常微生物检测中。
美国FDA在对生产无菌制剂和生物药品的指导性纲要《工业指南用无菌工艺生产的无菌产品一现行GMP》中更是明确提出“快速遗传类型测定方法被建议用于鉴别目的，因为这种方法已经证明比生物化学方法和表型技术更精确和准确。
”除美国之外，澳大利亚、日本及欧盟的药典中也已明确推荐使用基因分析的方法用于微生物的鉴定。
2.微生物鉴定基本原理:16S rRNA基因是伯杰氏手册(Bergey’Manual)细菌菌种分类的客观基础，也是DNA测序鉴定分型的基础。
MicroSEQ®微生物鉴定系统是专门为微生物测序分型所设计，结合最新的DNA测序技术、强大的分析软件，通过对细菌共有的16S rRNA基因进行自动化测序得到细菌鉴定结果；而对于真菌鉴定则通过对真菌26S rRNA基因上的D2基因片段进行测序。
3.检测平台：Applied Biosystems™基因分析仪以可靠性和值得信赖的结果为立足点。
作为Applied Biosystems™毛细管电泳(CE)基因分析仪产品系列的最新成员，SeqStudio基因分析仪同样基于这一理念，但同时又追求易用、易维护，易于存取和便于分享数据。
MLVA分型技术和实验操作步骤
VNTR
• VNTR：可变数目出那里重复序列， Variable Number of Tandem Repeats •
重复单元
AACTTTACGTTC AAATTAACGTTC AAATTAACGTTC AAATTTACCTTG
侧 翼 序 列
5
18bp*3
• AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGC TGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGG GCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCA GGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGA
• • • • 多位点可变数目串联重复序列分析 可变数目串联重复：VNTR： MLVA方法：即VNTR的数组 例如：
其他特征
MLVA1型别 菌株 血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST
MLVA1型 735 MLVA14 1046
2 15
6 3
6
2 10 9
菌株名称 GZ1 P1/7 05ZYH33
血清型 2 2 2 2 2
来源 (CP000837) (www.sanger.ac.u k) (NC_009442) (NC_009443)
ST 型 ST1 ST1 ST7 ST7 ST7
• 以猪链球菌为例： • 鉴定了750,749,790,784 • 测序菌株基因组串联重复位点的比较
• 聚类分析 • 构建最小生成树
11
MLVA 实验操作
• • • • • • • • 一、模板制备：DNA提取模板或水煮模板 二、PCR 扩增 多重PCR反应 三、扩增条带大小判断： （一）毛细管电泳： 1.引物标记 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ） 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带）
MLST方法原理、数据处理及应用介绍
MLST应用实例一：脑膜炎奈瑟菌种群结构现状分析
2005-2012年234株脑膜炎奈瑟菌MLST分析
MLST应用实例二：脑膜炎奈瑟菌菌群变迁
1956-2012年流脑主要血清群流行菌株分子型别变迁
MLST应用实例三：环境军团菌菌群结构分析
2005-2012年中国7个城市环境分离164株血清1型嗜肺军团菌种群结构特征
• 全国范围的、长期的流行情况调查
所有菌株进行PFGE，挑选代表菌株进行MLST分型。
肺炎克雷伯菌院内感染鉴别
ST-11
流脑暴发调查
健康携 带本底 菌株 流脑菌株总携 带率：28.3％
暴 发 相 关 菌 株
暴发相关菌株 携带率：15.7%
健康携 带本底 菌株
谢 谢
TENOVER原则的前提：菌株是同一暴发期间分离的
关于分型方法使用的建议
• 暴发调查
所有菌株进行PFGE，挑选代表菌株进行MLST；对于细菌特异性引物 PCR扩增阳性的标本未能分离菌株的，进行MLST分型。
• 个案调查
所有菌株进行PFGE和MLST分型；对于细菌特异性引物PCR扩增阳性 的标本未能分离菌株的，进行MLST分型。
DNA提取
（1）已分离到细菌：细菌培养，提取DNA。用试剂盒或者水煮法提取均
可以。 （2）未分离到细菌的标本（脑脊液、血液、咽拭子、肺泡灌洗液
等）：用标本直接提取细菌DNA，只能用试剂盒提取。
ICDC, China CDC
网 站 提 交 获 得 分 型 结 果
/neisseria 脑膜炎奈瑟菌MLST数据库
扩增片段长度多态性（AFLP）
多位点序列分型（MLST） 脉冲场凝胶电泳（PFGE） 多位点串联重复序列（MLVA）
百日咳杆菌分子分型方法研究进展_徐颖华
关 键 词 ：百 日 咳 杆 菌 ； 分 子 分 型 ； 诊 断 ； 流 行 病 学
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４１３０．２０１２．２１．０２８
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１６７３－４１３０（２０１２）２１－２６２１－０３
百 日 咳 是 由 百 日 咳 杆 菌 引 起 的 一 种 急 性 呼 吸 道 传 染 病 ，人 群普遍易感，其中尤以婴幼儿多见。百日咳疫苗是预防百日 咳 最有效也是最经济的手 段，然 而，尽 管 世 界 上 大 多 数 国 家 自 上 世 纪 五 十 年 代 起 就 开 始 实 施 百 日 咳 疫 苗 的 免 疫 接 种 ，使 百 日 咳 感染率和病死率大大下降，但 据 ＷＨＯ 统 计 报 道，２００８ 年 全 世 界仍有高达１９．５万的儿童死 于 百 日 咳 及 其 并 发 症 ，且 ９０％ 的 病例来自不发达国家和发展中国家。即便是发达欧美国家或 百日咳疫苗接 种 率 很 高 的 国 家 ，百 日 咳 发 病 率 也 有 上 升 的 趋 势，即所谓的“百日咳再现”［１］。２０１０ 年，美 国 加 利 福 尼 亚 州 爆 发６０年来最严重的百日咳疫情，据 报 道 有 ８ ３８３ 多 人 染 病，其 中有１０名婴幼儿死 亡［２］。 值 得 特 别 注 意 的 是 ，已 接 种 疫 苗 的 青 少 年 和 成 人 患 百 日 咳 的 人 数 逐 渐 增 多 ，但 他 们 的 临 床 症 状 并 不典型，临床上极易误 诊，而 且 研 究 表 明 这 些 人 往 往 是 婴 幼 儿 百 日 咳 的 重 要 传 染 源 。 ［３－４］ 因 此 百 日 咳 越 来 越 引 起 人 们 的 重 视。为了追寻百日咳新流行趋势的起因，近年来各国学者对 百 日 咳 进 行 了 广 泛 的 研 究 ，并 以 此 提 出 多 种 可 能 引 起 百 日 咳 流 行 病 学 改 变 的 因 素 ，其 中 最 引 人 注 意 的 是 致 病 菌 的 适 应 性 进 化 现 象，即致 病 菌 发 生 适 应 性 进 化 从 而 逃 避 疫 苗 免 疫 保 护 作 用 等 。 ［５－７］
MLVA分型技术和实验操作步骤
polymorphic DNA，RAPD) • 扩增片断长度多态性分析（amplified fragment length
polymorphism, AFLP） • 核糖体分型（ribotyping）
•
1.引物标记
•
2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ）
•
3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带）
• （二）普通电泳分析
• （三）测序分析
12
模板制备： DNA提取模板 水煮模板
MLVA实验步骤-PCR
2个PCR体系/多重PCR体系：
体系
指标
（20ul）
•等
3
MLST
• 结果无偏性unambiguous results • 有相应的数据库支持 international databases
• 区分度低，Low discrimination power • 高花费，high cost: sequencing • 不适合常规检测和暴发调查，unsuitable for
重复单元的大小
取整：就近取整或去除小数取整
8
串联重复序列可变重复数目的判定
9
MLVA方法
• 多位点可变数目串联重复序列分析 • 可变数目串联重复：VNTR： • MLVA方法：即VNTR的数组 • 例如：
MLVA1型别 菌株 血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST 其他特征
16
MLVA方法的应用
• Neisseria meningitidis(23) • Streptococcus pneumoniae(20), • Streptococcus uberis(12), • Salmonella Enteritidis(10), • Salmonella enterica(5,35), • Listeria monocytogenes(28,29,39), • Legionella pneumophila(33), • Clostridium perfringens(37), • Leptospira interrogan(38,38), • Escherichia coli O157:H7(30,46), • Clostridium difficile(43), • Burkholderia pseudomallei(42), • Pseudomonas aeruginosa(32), • Shigella spp(13) et.al..
广东省鼠伤寒沙门菌的分子流行病学研究
广东省鼠伤寒沙门菌的分子流行病学研究研究背景食源性疾病是各种致病因子通过摄食进入人体内引起的一类感染性或中毒性疾病,每年全球仅食源性腹泻就造成几百万儿童死亡,即使在发达国家也至少有三分之一的人患食源性疾病,沙门菌(Salmonella)是主要的病原体之一。
随着生产生活模式的改变,地域之间人员、食品往来、物资流通更加广泛,食品加工、供给及饮食方式的多样化,每年世界范围包括我国在内都会有沙门菌引起的食源性疾病报道,所造成的公共卫生问题不容忽视,卫生经济负担逐渐引起相关部门的重视。
沙门菌有2500多个血清型,其中鼠伤寒(Salmonella enterica serovar Typhimurium, S. Typhimurium)是引起人类胃肠炎或食物中毒最常见,最重要的血清型之一,寄生于人体和爬行类动物的肠道,是一种重要的人畜共患病原菌,临床主要表现为胃肠炎型、败血症等沙门菌病,由该菌引起的食源性疾病暴发在国内外经常发生,并造成重大的经济损失。
广东省每年都会有鼠伤寒沙门菌引起的食物中毒事件报道,腹泻暴发事件由以前的点源性集中暴发,越来越多地转变为跨地区的“散在暴发”,使污染源及传播途经的发现越来越依赖于分子分型手段的辅助及确认。
目前已有比较成熟的国际通用标准化脉冲场凝胶电泳(Pulse-Field Gel Electrophoresis, PFGE)分型方案、第二代分子分型技术多位点可变数目串联重复序列分析(Multiple-locus Variable-numbers Tandem Repeat Analysis, MLVA)以及英国华威大学公布的7个管家基因位点的多位点序列分析(Multiple Locus Sequence Typing, MLST)分型方法,并成功应用于多起由鼠伤寒沙门菌引起的食源性疾病暴发的溯源调查。
为了建立以实验室为基础的主动监测系统,完善分子分型网络库,广东省自2009年正式启动沙门菌加强监测(Enhance Salmonella Surveillance, ESS),对散发的腹泻患者进行监测,通过监测发现鼠伤寒沙门菌为本省非伤寒沙门菌感染性腹泻病例的优势菌型。
MLVA分型在布鲁氏菌临床分离株中的应用探索
中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s㊀２０２０,３６(６)D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０２０．００．０６５ 疾病防治M L V A 分型在布鲁氏菌临床分离株中的应用探索吕燕宁１,２,陈丽娟１,李仁清１,孙玉兰１,陈艳伟１,王全意１北京市预防医学研究中心科研项目培育专项(N o ．２０１５ＧB J Y J Ｇ０８)通讯作者:吕燕宁,E m a i l :l y u y a n n i n g＠１６３．c o m ;O R C I D :００００Ｇ０００３Ｇ４３６２Ｇ０４７２作者单位:１．北京市疾病预防控制中心,北京市预防医学研究中心,北京㊀１０００１３;２．首都医科大学公共卫生学院,北京㊀１０００６９摘㊀要:目的㊀探讨M L V A 分型对于鉴别布鲁氏菌病复发与重复感染的意义.方法㊀对初次发病与二次发病的布病患者进行血培养,分离菌株,对分离菌株做布鲁氏菌种属鉴定与M L V A Ｇ１６分型鉴定,分析两次发病分离到的菌株的分型结果及各位点的差异.结果㊀收集到４例二次发病的布病患者的血培养物,分离得到８株布鲁氏菌,经M L V A Ｇ１６分型鉴定为７个基因型,１例两次发病时间间隔较短的患者的２株分离株的M L V A Ｇ１６分型一致,没有差别,提示为复发.而另外３例两次发病时间间隔较长的患者的６株分离菌株,其M L V A Ｇ１６分型的基因型不同,分别各有一个位点的差异,提示为重复感染.结论M L V A 分型对于布鲁氏菌病的复发与重复感染具有一定的鉴别意义.关键词:布鲁菌氏病;复发;重复感染;M L V A中图分类号:R ３７８．５㊀㊀㊀文献标识码:B ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０２０)０６－０５１４－０６E x p l o r a t i o no fM L V AG e n o t y p i n g A p pl i c a t i o n i n B r u c e l l a C l i n i c a l I s o l a t e s L Y U Y a n Ｇn i n g １,２,C H E N L i Ｇj u a n １,L IR e n Ｇq i n g １,S U N Y u Ｇl a n １,C H E N Y a n Ｇw e i １,WA N G Q u a n Ｇyi １(１．B e i j i n g C e n t e r f o rD i s e a s e sP r e v e n t i o na n dC o n t r o l ,B e i j i n g Re s e a r c h C e n t r ef o rP r e v e n t i v eM e d i c i n e ,B e i j i ng １０００１３,C h i n a ;２．S c h o o l o f P u b l i cH e a l t h ,C a p i t a lM e d i c a lU n i v e r s i t y ,B e i j i n g １０００６９,C h i n a )A b s t r a c t :T o i n v e s t i g a t e t h e s i g n i f i c a n c e o fM L V A g e n o t y p i n g f o r t h e d i s c r i m i n a t i o no f b r u c e l l o s i s r e l a ps e a n dr e i n f e c t i o n ．B r u c e l l a s t r a i n sw e r e i s o l a t e d f r o mt h e p a t i e n t sw i t h p r i m a r y a n d s e c o n d a r y o n s e t o f b r u c e l l o s i s ．T h eB r u c e l l aS pe c i e s i d e n t if i Ｇc a t i o na n d t h eM L V A Ｇ１６g e n o t y p i n g w e r e c a r r i e do u t f o r th ei s o l a t e s ,t h e r e s u l t sw e r e t h e na n a l yz e da n dt h ed i f f e r e n c e sb e Ｇt w e e n t h e g e n o t y p e s a n d e a c hV N T Rw e r e i n v e s t i g a t e d ．E i g h t B r u c e l l a s t r a i n sw e r e i s o l a t e d f r o mf o u r p a t i e n t sw i t hd o u b l e o n Ｇs e t s o f b r u c e l l o s i s ．S e v e n g e n o t y p e sw e r e i d e n t i f i e db y M L V A Ｇ１６g e n o t y p i n g f o r t h ee i g h t i s o l a t e s ．T w os t r a i n s i s o l a t e d f r o m o n e p a t i e n tw i t ha s h o r t t i m e i n t e r v a l o f t h e d o u b l e o n s e t sw a s i d e n t i f i e d a s t h e s a m eM L V A Ｇ１６g e n o t y pe ,w h i c h i n d i c a t e d t h a t t h e s e c o n d a r y o n s e tw a sn o t r e i nf e c t i o nb u t r e l a p s e ．W h i l e t h eo t h e r s i xs t a i n s i s o l a t e df r o mt h eo t h e r p a t i e n t sw i t ha l o ng e r t i m e i n t e r v a l o f th e d o u b l e o n s e t sw e r ei d e n t i f i e da s s i xd i f f e r e n tM L V A Ｇ１６g e n o t y pe s ,a n de a c hs t r a i nw a s s h o w n i nad if f e r Ｇe n c e a t o n e l o c u s ．T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e s e c o n d a r y o n s e t o f t h e s e t h r e e p a t i e n t sw e r e l i k e l y r e i n f e c t i o nb u t n o t r e l a p s e ．M L V Ag e n o t y p i n g of t h e i s o l a t e s f r o mt h e p a t i e n t sw i t h d o u b l e o n s e t s o f b r u c e l l o s i s c o u l d p r o v i d e c l u e f o r t h e d i s c r i m i n a t i o n o f b r u c e l l o s i s r e l a ps e a n d r e i n f e c t i o n ．K e yw o r d s :B r u c e l l o s i s ;r e l a p s e ;r e i n f e c t i o n ;M L V A S u p p o r t e db y t h eS p e c i a l B r e e d i n g P r o j e c t f o r S c i e n t i f i cR e s e a r c ho f B e i j i n g R e s e a r c hC e n t r e f o r P r e v e n t i v eM e d i c i n e (N o ．２０１５ＧB J Y J Ｇ０８),M o l e c u l a rE p i d e m i o l o g i c a l S t u d y a n dT i m e Ｇs p a c eF o r e c a s t i n g a n dE a r l y W a r n i n g o fB r u c e l l o s i s C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :L üY a n Ｇn i n g ,E m a i l :l y u y a n n i n g＠１６３．c o m ㊀㊀布鲁氏菌病(B r u c e l l o s i s,简称布病)是由布鲁氏菌侵入机体而引起的一种世界范围流行的人兽共患传染病.人间布病为我国法定的乙类传染病[１].近年来全国布病疫情呈现逐年上升趋势[２],防控形势十分严峻[３].对布病病人进行正确㊁合理㊁及时的治疗,同时追溯感染来源并对传染源进行有效控制是布病防控中的重要环节.４１５布病的临床表现多种多样,而且许多症状没有特异性,患病早期有发热㊁出汗㊁浑身疼痛等症状,类似普通感冒或流感样表现[４].还有一些病人出现肝脾肿大㊁黄疸等表现,需要与病毒性肝炎相鉴别[５].由于布鲁氏菌致病的特殊免疫病理机制,布病在临床上存在复发与重复感染,病人会出现二次或多次发病的现象.首次患布鲁氏菌病后,在传染源存在的情况下,可以再次或多次患病,除部分为复发外,不能排除二次感染发病[６].对于二次或多次就诊的患者而言,患者主诉多为乏力㊁出汗㊁肌肉关节疼痛,布病抗体检测又一直呈阳性,所以临床医生很难分清患者是普通感冒,是风湿性关节炎,还是布病复发或是重复感染[７].急性期布病患者治愈后又重新发病,是复发还是重复感染而再次生病,这是目前临床上很难用实验室手段来区分的,因为大多数布病患者血液中的抗体可以持续多年,且滴度较高.用血清学检测难以区分复发或重复感染[７].对于布病的复发与重复感染,在患者的临床处置以及公共卫生领域的传染病疫情处置程序上均有不同,对于布病复发患者重在关注临床治疗,要考虑感染病原是否耐药,是否需要改变治疗方案以及患者对于治疗的依从性如何等问题.而对于重复感染的患者则需考虑是否以及如何再次接触了传染源,并应及时采取措施控制或消除传染源,切断传播途径等.因此对这两种情况的科学判断不仅能给与布病患者以明确的诊断,为临床用药提供理论依据,对指导临床合理用药,减少过度治疗和药物毒副作用对人体的伤害,降低药物异常反应的发生率[７],有着指示性作用,对于及时追溯与控制传染源,控制布病的流行也具有重要意义.本文旨在探索利用布鲁氏菌多位点可变数目串联重复序列分析(M L V A)的分子分型方法对布病的复发与重复感染来进行鉴别.１㊀材料与方法１．１㊀样本及其病例基本信息㊀２０１４－２０１５年在北京某医院收集了４例布病患者先后两次发病后的血培养阳性样本共８份.通过中国疾病预防控制信息系统以及医院接诊记录收集病例的基本信息.１．２㊀主要试剂与仪器㊀P l a t i n u m P C R S u p e r M i x (美国I n v i t r o g e n公司,货号１１３０６Ｇ０１６),哥伦比亚血平板培养基(英国O X O I D公司,货号P B０１２３A),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;核酸自动电泳用卡夹(Q I A x c e lD N A S c r e e n i n g K i t)与Q X A l i g n m e n t M a r k e r１５b p/３k b(德国Q I AＧG E N公司,货号分别为９２９００４和９２９５２２),１００b p D N A M a r k e r(美国N E B公司,货号为N３２３１L).毛细管电泳仪Q I A X C E L(德国Q I A G E N公司),i C y c l e r普通P C R仪(美国B i oＧR a d公司),数控干浴器A c c u B l o c k(美国L a b n e t公司),货号为D１１００.数字振荡培养箱(美国L a b n e t公司).１．３㊀菌株分离及其D N A制备㊀将血培养阳性样本接种于哥伦比亚血平板,置于３７ħ生化培养箱,培养７２h后,刮取１~２接种环菌苔加入１５０μL三馏水中,振荡混匀制成菌悬液,１００ħ煮沸１０m i n;１２０００r/m i n离心１０m i n,取上清液于－２０ħ冰箱中保存备用.１．４㊀布鲁氏菌属及种/型鉴定㊀采用B C S P３１ＧP C R 法进行布鲁氏菌属的鉴定,采用AMO SＧP C R法进行布鲁氏菌种/型的鉴定,引物序列及P C R方法参见文献[８].１．５㊀菌株的M L V AＧ１６分型鉴定㊀共选取１６个V N T R位点进行P C R扩增,P C R引物序列及荧光标记参见文献[９],具体见表１.采用二重聚合酶链反应技术(P C R)扩增各V N T R位点.反应体系:８套二重P C R均采用２５μL反应体系,其中P l a t i n u m P C R S u p e r M i x预混液２１μL,２对混合引物(１０μm)２μL,模板２μL.扩增条件:预变性９５ħ４m i n,变性９５ħ３０s,退火６０ħ３０s,延伸７２ħ３０s,３５个循环,最后７２ħ７m i n延伸.扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行S T R (s h o r t t a n d e mr e p e a t)检测,确定片段大小,计算该片段的重复单元数.逐个计算菌株每个位点的串联重复序列数目;将每个菌株的１６个位点的串联重复序列数目输入到布鲁菌M L V A数据库h t t p://m lＧv a．uＧp s u d．f r/m l v a v４/g e n o t y p i n g/i n d e x．p h p中进行比较,确定菌株基因型别.２㊀结㊀果２．１㊀４例病例的基本信息㊀见表２.２．２㊀菌株分离及其布鲁氏菌属及种/型鉴定结果㊀４个病例两次发病的采样时间及其血培养报阳时间见表３,血培养报阳后将培养物接种血平板分离培养３d得到菌株.８株菌经B C S P３１ＧP C R扩增后,均出现２２３b p条带,鉴定为布鲁氏菌.扩增结果见图１.８株菌经AMO SＧP C R扩增后,均出现１７８/７３１b p大小的目的条带,鉴定为羊种布鲁菌.扩增结果见图２.５１５６期吕燕宁,等:M L V A分型在布鲁氏菌临床分离株中的应用探索表１㊀M L V AＧ１６分型引物T a b．１㊀P r i m e r s f o rM L V AＧ１６g e n o t y p i n g 二重P C R 分组位点重复单元大小/b p１３３０S产物长度/b p１３３０S重复单元数正向引物(５ᶄＧ３ᶄ)反向引物(５ᶄＧ３ᶄ)第一组B r u c e０６１３４２７４２u H E XＧA T G G G A T G T G GＧT A G G G T A A T C GG C G T G AＧC A A T C G A C T T T T T G T CB r u c e１９６１６９１９u F AMＧG AC G A C C C G G A C C A TＧG T C T A C T T C A C C G T AＧA C G T C G T G G A T第二组B r u c e０８１８３３０３u H E XＧA T T A T T C G C A GＧG C T C G T G A T T CA C A G A A G G T T T T CＧC A G C T C G T CB r u c e３０８１２７３u F AMＧT G AC C G C A A A A CＧC A T A T C C T T C T A T G T G C A G A G C T T C A TＧG T T C G第三组B r u c e１１６３５０９６u R O XＧC T G T T G A T C T G A C C T TＧG C A A C CC C A G A C A A C A A CＧC T A C G T C C T GB r u c e４５１８１８７５u T AM R AＧA TC C T T G C C T C T CＧC C T A C C A G C G G G T A A A T A T C A A T GＧG C T T G G第四组B r u c e１２１５３４５１０u T AM R AＧC G G T A A A T C A A T TＧG T C C C A T G AG C C C A A G T T C A A C A GＧG A G T T T CB r u c e４２１２５５３９４u R O XＧC A T C G C C T C A A C T A TＧA C C G T C A A C C G C A A A A T T T A C GＧC A T C G第五组B r u c e０４８１８４６u T AM R AＧC T G A C G A A G GＧG A A G G C A A T A A GC G A T C T G G A G A TＧT A T C G G G A A GB r u c e１８８１３８４u F AMＧT A T G T T A G G GC A A TＧA G G G C A G T G A T G G T T G A G A G C A T TＧG T G A A G第六组B r u c e２１８１７５９u R O XＧC T C A T G C G C A A CＧC A A A A C AG A T C T C G T G G T C G A T AＧA T C T C A T TB r u c e５５４０２３４２u H E XＧTC A G G C T G T T T C G TＧC A T G T C T T A A T C T G G C G T T C G A G T TＧG T T C T第七组B r u c e０７８１６６６u F AMＧG C T G A C G G G G A A G A AＧC A T C T A TA C C C T T T T T C A G T C A A GＧG C A A AB r u c e４３１２１７０１u R O XＧTC T C A A G C C C G A T A T GＧG A G A A T T A T T T T C C G C C T G CＧC C A T A A A C第八组B r u c e０９８１４０５u H E XＧG C G G A T T C G T T C TＧT C A G T T A T CG G G A G T A T G T T T T G G T TＧG T A C A T A GB r u c e１６８１６８５u T AM R AＧAC G G G A G T T T T TＧG T T G C T C A A T G G C C A T G T T T C C G T TＧG A T T T A T表２㊀病例基本信息T a b．２㊀B a s i c i n f o r m a t i o no f t h e c a s e s病例编号性别年龄职业首次发病时间二次发病时间两次发病时间间隔/d分离菌株编号１男４５工人２０１４．０５．２４２０１５．０１．１６２３７S１㊁S２２男６１工人２０１４．０５．２８２０１４．０９．１６１１２S３㊁S４３男４６家务及待业２０１４．０６．２９２０１５．０４．０１２７６S５㊁S６４男４９农民２０１４．０７．１３２０１５．０３．０５２３４S７㊁S８㊀㊀注:S１㊁S３㊁S５㊁S７分别为各病例初次发病的分离株,S２㊁S４㊁S６㊁S８分别为各病例二次发病的分离株.６１５中国人兽共患病学报２０２０,３６(６)表３㊀病例两次发病采样时间与血培养报阳时间T a b ．３㊀S a m p l i n g t i m e a n db l o o d c u l t u r e p o s i t i v e r e po r t t i m e i n t w o o n s e t o f t h e c a s e s病例编号首次发病采样时间血培养报阳时间(h)二次发病采样时间血培养报阳时间(h)１２０１４．０５．２４６９．６２０１５．０１．１６５５．９２２２０１４．０５．２８６０．７２２０１４．０９．２０６４．５２３２０１４．０９．０１７０．３３２０１５．０４．１０６８４２０１４．０７．１８６２．４２０１５．０３．０５６９．６S １ＧS ８为编号S １至S ８的菌株,M 为N E B１００b p Ma r k e r .图１㊀S １ＧS ８菌株B C S P ３１ＧP C R 扩增结果F i g ．１㊀B C S P ３１ＧP C Ra m pl i f i c a t i o n r e s u l t s o f S １ＧS ８s t r a i ns S １ＧS ８为编号S １至S ８的菌株,M 为N E B１００b p Ma r k e r .图２㊀S １ＧS ８菌株A M O S ＧP C R 扩增结果F i g ．２㊀A M O S ＧP C Ra m pl i f i c a t i o n r e s u l t s o f S １ＧS ８s t r a i n s ２．３㊀分离菌株的M L V A Ｇ１６分型鉴定结果㊀８株菌按照每个位点上能够扩增出的基因片段大小及其重复片段的大小换算重复片段的个数见表.M L V A Ｇ１６分型的P a n e l １包括８个位点:B r u c e ０６㊁０８㊁１１㊁１２㊁４２㊁４３㊁４５㊁５５,P a n e l ２A 包括３个位点:B r u c e １８㊁１９㊁２１,P a n e l ２B 包括５个位点:B r u c e ０４㊁０７㊁０９㊁１６㊁３０.结果显示,变异最大的位点是P a n e l ２B 的B r u c e ０４,其次为P a n e l １的B r u c e ４３位点和P a n e l ２B 的B r u c e １６位点.通过M L V A Ｇ１６分型方法可将８株布鲁氏菌分为７种不同的基因型,在数据库中均不能找到完全对应的基因型,故自定义为１Ｇ７型.按照P a n e l １的结果分型可分为３种基因型:３个基因型均在数据库中存在,分别为４２(１Ｇ５Ｇ３Ｇ１３Ｇ２Ｇ２Ｇ３Ｇ２,N＝４),６３(１Ｇ５Ｇ３Ｇ１３Ｇ２Ｇ３Ｇ３Ｇ２,N＝２),１１４(１Ｇ５Ｇ３Ｇ１３Ｇ２Ｇ１Ｇ３Ｇ２,N＝２),各菌株１６个位点的重复单元个数见表４.结果显示,４个病例中有１例两次发病时间间隔较短的患者的两株分离菌株的M L ＧV A Ｇ１６分型完全一致,提示为复发.另外３例两次发病时间间隔较长的病人前后两次发病分离到的菌株的M L V A Ｇ１６分型是不同的,分别各有一个位点的差异,其中两位病人的差异在B r u c e ０４位点,１例病人的差异在B r u c e １６位点.表４㊀８株布鲁菌分离株M L V A Ｇ１６基因分型T a b ．４㊀M L V A Ｇ１６g e n o t y p i n g o f ８B r u c e l l a i s o l a t e s 病例编号菌株编号M L V A Ｇ１６各位点重复单元个数P a n e l １分型M L V A Ｇ１６分型１S １１Ｇ５Ｇ３Ｇ１３Ｇ２Ｇ３Ｇ３Ｇ２Ｇ４Ｇ２１Ｇ８Ｇ７Ｇ４Ｇ４Ｇ５Ｇ５６３１S ２１Ｇ５Ｇ３Ｇ１３Ｇ２Ｇ３Ｇ３Ｇ２Ｇ４Ｇ２１Ｇ８Ｇ９Ｇ４Ｇ４Ｇ５Ｇ５６３２２S ３１Ｇ５Ｇ３Ｇ１３Ｇ２Ｇ２Ｇ３Ｇ２Ｇ４Ｇ２１Ｇ８Ｇ４Ｇ４Ｇ３Ｇ７Ｇ５４２３S ４１Ｇ５Ｇ３Ｇ１３Ｇ２Ｇ２Ｇ３Ｇ２Ｇ４Ｇ２１Ｇ８Ｇ４Ｇ４Ｇ３Ｇ７Ｇ５４２３３S ５１Ｇ５Ｇ３Ｇ１３Ｇ２Ｇ３Ｇ３Ｇ２Ｇ４Ｇ２１Ｇ８Ｇ５Ｇ４Ｇ４Ｇ５Ｇ５４２４S ６１Ｇ５Ｇ３Ｇ１３Ｇ２Ｇ３Ｇ３Ｇ２Ｇ４Ｇ２１Ｇ８Ｇ４Ｇ４Ｇ４Ｇ５Ｇ５４２５４S ７１Ｇ５Ｇ３Ｇ１３Ｇ２Ｇ１Ｇ３Ｇ２Ｇ４Ｇ２１Ｇ８Ｇ３Ｇ４Ｇ３Ｇ８Ｇ６１１４６S ８１Ｇ５Ｇ３Ｇ１３Ｇ２Ｇ１Ｇ３Ｇ２Ｇ４Ｇ２１Ｇ８Ｇ３Ｇ４Ｇ３Ｇ７Ｇ６１１４７㊀㊀注:黑体数字为来源于同一个病例的两株菌株M L V A Ｇ１６分型中不同的位点.３㊀讨㊀论在很多国家,布病都被认为是重大公共卫生问题.尽管该病的病死率极低,但严重威胁着动物饲养㊁兽医㊁肉品加工等从业人员的身体健康,并给畜牧生产造成重大损失,还会影响旅游业及国际贸易的发展[１０].人感染布鲁氏菌可累及全身多个组织器官,临床表现为发热㊁多汗㊁乏力㊁关节肌肉疼痛等,急性期可以治愈,但不易被确诊,常迁延为慢性感染,慢性期布病患者可有肝㊁脾及睾丸肿大,关节和脊柱强直,肌腱挛缩变硬等,很难治愈,如引起脑炎和心肌炎者可致命,严重影响人类健康[８].由于布鲁氏菌感染机体后特殊的免疫病理反应,布病患者存在复发和重复感染的现象.而鉴别复发和重复感染,无论是对指导布病患者的治疗,还是对布病患者的感染来源进行追溯和管理都具有重要的意义.目前临床上布病的检测主要使用血清学检验技术,诊断也主要依赖于血清抗体的检测结果.但血清学检测方法无法鉴别复发和重复感染,也无法对布病进行病原学分型以及感染来源的追踪溯源.人７１５６期吕燕宁,等:M L V A 分型在布鲁氏菌临床分离株中的应用探索布鲁氏菌病诊断的金标准是从感染者的血液或者其他临床样本中分离出布鲁氏菌,对分离的病原进行病原学特征的分析对病人的诊断具有重要意义.目前布鲁氏菌的分型方法有很多种,各有优缺点. M L V A分型由于具有快速㊁操作简单㊁成本低廉㊁重复性好的优点,可鉴别到生物型水平,且便于实验室之间进行比较等特点,使用较为广泛.M L V A分型方法由L eF l e c h e等[１１]提出,方案是对１５个位点进行分析.之后,A lＧD a h o u k等人在此基础上增加了B r u c e１９位点[１２],将其调整为１６个位点.其中P a n e l１包括B r u c e０６㊁０８㊁１１㊁１２㊁４２㊁４３㊁４５和５５共８个位点,适用于布鲁氏菌种间比较;P a n e l２A包括B r u c e１８㊁１９和２１共３个位点,P a n e l２B包括B r u c e ０４㊁０７㊁０９㊁１６和３０共５个位点,P a n e l２适合用于基因型的比较.G a r c i aＧY o l d i D等[１３]研究认为,M L V A是唯一一种能揭示布病暴发和确定储存宿主的方法.该方法还可作为流行病学调查的工具,用来确定传染源及传播途径,并找到菌株之间的关联[１４],通过对菌株进行聚类分析,得知感染来源是否相关[１５].本研究利用M L V AＧ１６的分型方法对来源于４例先后两次发病的布病患者的８株分离菌株进行鉴定分析,探索该方法对布病复发和重复感染的鉴别诊断意义.本研究首先采用B C S P３１ＧP C R方法确定了８株分离菌株均为布鲁氏菌;通过AMO SＧP C R方法确定了其均为羊种布鲁氏菌.再通过M L V AＧ１６方法将收集到的８株菌株分为了７种基因型.没有任何一株可以和布鲁氏菌M L V A数据库中的菌株相匹配.我们认为这主要是由于数据库中的大部分数据都是由外国学者研究㊁上传的.因不同地区,不同地域流行的布鲁氏菌菌株不同,因此出现了基因型没有对应的情况,且从２０世纪６０年代中期至今,北京地区未曾系统开展布病细菌学方面的研究工作,布病的病原学资料为空白.因此确实存在北京地区布鲁菌菌株和其他地区区别较大的可能.此外,没有在数据库中找到相对应的菌株也从另一方面说明北京地区的布鲁氏菌型别的分布和其他地区可能存在较大的区别[１６].M L V AＧ１６结果分析显示,８株菌P a n e l２B的B r u c e０４位点V N T R个数的变化最大,该位点多样性最高,其分辨率也最高.其次是P a n e l１的B r u c e４３和P a n e l２B的B r u c e１６位点,而其他位点多样性较低,这与很多研究结果一致[１７Ｇ２１].１㊁３㊁４号患者于不同时间㊁两次发病后分离的菌株S１和S２㊁S５和S６㊁S７和S８６株菌株的M L V AＧ１６分型均不同.S１和S２㊁S５和S６㊁S７和S８各分别相差１个位点,提示患者二次发病为重复感染,而非复发.而２号患者的前后两次发病分离到的菌株M L V AＧ１６分型完全一致,提示该患者的再次发病为复发, K i l i cS．等人的研究也认为同一患者初次发病与复发分离到的菌株,其M L V AＧ１６的分型是一致的[２２].有研究显示布病复发多发生在首次发病治愈后的半年之内[６],而２号患者两次发病的时间间隔为１１２d,在３~４个月之间,也提示其二次发病为复发而非重复感染.１㊁３㊁４号患者的二次发病时间分别为２３７㊁２７６和２３４d,为８~９月左右,两次发病的时间间隔较长,这也提示其二次发病为重复感染的可能性较大.有研究认为首发布病以发烧㊁发冷㊁出汗㊁头痛㊁头晕症状为主,关节疼痛症状较轻,复发性布病的临床症状则与前者相反[６].也有学者认为复发为布病的慢性化,而重复感染则为急性布病的表现,二者在实验室检查上很难做鉴别,但二者的临床表现是有明显不同的,临床医生需要对就诊的布病患者进行详细深入的询问,耐心细致的检查,才会在相关的症状㊁体征上发现一些差别,从而做出鉴别[７].本研究的结果表明,如果能够从患者体内分到病原,结合临床表现,发病时间间隔㊁以及流行病学史等多方面的信息,对分离株的病原学特征进行分析有助于对布病的复发和重复感染进行鉴别诊断,M L V AＧ１６分型方法对不同菌株之间的差异具有较高的分辨率,可作为布病复发和重复感染鉴别诊断的有效手段之一.利益冲突:无引用本文格式:吕燕宁,陈丽娟,李仁清,等．M L V A分型在布鲁氏菌临床分离株中的应用探索[J]．中国人兽共患病学报,２０２０,３６(６):５１４Ｇ５１９．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０２０．００．０６５参考文献:[１]国务院．中华人民共和国传染病防治法[J]．中华人民共和国国务院公报,２００４,３１:４Ｇ１５．[２]王大力,李晔．布鲁杆菌病防控策略的回顾与思考[J]．中华地方病学杂志,２０１５,３４(５):３１３Ｇ３１４．D O I:１０．３７６０/c m 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l e c h e P,J a c q u e s I,G r a y o nM,e t a l．E v a l u a t i o n a n d s e l e cＧt i o no f t a n d e mr e p e a t l o c i f o r a B r u c e l l a M L V At y p i n g a s s a y [J]．B M C m i c r o b i o l o g y,２００６,６:９．D O I:１０．１１８６/１４７１Ｇ２１８０Ｇ６Ｇ９[１２]A lD a h o u kS,F l e c h e P L,N o c k l e rK,e t a l．E v a l u a t i o n o f B r uＧc e l l a M L V A t y p i n g f o rh u m a n b r u c e l l o s i s[J]．J M i c r o b i o lm e t h o d s,２００７,６９(１):１３７Ｇ１４５．D O I:１０．１０１６/j．m i m e t．２００６．１２．０１５[１３]G a r c i aＧY o l d i D,L e F l e c h e P,D eM i g u e lM J,e t a l．C o m p a r i s o n o fm u l t i p l eＧl o c u sv a r i a b l eＧn u m b e r t a n d e mＧr e p e a t a n a l y s i sw i t h o t h e rP C RＧb a s e dm e t h o d s f o r t y p i n g B r u c e l l a s u i s i s o l a t e s[J]．JC l i n M i c r o b i o l,２００７,４５(１２):４０７０Ｇ４０７２．D O I:１０．１１２８/ J C M．０１０９６Ｇ０７[１４]刘志国,崔步云,刘日宏,等．布鲁菌分子分型方法应用研究进展[J]．中国人兽共患病学报,２０１５,３１(２):１６３Ｇ１６８．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０１５．０２．０１５[１５]L i uZ G,W a n g L J,P i a oD R,e t a l．M o l e c u l a r i n v e s t i g a t i o no f t h et r a n s m i s s i o n p a t t e r no f B r u c e l l as u i s３f r o mI n n e r M o n g o l i a,C h i n a[J]．F r o n tV e tS c i,２０１８,５(２９):２７１．D O I:１０．３３８９/ f v e t s．２０１８．００２７１[１６]M a J Y,W a n g H,Z h a n g X F,e t a l．M L V Aa n d M L S Tt y p i n g o f B r u c e l l a f r o m Q i n g h a i,C h i n a[J]．I n f e c tD i s p o v e r t y,２０１６,５(１):２６．D O I:１０．１１８６/s４０２４９Ｇ０１６Ｇ０１２３Ｇz[１７]J i a n g H,W a n g H,X uL,e t a l．M L V A g e n o t y p i n g o f B r u c e l l a m e l i t e n s i s a n d B r u c e l l aa b o r t u s i s o l a t e s f r o m d i f f e r e n t a n i m a l s p e c i e s a n dh u m a n sa n d i d e n t i f i c a t i o no f B r u c e l l as u i s v a c c i n e s t r a i nS２f r o m c a t t l e i n C h i n a[J]．P L o S O n e,２０１３,８(１０): e７６３３２．D O I:１０．１３７１/j o u r n a l．p o n e．００７６３３２[１８]X i a oP,Y a n g H,D iD,e ta l．G e n o t y p i n g o fh u m a nB r u c e l l a m e l i t e n s i s b i o v a r３i s o l a t e df r o m S h a n x iP r o v i n c e i nC h i n ab y M L V A１６a n dHO O F[J]．P L o S O n e,２０１５,１０(１):e０１１５９３２．D O I:１０．１３７１/j o u r n a l．p o n e．０１１５９３２[１９]S u n MJ,D i D D,L i Y,e t a l．G e n o t y p i n g o f B r u c e l l am e l i t e nＧs i s a n d B r u c e l l aa b o r t u s s t r a i n sc u r r e n t l y c i r c u l a t i n g i n X i nＧj i a n g,C h i n a[J]．I n f e c tG e n e tE v o l,２０１６,４４:５２２Ｇ５２９．D O I:１０．１０１６/j．m e e g i d．２０１６．０７．０２５[２０]S u n M,J i n g Z,D iD,e ta l．M u l t i p l e l o c u sv a r i a b l eＧn u m b e r t a n d e mＧr e p e a t a n ds i n g l eＧn u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s mＧb a s e d B r uＧc e l l a t y p i n g r e v e a l s m u l t i p l el i n e a g e si n B r u c e l l a m e l i t e n s i s c u r r e n t l y e nde m i c i nC h i n a[J]．F r o n tV e tS c i,２０１７,４:２１５．D O I:１０．３３８９/f v e t s．２０１７．００２１５[２１]L i uZ G,D i D D,W a n g M,e t a l．M L V A g e n o t y p i n g c h a r a c t e rＧi s t i c s o fh u m a n B r u c e l l a m e l i t e n s i s i s o l a t e df r o m U l a n q a bo f I n n e rM o n g o l i a,C h i n a[J]．F r o n tM i c r o b i o l,２０１７,８:６．D O I:１０．３３８９/f m i c b．２０１７．００００６[２２]K i l i cS,I v a n o vI N,D u r m a zR,e ta l．M u l t i p l eＧl o c u sv a r i a b l eＧn u m b e r t a n d e mＧr e p e a t a n a l y s i s g e n o t y p i n g o fh u m a n B r u c e l l a i s o l a t e s f r o mt u r k e y[J]．JC l i n M i c r o b i o l,２０１１,４９(９):３２７６Ｇ３２８３．D O I:１０．１１２８/J C M．０２５３８Ｇ１０收稿日期:２０１９Ｇ０６Ｇ０５㊀编辑:王晓欢９１５６期吕燕宁,等:M L V A分型在布鲁氏菌临床分离株中的应用探索。
MLVA分型技术和实验操作步骤
MLVA分型技术和实验操作步骤MLVA（Multiple-locus variable-number tandem repeats analysis）是一种基于串联重复序列的多位点变异分析技术，被广泛应用于分子流行病学研究、病原体溯源及种群进化研究等领域。
在MLVA分型实验中，主要包括DNA提取、PCR扩增、电泳分离、数据分析等步骤。
一、DNA提取1.取样：将待检测的细菌菌落均匀悬浮于蒸馏水或生理盐水中。
2.破碎细胞壁：向细菌悬液中加入适量的蛋白酶K、裂解液等破壁酶，使细菌细胞壁受损。
3.提取DNA：采用常规的DNA提取试剂盒或酚/氯仿法提取DNA，并通过紫外分光光度计检测DNA浓度。
二、PCR扩增1.设计引物：设计针对多个串联重复序列位点的引物，确保能够覆盖目标序列的全部变异位点。
2. PCR反应：将DNA模板与引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲溶液混合后进行PCR扩增反应。
3.PCR程序：- 95°C 5min（变性）-95°C30s（变性）-55-65°C30s（退火）- 72°C 1min（延伸）-以上步骤循环30-40次- 最终72°C延伸5min-4°C保温三、电泳分离1.准备电泳试剂：加载样品前，需将PCR产物与DNA标记物混合，再加载至琼脂糖凝胶槽中。
2.电泳运行：依据PCR产品大小，选择合适的电泳条件，并运行电泳。
3.数据采集：使用相应的电泳成像系统对电泳凝胶进行成像，记录PCR产物的条带模式。
四、数据分析1.解读PCR产物：根据电泳图谱，对PCR产物的条带进行测量、编号，记录每个位点的大小。
2.分析数据：通过比对各个样品的PCR产物大小序列，进行多位点变异分析。
3.构建分型记录：利用PCR产物的大小序列信息，构建每个样品的MLVA分型记录。
4.分型分析：比对不同样品之间的分型记录，进行聚类分析、构建谱系树等，揭示不同样品之间的亲缘关系。
MLVA分型技术和实验操作步骤
MLVA分型技术和实验操作步骤MLVA（多重定量PCR分型技术）是一种基于多重PCR扩增的分型技术，它可以用来对细菌进行分型和鉴定，并用于疫情的追踪和溯源。
下面是MLVA分型技术的实验操作步骤：1.提取细菌基因组DNA：从细菌菌落或液体培养物中提取基因组DNA。
可以使用商业化的基因组DNA提取试剂盒来进行提取，按照说明书中的步骤进行操作。
2.设计引物和预扩增：根据待测菌株的基因组序列，设计适用于目标DNA片段的引物。
引物应该选择在基因组中具有高度保守性的区域，以确保反应的特异性。
将设计好的引物与提取到的DNA进行预扩增。
预扩增是将样品中的目标片段DNA扩增到足够的浓度，以确保后续的扩增反应。
3. MLVA引物的选择：根据待测菌株基因组中的微卫星重复序列，设计MLVA引物。
微卫星重复序列（也称作SSR或简单重复序列）是一种相对较短（1-6bp）的DNA序列，在基因组中重复出现。
这些引物将扩增微卫星重复序列及其周围的DNA区域。
4.MLVA引物的扩增：将设计好的MLVA引物与预扩增的DNA模板混合，进行PCR扩增。
PCR扩增反应中的引物浓度、缓冲液组成、降低PCR抑制物质（如血红素和其他化合物）对扩增反应的成功至关重要。
5.扩增产物的测定和分析：将PCR扩增产物进行凝胶电泳，可以用琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳或自动测序进行分析。
分析产物的大小差异，可以判断不同菌株的差异。
总结起来，MLVA分型技术是一种基于PCR扩增的分型技术，它通过设计特异的引物，扩增目标DNA片段，并通过凝胶电泳等方法对扩增产物进行分析和解释，从而实现对细菌的分型和鉴定。
这项技术在疫情追踪和溯源中具有重要的应用价值。
布鲁氏菌实验室检测
S:5`- GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3` ⑸ IS711-specific primer ：
IS:5`- TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3`
全血玻片凝集反应在一张清洁的破片上加1滴赫德逊氏反应抗原然后在抗原上加1滴受检血液或关节腔内积液可用加样器吸头使其混匀在酒精灯上稍微加热促进反应在8分钟内观察结果凡在此时间内出现凝集者为阳性
布鲁氏菌实验室检测
微生物室 2013年8月 蚌埠
1、布鲁氏菌分离培养（抗原） 2、布病血清学检测（抗体） 3、分子生物学分型方法（菌株分型） 4、实验室生物安全和质量控制
种水平的鉴定(AMOS-PCR)
⑴ B. abortus-specific priTTTTCCAATCCC-3` ⑵ B. melitensis-specific primer ：
M: 5`- AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA ⑶ B. ovis-specific primer ：
扩增条件： 25ul 反应体系：水，16.9ul；10*buffer, 2.5ul；dNTPs （2,5ML）, 2ul; A,M,O,S引物（10mM）, 各0.4ul；IS引
物（10mM）,0.8ul； DNA（30ng）, 1ul；Taq 1u （5U/ul ，0.2ul）。
反应条件： 95℃ 5分钟； 95℃ 30秒，56℃ 45秒，72℃, 1分钟； 28个循环； 72℃ 5 分钟。
a:BSL-3， b:BSL-2，c: BSL-1
质量控制
耗材（小试管） 试剂（下发） 对照（阳性、阴性） 温度 考核
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核酸测序 确定重复模式
确认重复序列和重复单元数 14个确定指标
区分效能评价
9个指标的MLVA策略
21
串联重复的鉴定
TRF 软件
（Tandem Repeats Finder software）
://minisatellites.u-psud.fr/
• • • • 匹配赋2分 不匹配-3分 碱基缺失-5分 最小报告分值50分
98HAH12 SC84
22
串联重复的鉴定
23
串联重复的鉴定
Indices 1858865--1858900 1862974--1863158 1867321--1867363 Period Size 12 46 16 Copy Number 3.0 3.9 2.6 Consensus Size 12 46 16 Percent Matches 70 78 70 Percent Indels 0 4 7 Score 52 228 52 A 36 22 25 C 5 23 25 G 33 12 13 T 25 40 34 Entropy (0-2) 1.79 1.89 1.93
PCR primers:
CTCCCACACCCAGGACAC PCR CGGCCTACCCAACATTCC
230 bp
strain H37Rv : 215 bp
300 bp 200 bp
Gel migration
strain CDC1551 : 230 bp
测序分析
230 bp 215 bp 200 bp 7
Tandem repeat sequence
CGTTAAGCAAATCCTAGACAAAATAGGAAATCGAAGCAGATAGCTTCAATCAAGGAGATTT ATCTTTTTGCCAGAATTTGTAGCTCGAATTCAACTAAGATTAAGATAGAGGA AGCAGCCTGTAGTTGAGGCACCTGTAGAGGAAGTTGTAG CAAGAAAAAATGGTCCATTCTCGCCGTTGCGCCTTTCCAGTTTCTTGGGCG ATATTGAAACCTCTGAAAAACAGATGCCAAGTATTGTGAACGACAATGTCGTAACACCTGA AAAGCAAATGGCTAATAAAGAGAACGATA AAGGTCCGGTGGACCTTTTTATCATGAGCATGAAAACAAGAAAGCGAATT CGTTGCTGGTACCGTAGCAGTTGCATCAGT AAAATATAGA CCAGAAGAGCCAAAACAAGACGCTCCACAAGCGCCATCAACACCGGAAAAACAAACAGAA GAACCGAACAAGGAAGAACCTAAGAAAACACCACAAGCGCCATCGACTCCGGAA AAACAACCAGAAGTACCGGAATCACCAAACCCAGAGACACCAGACGCGCCATCGA CTCCAAAAGATGAACCGCAAGCTCCATCAATCCCAGAAGAAAAACCAAAAGTA GAGCA
24
串联重复的鉴定
25
26
inserted a small segment
泳道 菌号
1 SC22
2 NJ25
3 9802
4 9801
5 GZ1
6 89-1591
7 P1/7
8 R735
9 ATCC43765
10 11611
11 HASS-73
12 SC061001
13 SC06238
14 06GZ1
2 1
3 2
3 3
1 0
36 26
ST1 ST81
+ + - - -
1.7 1
10
分析软件：BioNumerics
• 命名MLVA型：MT1-MT85
• 评价各位点的分辨力：
Nei’s index = 1-Σ (allele frequency)2 • 评价MLVA方法的分辨力： Simpson's index = 1 - Σ [nj (nj-1)]/[N (N-1)]
菌株名称 GZ1 P1/7 05ZYH33
血清型 2 2 2 2 2
来源 (CP000837) (www.sanger.ac.u k) (NC_009442) (NC_009443)
ST 型 ST1 ST1 ST7 ST7 ST7
• 以猪链球菌为例： • 鉴定了750,749,790,784 • 测序菌株基因组串联重复位点的比较
100 bp
VNTR和等位基因
下游序列
VNTR 重复 Primer-F
atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgat
上游序列 Primer-R
重复拷贝数 =
扩增大小-上下游序列 重复单元的大小
取整：就近取整或去除小数取整
8
串联重复序列可变重复数目的判定
9
MLVA方法
4
VNTR
• VNTR：可变数目出那里重复序列， Variable Number of Tandem Repeats •
重复单元
AACTTTACGTTC AAATTAACGTTC AAATTAACGTTC AAATTTACCTTG
侧 翼 序 列
5
18bp*3
• AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGC TGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGG GCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCA GGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGA
217185--217309
12
9.7
12
58
14
87
27
16
34
21
1.95
29
第三部分
MLVA方法在猪链球菌分型中的应用
30
猪链球菌暴发疫情
• 2005年-四川人感染猪 链球菌暴发疫情 • 215人感染、39人死亡 • 波及四川36个县的202 个村庄 • 重庆， 贵州， 广东， 江西也发现病例
• SmaI酶切：ST7型分为单一的PFGE-01型 • 2005，2006年和2007年中国ST7菌株： PFGE-01型
Ye, et al. 2006. Emerg.Infect.Dis.
32
猪链球菌MLVA指标和特征
cod e Location in GZ1 Locus§ Matches In GZ1 % Tm℃
using arithmetic averages)
• 等分权重 • 分类图/最小生成树的形式展现 • 多态性指数： Simpson’s index
16
MLVA方法的应用
• • • • • • • • • • • • • • Neisseria meningitidis(23) Streptococcus pneumoniae(20), Streptococcus uberis(12), Salmonella Enteritidis(10), Salmonella enterica(5,35), Listeria monocytogenes(28,29,39), Legionella pneumophila(33), Clostridium perfringens(37), Leptospira interrogan(38,38), Escherichia coli O157:H7(30,46), Clostridium difficile(43), Burkholderia pseudomallei(42), Pseudomonas aeruginosa(32), Shigella spp(13) et.al..
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
LN1
GX2
CQ1
GZ2
SC17
SC84
4380032
4380026
RC4716
Gx407
27
28
多种重复模式
TR2
Indices 217182--217298 217182--217291 217221--217313 Period Size 24 15 39 Copy Number 4.5 8.1 2.4 Consensus Size 24 14 39 Percent Matches 61 57 94 Percent Indels 18 18 1 Score 96 77 171 A 27 27 25 C 16 17 16 G 35 35 34 T 21 20 23 Entropy (0-2) 1.94 1.94 1.95
• 聚类分析 • 构建最小生成树
11
MLVA 实验操作
• • • • • • • • 一、模Байду номын сангаас制备：DNA提取模板或水煮模板 二、PCR 扩增 多重PCR反应 三、扩增条带大小判断： （一）毛细管电泳： 1.引物标记 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ） 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带）
VNTR产生的原因：聚合酶的滑链复制
6
VNTR 位点的确定
TRF 软件（Tandem Repeats Finder software）， ://minisatellites.u-psud.fr/
Strain H37Rv: 4 x 15 bp Strain CDC1551: 5 x 15 bp
215 bp
• • • • 多位点可变数目串联重复序列分析 可变数目串联重复：VNTR： MLVA方法：即VNTR的数组 例如：
其他特征
MLVA1型别 菌株 血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST