土壤中微生物的分离纯化(课堂PPT)
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实验三微生物的分离纯化与观察ppt课件
福建农林大学生命科学学院
实验二 微生物的分离纯化、
接种培养与保藏
福建农林大学生命科学学院
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平板分离的方法主要有：
1、平板划线分离法； 2、稀释涂布平板法。
除能有效分离纯化微生物外 ，还可用于测定样品中活菌 数量。
福建农林大学生命科学学院
土壤中微生物数量众多，在肥沃土壤中固氮 菌数量也很多，自然界中多数氮素养料是由微生 物固氮的结果，固氮菌一般可分为自生固氮菌和 共生固氮菌两类。
精灯等。
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四 方法与步骤
（一）富集培养： • 1、用已灭菌后冷却至50oC左右的阿斯毕培
养基倒成平板。 • 2、用已灭菌的镊子将黄豆粒大的菜园土摆
入已冷凝的平板培养基上。 • 3、正面放置培养箱中培养，28oC培养3~4
天后，在土粒周围有混浊半透明的胶状菌 落出现，有的在后期会产生褐色的色素。
• 1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿斯毕培养基斜 面试管中，28oC培养4天。
• 2、镜检：将斜面菌株进行涂片、染色、镜检。如是粗短 杆状或球状的单一形态的菌体细胞较大，常呈单个或“8” 字排列，在细胞表面有较厚的荚膜者，即为自生固氮菌。 如有杂菌，需要进一步划线纯化。
• 3、将得到纯化菌株，移接到另一阿斯毕培养基斜面管， 28oC培养3~4天，即获得纯培养菌，可冷冻保存，备用。
要分离自生固氮菌，常用阿斯毕无氮培养基 这种选择培养基，控制其适宜环境条件，使它在 培养基上大量繁殖，然后通过稀释法和划线分离 纯化法，使它在培养基上形成单菌落，如分离所 得不纯，需要进一步纯化，直到得到纯种.
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三 实验材料
• 1、培养基：阿斯毕无氮培养基。 • 2、菜园土。 • 3、灭菌培养皿、镊子、剪刀、接种针、酒
实验二 微生物的分离纯化、
接种培养与保藏
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平板分离的方法主要有：
1、平板划线分离法； 2、稀释涂布平板法。
除能有效分离纯化微生物外 ，还可用于测定样品中活菌 数量。
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土壤中微生物数量众多，在肥沃土壤中固氮 菌数量也很多，自然界中多数氮素养料是由微生 物固氮的结果，固氮菌一般可分为自生固氮菌和 共生固氮菌两类。
精灯等。
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四 方法与步骤
（一）富集培养： • 1、用已灭菌后冷却至50oC左右的阿斯毕培
养基倒成平板。 • 2、用已灭菌的镊子将黄豆粒大的菜园土摆
入已冷凝的平板培养基上。 • 3、正面放置培养箱中培养，28oC培养3~4
天后，在土粒周围有混浊半透明的胶状菌 落出现，有的在后期会产生褐色的色素。
• 1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿斯毕培养基斜 面试管中，28oC培养4天。
• 2、镜检：将斜面菌株进行涂片、染色、镜检。如是粗短 杆状或球状的单一形态的菌体细胞较大，常呈单个或“8” 字排列，在细胞表面有较厚的荚膜者，即为自生固氮菌。 如有杂菌，需要进一步划线纯化。
• 3、将得到纯化菌株，移接到另一阿斯毕培养基斜面管， 28oC培养3~4天，即获得纯培养菌，可冷冻保存，备用。
要分离自生固氮菌，常用阿斯毕无氮培养基 这种选择培养基，控制其适宜环境条件，使它在 培养基上大量繁殖，然后通过稀释法和划线分离 纯化法，使它在培养基上形成单菌落，如分离所 得不纯，需要进一步纯化，直到得到纯种.
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三 实验材料
• 1、培养基：阿斯毕无氮培养基。 • 2、菜园土。 • 3、灭菌培养皿、镊子、剪刀、接种针、酒
土壤微生物的分离筛选 ppt课件
ppt课件
5
ppt课件
6
概念 筛选及纯化的方法 培养基的选择
细菌的筛选：选择性培养基 根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化
学、物理因素的抗性而设计的培养基。其功能是
使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该
菌的筛选效率。
ppt课件
7
概念 筛选及纯化的方法 培养基的选择
细菌的保存：牛肉膏蛋白胨培养基 配方（g）：牛肉膏3,蛋白胨10,氯化钠5，琼脂15,
蒸馏水1000ml，pH7.2。
ppt课件
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二、微生物筛选纯化的流程
富
梯
涂
样
集
度
布
品
培
稀培ຫໍສະໝຸດ 养释养平
板
斜
划
面
线
保
纯
存
化
ppt课件
9
三 微生物筛选纯化的操作
注意事项： ①筛选之前，提前制作好试验用的培养基。 ②与培养微生物相关的试验器材需要灭菌，方法为 在 121 ℃的条件下高压灭菌20分钟。 ③与微生物相关的操作需要在无菌操作台上进行。 操作之前15分钟打开紫外灯。
土壤是微生物的大本营，混杂着大量的微生物， 从中分离可得到只含有一种微生物的纯培养。
ppt课件
4
概念 筛选及纯化的方法 培养基的选择
微生物筛选的方法有：稀释涂布法和平板划线法。
稀释涂布法：将土壤溶液稀释成一定的梯度，将其 涂布到固体平板培养基上。
平板划线法：挑取稀释涂布后长出的菌落，在固体 平板培养基上划线培养，获取纯菌落。
ppt课件
19
将接种菌株的斜面放入4 ℃冰箱中保存。 至此，已经完成了微生物的初筛。有关微 生物的更多信息可以用鉴别培养基对其进 行复筛，或者运用其他手段对其进行鉴别。
土壤中微生物的分离_PPT幻灯片
• 实验目的：
1、学会倒平板 2、了解土壤中微生物分离方法 3、学会稀释涂布平板计数法对微生物计数
微生物的分离及稀释平板法计数
（1）倾注平板法 (混合平板法)
（2）涂布平板法
稀释到适量浓度
倾注或涂布平板
培养
菌落计数
实验安排
• 10-710-610-5 稀释度为细菌培养,肉汤蛋白胨 培养基
• 10-5
• 10-510-410-3 稀释度为真菌培养,马丁氏培养 基
每个梯度3个平行，所以每种菌需要9块平板, 注意标记
• 培养 将细菌、真菌、放线菌培养基倒置于28度培养箱 中培养3-5d；统计所长出的菌落数；
• 挑菌（纯化） 将培养后长出的单菌落数量、形态、培养特征进 行观察，分别挑取单菌落于相应平板上划线、分离， 培养，检查菌落是否一致、单纯（也可以用显微镜 涂片染色镜检是否是单一的微生物），如有杂菌需 进一步纯化、分离。
一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示原 样品中的细胞数。
三、作业
• 利用涂布平板法对土壤样品进行活菌计数
菌落计数 ：
稀
10-4
释
度
10-5
10-6
平板中的 细 1 2 3 平 1 2 3 平 1 2 3 平
CFU数 菌
均
均
均
放 线 菌
真 菌
• 每克含菌样品中细菌/放线菌/真菌 活细胞数＝ （同一稀释度平板上菌落平均数× 10×稀释倍数× 10 ） 含菌样品克数
土壤细菌的分离及纯化课件
生物塑料合成
02
土壤细菌可以用于合成生物塑料，如聚羟基脂肪酸酯（PHA）
。
蛋白质和酶的生产
03
土壤细菌可以用于生产各种酶和蛋白质，广泛应用于食品、医
药、化工等领域。
05 土壤细菌的研究前景
土壤细菌的基因组学研究
土壤细菌基因组学研究有助于揭示土壤细菌的 多样性和进化机制，为土壤生态系统的功能和 稳定性提供基础数据。
01
02
03
稀释涂布平板法
将土壤样品稀释后涂布在 培养基平板上，通过培养 获得单菌落。
划线分离法
将土壤样品划线接种在培 养基平板上，通过培养获 得单菌落。
富集培养法
通过选择特定的培养基和 培养条件，使目标细菌大 量繁殖，再从中分离。
分离步骤
2. 制备培养基
根据分离目标选择适合的培养 基配方，按照要求制备培养基 。
通过研究土壤细菌的代谢途径，可以发现新的生物合 成途径和酶，为生物工程和生物制药等领域提供新的
资源和工具。
代谢途径研究还可以帮助了解土壤细菌在碳循环、氮 循环和硫循环等过程中的作用，为环境保护和农业可
持续发展提供理论支持。
土壤细菌的生态学研究
1
土壤细菌的生态学研究有助于深入了解土壤生态 系统的结构和功能，以及土壤细菌与其他微生物 和动植物之间的相互作用。
纯化步骤
样品采集
采集具有代表性的土 壤样品，保证样品无 污染。
样品处理
将土壤样品进行破碎 、研磨、稀释等处理 ，使细菌充分释放。
分离纯化
根据纯化方法的不同 ，在固体或液体培养 基上进行细菌的分离 纯化。
菌落观察
观察菌落的形态、颜 色、大小等特征，初 步判断细菌的种类。
实验-土壤中细菌的分离与纯化PPT课件
1. 试拟出从土壤中分离芽孢杆菌的主要实验步 骤。
2. 如何检验平板上某个单菌落是不是纯培养？
2021
2021制备土壤稀释液制备土壤稀释液涂布平板涂布平板培养培养挑菌落挑菌落平板划线分离平板划线分离转入斜面转入斜面观察菌落特征制片镜检菌体形态观察菌落特征制片镜检菌体形态菌种保藏菌种保藏2021制备土壤稀释液制备土壤稀释液2021涂布涂布2021培养
实验十
微生物的分离与纯化
2021
一、目的要求
1. 掌握土壤微生物的分离纯化方法和无菌操作 技术；
平板线法
平板划线分离的方法
1.斜线法；2.曲线法；3.方格法；4.放射法；5.四格法
2021
四、操作步骤（6）
平板划线分离
2021
四、操作步骤（7）
6. 转入斜面
斜面接种时的无菌操作
(1)接种灭菌; (2)开启棉塞; (3)管口灭20菌21; (4)挑起菌苔; (5)接种; (6)塞好棉塞
六、思考题
2021
三、实验器材
1. 土样：采集校园土壤
2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基——细菌
3.
高氏Ⅰ号培养基——放线菌
4.
马丁氏培养基——真菌
3. 其他：无菌的培养皿、盛90mL无菌水并带 玻璃珠的三角瓶、盛9mL无菌水的试管、小 铁铲、吸头、移液器、无菌玻璃涂棒、接种 环、显微镜、染色液等。
2021
四、操作步骤（1）
于28℃培养箱中培养3~5 d，牛肉膏蛋白胨培养基平板 倒置于37℃培养箱中培养2~3 d。
2021
四、操作步骤（5）
4. 挑菌落
接种和分离工具
1. 接种针；2.接种环；3.接种钩；4.5.玻20璃21涂棒；6.接种圈；7.接种锄；8.小解剖刀
2. 如何检验平板上某个单菌落是不是纯培养？
2021
2021制备土壤稀释液制备土壤稀释液涂布平板涂布平板培养培养挑菌落挑菌落平板划线分离平板划线分离转入斜面转入斜面观察菌落特征制片镜检菌体形态观察菌落特征制片镜检菌体形态菌种保藏菌种保藏2021制备土壤稀释液制备土壤稀释液2021涂布涂布2021培养
实验十
微生物的分离与纯化
2021
一、目的要求
1. 掌握土壤微生物的分离纯化方法和无菌操作 技术；
平板线法
平板划线分离的方法
1.斜线法；2.曲线法；3.方格法；4.放射法；5.四格法
2021
四、操作步骤（6）
平板划线分离
2021
四、操作步骤（7）
6. 转入斜面
斜面接种时的无菌操作
(1)接种灭菌; (2)开启棉塞; (3)管口灭20菌21; (4)挑起菌苔; (5)接种; (6)塞好棉塞
六、思考题
2021
三、实验器材
1. 土样：采集校园土壤
2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基——细菌
3.
高氏Ⅰ号培养基——放线菌
4.
马丁氏培养基——真菌
3. 其他：无菌的培养皿、盛90mL无菌水并带 玻璃珠的三角瓶、盛9mL无菌水的试管、小 铁铲、吸头、移液器、无菌玻璃涂棒、接种 环、显微镜、染色液等。
2021
四、操作步骤（1）
于28℃培养箱中培养3~5 d，牛肉膏蛋白胨培养基平板 倒置于37℃培养箱中培养2~3 d。
2021
四、操作步骤（5）
4. 挑菌落
接种和分离工具
1. 接种针；2.接种环；3.接种钩；4.5.玻20璃21涂棒；6.接种圈；7.接种锄；8.小解剖刀
土壤微生物PPT课件
物质循环
土壤微生物在碳、氮、磷、硫等元 素的生物地球化学循环中起着重要 作用，如固氮、硝化、反硝化、硫
化等过程。
能量流动
土壤微生物通过分解有机物质释放 能量，供自身和其他生物利用。
土壤结构形成与改良
微生物通过分泌多糖等胶结物质促 进土壤团聚体形成，改善土壤结构 ；同时参与土壤有机质分解和腐殖 质形成，提高土壤肥力。
通过共代谢等途径，将有毒有害物质转化为无毒或低毒物 质。
修复重金属污染土 壤
通过生物吸附、生物转化等作用，降低土壤中重金属毒性 。
改善土壤结构
增加土壤团聚体稳定性，提高土壤抗侵蚀能力。
土壤微生物资源开发与利用的挑战
微生物资源多样性不足
目前已知可培养的土壤微生物种类有限，大量未知功能微生物资 源有待开发。
生物防治
某些微生物对植物病原菌具有拮抗 作用，可用于生物防治；同时微生 物还能产生多种抗生素和生长调节 物质，促进植物生长。
02
土壤微生物与土壤肥力
土壤微生物在养分循环中的作用
氮循环
土壤微生物参与氮的固定、硝化、反硝 化等过程，对氮素的转化和供应起重要 作用。
磷循环
微生物通过分解有机磷化合物，释放磷 元素供植物吸收利用，同时参与磷酸盐 的沉淀与溶解平ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
种类繁多、数量巨大、代谢类型多样、适应性强、繁殖迅速等。
土壤微生物的组成与分类
组成
土壤微生物主要由细菌、真菌、放线 菌、藻类和原生动物等组成，其中细 菌和真菌数量最多。
分类
根据形态、结构和功能等特征，土壤 微生物可分为自养型微生物（如硝化 细菌、蓝藻等）和异养型微生物（如 腐生细菌和真菌等）。
土壤微生物的生态功能
根据观察到的形态学特征，对微生物 进行初步分类和鉴定。
土壤微生物在碳、氮、磷、硫等元 素的生物地球化学循环中起着重要 作用，如固氮、硝化、反硝化、硫
化等过程。
能量流动
土壤微生物通过分解有机物质释放 能量，供自身和其他生物利用。
土壤结构形成与改良
微生物通过分泌多糖等胶结物质促 进土壤团聚体形成，改善土壤结构 ；同时参与土壤有机质分解和腐殖 质形成，提高土壤肥力。
通过共代谢等途径，将有毒有害物质转化为无毒或低毒物 质。
修复重金属污染土 壤
通过生物吸附、生物转化等作用，降低土壤中重金属毒性 。
改善土壤结构
增加土壤团聚体稳定性，提高土壤抗侵蚀能力。
土壤微生物资源开发与利用的挑战
微生物资源多样性不足
目前已知可培养的土壤微生物种类有限，大量未知功能微生物资 源有待开发。
生物防治
某些微生物对植物病原菌具有拮抗 作用，可用于生物防治；同时微生 物还能产生多种抗生素和生长调节 物质，促进植物生长。
02
土壤微生物与土壤肥力
土壤微生物在养分循环中的作用
氮循环
土壤微生物参与氮的固定、硝化、反硝 化等过程，对氮素的转化和供应起重要 作用。
磷循环
微生物通过分解有机磷化合物，释放磷 元素供植物吸收利用，同时参与磷酸盐 的沉淀与溶解平ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
种类繁多、数量巨大、代谢类型多样、适应性强、繁殖迅速等。
土壤微生物的组成与分类
组成
土壤微生物主要由细菌、真菌、放线 菌、藻类和原生动物等组成，其中细 菌和真菌数量最多。
分类
根据形态、结构和功能等特征，土壤 微生物可分为自养型微生物（如硝化 细菌、蓝藻等）和异养型微生物（如 腐生细菌和真菌等）。
土壤微生物的生态功能
根据观察到的形态学特征，对微生物 进行初步分类和鉴定。
实验六-土壤中微生物的分离和PPT课件
完整版课件
15
固体斜面培养特征
完整版课件
16
液体培养特征
完整版课件
17
半固体穿刺培养特征
完整版课件
18
3 微生物的无菌操作接种原理
• 1) 斜面接种
菌种管和待接试管在手中的拿法
完整版课件
19
试管拔塞后的灭菌
完整版课件
20
试管拔塞后的取菌
完整版课件
21
• 2) 穿刺接种
穿刺接种
（a）水平穿刺接完种整；版（课件b）垂直穿刺接种
• 10 体表不同部位的微生物
• 取一个平板, 用记号笔在平板背面化分为几部分,每部分标 记好要检测的部位,如手,头发,衣服等, 可将洗手前后分别 检测.然后用不同的人体部位按在标记好的平板部位上,将 平板倒转, 恒温37℃培养两天后观察.
22
三 实验器材
• 1 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,倒平 板, 斜面,液体,半固体培养基.
• 2 器材：花园土，99mL无菌水1瓶，9mL无 菌水4支，1mL枪头, 0.1mL, 直径9cm的无 菌平皿，天平，试管架，无菌称量纸，酒 精灯，火柴，接种环，涂布棒，记号笔等.
• 3 菌种: 金黄色葡萄球菌, 变形杆菌,枯草杆 菌.
了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生 物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获 得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 • 在自然界中，上壤是微生物生活的良好环境，其中生活的 微生物数量和种类都是极其丰富的。土壤中的微生物数量 与种类非常多,在通气良好的花园土中，好气性微生物占 有绝对优势。本实验以花园土为材料分离土壤中的好气性 细菌. • 分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法， 根据不同的材料，可以采用不同方法，其最终目的是要在 培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，必要时再对单菌 落进一步分离纯化。在用稀释平板法分离微生物时，还可 以同时测定待分离的微生物的数量。
实验三 霉菌、放线菌及土壤中微生物的分离纯化27页PPT
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
实验三 霉菌、放线菌及土壤中微生物 的分离纯化
16、自己选择的路、跪着也要把它走 完。 17、一般情况下)不想三年以后的事， 只想现 在的事 。现在 有成就 ，以后 才能更 辉煌。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须 充满光 明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的 人只能 引为烧 身，只 有真正 勇敢的 人才能 所向披 靡。
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
实验三 霉菌、放线菌及土壤中微生物 的分离纯化
16、自己选择的路、跪着也要把它走 完。 17、一般情况下)不想三年以后的事， 只想现 在的事 。现在 有成就 ，以后 才能更 辉煌。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须 充满光 明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的 人只能 引为烧 身，只 有真正 勇敢的 人才能 所向披 靡。
实验十二 土壤中微生物的分离纯化共18页PPT
各培养基涂布菌液时对稀释度的选择： 牛肉膏蛋白胨培养基10-4、10-5、10-6； 高氏一号培养基： 10-3、10-4、10-5； 马铃薯培养基： 10-2、10-3、10-4；
平板分离
3、涂布：
①标记：选择3个稀释度写在平板底部；
②取样：每皿准确取悬液0.2ml，放于平板中央；（注意每次取液时 应先混匀试管中的溶液）
2、稀释土样
制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠 的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用 一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中， 吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取 1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、103、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
5、记数：
培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落 平均数，并按下列公式进行计算， 每毫升中菌落形成单位(cfu)
=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5
6、镜检纯培养：挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培 养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否 单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂， 就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
3、溶液和试剂：10％酚，链霉素，盛9ml无菌水的试管， 盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。
4、仪器和其他用品：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌培 养皿等。
四、操作步骤
1、倒平板
①标记，最好写在皿底边上，以防盖子盖错；
②加热熔化三种培养基，冷至55～60℃时，在高氏Ⅰ号培养基中加入 10％酚数滴，马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液（终质量浓度为 30ul/mg），混匀后看清标记分别倒平板，在火焰附近，每皿倒15～ 20ml，静置凝固后备用；(若皿盖上冷凝水过多，最好用灭菌棉花或 灭菌纸擦后再涂布)
平板分离
3、涂布：
①标记：选择3个稀释度写在平板底部；
②取样：每皿准确取悬液0.2ml，放于平板中央；（注意每次取液时 应先混匀试管中的溶液）
2、稀释土样
制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠 的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用 一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中， 吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取 1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、103、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
5、记数：
培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落 平均数，并按下列公式进行计算， 每毫升中菌落形成单位(cfu)
=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5
6、镜检纯培养：挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培 养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否 单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂， 就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
3、溶液和试剂：10％酚，链霉素，盛9ml无菌水的试管， 盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。
4、仪器和其他用品：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌培 养皿等。
四、操作步骤
1、倒平板
①标记，最好写在皿底边上，以防盖子盖错；
②加热熔化三种培养基，冷至55～60℃时，在高氏Ⅰ号培养基中加入 10％酚数滴，马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液（终质量浓度为 30ul/mg），混匀后看清标记分别倒平板，在火焰附近，每皿倒15～ 20ml，静置凝固后备用；(若皿盖上冷凝水过多，最好用灭菌棉花或 灭菌纸擦后再涂布)
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4
（三）平板菌落计数法的原理
将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形 成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品 中细胞密度（一般选择每个平板上长有50-200个菌落的稀释度计算每 毫升的含菌量较为合适）。
由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个 菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞。 因此，平板菌落记数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在 使用菌落形成单位取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。
实验十二 土壤中微生物的分离及纯化
（设计性实验）
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一、目的要求
1、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的 基本操作技术；
2、初步观察来自土壤中的三大类群微生物的菌落形态 特征；
3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基 本技能。
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二、基本原理
（一）土壤是微生物生存的大本营，所含微生物无论是数量还 是种类都是极其丰富的，原因是什么？
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五、实验报告
１、将培养后菌落计数结果填入表格（实验教材P34表II-5） ２、你所做的涂布平板法是否较好地得到了单菌落？如果不
是，请分析其原因。 ３、在３种不同的平板上你分离得到那些类群的微生物？简
从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。 因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征 等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征 （产酸产气情况、染色情况、营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等） 鉴定方能得到。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过 程称为微生物的分离与纯化。
注意涂棒的正确使用。
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4、培养：
将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏琼脂培养基的平板倒置于28℃温室 中培养3～5天，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板倒置于37℃温室中培养 1～2天。
5、记数：
培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平 均数，并按下列公式进行计算， 每毫升中菌落形成单位(cfu)
该法虽然操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果 易受多种因素的影响，但是，由于该方法能直接反映样品中活细胞数量，所 以被广泛用于生物制品（如活菌制剂）、食品、饮料、水（包括水源水）以 及多类产品等质量检测与控制的标准方法。快速细菌自动稀释仪和自动菌落 计数仪则提供快速准确的结果。
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培养基 的类型？
1、倒平板
①标记，最好写在皿底边上，以防盖子盖错； ②加热熔化三种培养基，冷至55～60℃时，在高氏Ⅰ号培养基中加入 10％酚数滴，马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液（终质量浓度为 30ul/mg），混匀后看清标记分别倒平板，在火焰附近，每皿倒15～ 20ml，静置凝固后备用；(若皿盖上冷凝水过多，最好用灭菌棉花或 灭菌纸擦后再涂布)
减小误差应注意的方面： ①称量准确； ②土样与水混合，一定要摇匀； ③每次稀释取液应换一支新的吸管； ④每次取液时应先混匀试管中的溶液；
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平板菌落计数法，所选择倒平 板的稀释度是很重要的。一般以三 个连续稀释度中的第二个稀释度倒 平板培养后所出现的平均菌落数在 50个左右为好，否则要适当增加或 减少稀释度加以调整。
各培养基涂布菌液时对稀释度的选择： 牛肉膏蛋白胨培养基10-4、10-5、10-6； 高氏一号培养基： 10-3、10-4、10-5； 马铃薯培养基： 10-2、10-3、10-4；
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平板分离
11Leabharlann 3、涂布：①标记：选择3个稀释度写在平板底部； ②取样：每皿准确取悬液0.2ml，放于平板中央；（注意每次取液时 应先混匀试管中的溶液） ③涂布：在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直 线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向90°沿另一垂直线来 回推动，平板内缘处可改变方向用涂棒再涂布几次，室温下静置5～10 分钟；
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是 混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类 群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称 为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧 等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此 菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用 稀释涂布平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5
6、镜检纯培养：挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培 养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否 单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂， 就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
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2、稀释土样
制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠 的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用 一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中， 吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取 1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、103、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
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三、实验器材
1、土壤样品（自带） 2、培养基：淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基），牛肉
膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基。 3、溶液和试剂：10％酚，链霉素，盛9ml无菌水的试管，
盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。 4、仪器和其他用品：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌培
养皿等。
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四、操作步骤
由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、 酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以 说，土壤是微生物的“天然培养基”，也是它们的“大本营”因此，土 壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可 与从中分离、纯化获得许多有价值的菌株。
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（二）如何分离？
（三）平板菌落计数法的原理
将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形 成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品 中细胞密度（一般选择每个平板上长有50-200个菌落的稀释度计算每 毫升的含菌量较为合适）。
由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个 菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞。 因此，平板菌落记数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在 使用菌落形成单位取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。
实验十二 土壤中微生物的分离及纯化
（设计性实验）
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一、目的要求
1、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的 基本操作技术；
2、初步观察来自土壤中的三大类群微生物的菌落形态 特征；
3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基 本技能。
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二、基本原理
（一）土壤是微生物生存的大本营，所含微生物无论是数量还 是种类都是极其丰富的，原因是什么？
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五、实验报告
１、将培养后菌落计数结果填入表格（实验教材P34表II-5） ２、你所做的涂布平板法是否较好地得到了单菌落？如果不
是，请分析其原因。 ３、在３种不同的平板上你分离得到那些类群的微生物？简
从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。 因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征 等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征 （产酸产气情况、染色情况、营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等） 鉴定方能得到。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过 程称为微生物的分离与纯化。
注意涂棒的正确使用。
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4、培养：
将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏琼脂培养基的平板倒置于28℃温室 中培养3～5天，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板倒置于37℃温室中培养 1～2天。
5、记数：
培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平 均数，并按下列公式进行计算， 每毫升中菌落形成单位(cfu)
该法虽然操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果 易受多种因素的影响，但是，由于该方法能直接反映样品中活细胞数量，所 以被广泛用于生物制品（如活菌制剂）、食品、饮料、水（包括水源水）以 及多类产品等质量检测与控制的标准方法。快速细菌自动稀释仪和自动菌落 计数仪则提供快速准确的结果。
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培养基 的类型？
1、倒平板
①标记，最好写在皿底边上，以防盖子盖错； ②加热熔化三种培养基，冷至55～60℃时，在高氏Ⅰ号培养基中加入 10％酚数滴，马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液（终质量浓度为 30ul/mg），混匀后看清标记分别倒平板，在火焰附近，每皿倒15～ 20ml，静置凝固后备用；(若皿盖上冷凝水过多，最好用灭菌棉花或 灭菌纸擦后再涂布)
减小误差应注意的方面： ①称量准确； ②土样与水混合，一定要摇匀； ③每次稀释取液应换一支新的吸管； ④每次取液时应先混匀试管中的溶液；
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平板菌落计数法，所选择倒平 板的稀释度是很重要的。一般以三 个连续稀释度中的第二个稀释度倒 平板培养后所出现的平均菌落数在 50个左右为好，否则要适当增加或 减少稀释度加以调整。
各培养基涂布菌液时对稀释度的选择： 牛肉膏蛋白胨培养基10-4、10-5、10-6； 高氏一号培养基： 10-3、10-4、10-5； 马铃薯培养基： 10-2、10-3、10-4；
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平板分离
11Leabharlann 3、涂布：①标记：选择3个稀释度写在平板底部； ②取样：每皿准确取悬液0.2ml，放于平板中央；（注意每次取液时 应先混匀试管中的溶液） ③涂布：在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直 线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向90°沿另一垂直线来 回推动，平板内缘处可改变方向用涂棒再涂布几次，室温下静置5～10 分钟；
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是 混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类 群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称 为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧 等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此 菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用 稀释涂布平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5
6、镜检纯培养：挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培 养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否 单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂， 就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
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2、稀释土样
制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠 的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用 一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中， 吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取 1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、103、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
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三、实验器材
1、土壤样品（自带） 2、培养基：淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基），牛肉
膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基。 3、溶液和试剂：10％酚，链霉素，盛9ml无菌水的试管，
盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。 4、仪器和其他用品：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌培
养皿等。
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四、操作步骤
由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、 酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以 说，土壤是微生物的“天然培养基”，也是它们的“大本营”因此，土 壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可 与从中分离、纯化获得许多有价值的菌株。
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（二）如何分离？