薄层色谱讲座第一讲薄层色谱法的基本技术
经典色谱法分析技术—薄层色谱法(分析化学课件)
小
极性
大
薄层色谱固定相和流动相选择
2. 流动相展开剂的选择要求
薄层色谱分离中一般要求各斑点的Rf值在0.2～0.8之间，Rf值之 间应相差0.05以上.
3. 流动相展开剂的选择方法
如果单一展开剂分离效果不好，可用两种或两种以上的单一溶剂按 照一定比例混合而成的溶剂展开,可以达到较好的分离效果.
薄层色谱固定相和流动相选择 被测组分、吸附剂和展开剂的选择原则
常用溶剂的极性顺序为：
常用吸附剂的极性顺序为：
增
增
大
大
薄层色谱固定相和流动相选择
多糖、蛋白质等大分子、生物碱盐
极 性
苷类（皂苷、黄酮苷、蒽醌苷）
渐 黄酮、蒽醌等苷元、有机酸
小
香豆素、萜类、挥发油等亲脂性成分
烷烃＜烯烃
＜二甲胺＜酯类＜酮
＜醚＜硝基化合物
类＜醛类＜硫醇＜胺 类
＜酰胺类＜醇 类＜酚类＜羧 酸类
分离原理
吸附薄层色谱分离原理
展开（分离）
分离过程：
制板→点样→展开→显色→定性定量分析
固定相--吸附剂
薄层色谱的固定相所用的吸附剂
流动相---展开剂
薄板的底端浸入到适当的流动相溶剂
吸附薄层色谱分离原理
薄 层 色 谱
点样
展开剂
吸附薄层色谱分离原理
分离原理：
展开剂在毛细管的 浸润作用下，带着 各组分沿着薄板向
薄层色谱固定相和流动相的选择
薄层色谱固定相和流动相选择
一、固定相（吸附剂）的选择
1. 选择原则 根据被分离组分的极性选择吸附剂：
被分离组分的极性强——弱极性吸附剂； 被分离组分的极性弱——强极性吸附剂；
薄层色谱固定相和流动相选择
薄层色谱法的基本原理
薄层色谱法的基本原理
薄层色谱法（Thin Layer Chromatography，TLC）是一种常用的分析技术，基于物质在固定相上的分配和迁移差异实现物质分离和检测。
薄层色谱法的基本原理如下：
1. 固定相：将一层薄薄的固定相涂覆在玻璃、金属或塑料基质上，形成薄层色谱板。
常用的固定相有硅胶、氧化铝或纤维素等，它们可以吸附和分离不同物质。
2. 样品施加：将待分析的混合物样品沿着色谱板底部施加。
样品可通过滴管或微量注射器等工具点状施加在色谱板上，通常施加位置为距离色谱板底部约1-2 cm处。
3. 迁移：将色谱板置于封闭的容器中，容器内加入有机溶剂或某种移动相，将移动相铺满容器底部。
容器盖上后，移动相沿着色谱板向上上升。
物质分子会与移动相相互作用，并迁移到上方。
迁移距离取决于化学物质与移动相的亲疏性。
4. 分离：在固定相上，不同物质在移动相中的迁移速度不同，导致分离。
物质越亲近固定相的亲疏性越大，它们迁移速度越慢。
分离后的物质会在色谱板上形成不同的斑点。
5. 可视化：将色谱板取出，根据待分析物质的性质选择合适的显色方法，如紫外灯照射、着色剂喷洒、化学反应等，在色谱板上的斑点处产生可见的色谱带。
通过比较样品斑点的运动距离和标准物质的运动距离，可以推断待分析样品中的物质成分。
薄层色谱法具有操作简便、速度快、分离效果好等优点，因此广泛应用于化学、生物等领域的物质分离和分析。
薄层色谱法原理 ppt课件
原点
A
B
薄层色谱法原理
比移值Rf
溶剂
前沿
原点到斑点中心的距离
Rf 原点到溶剂前沿的距离
起始线
a
AA BB
c
Rf
ac Rst
b c
b
Rf值相差越大，分离越好。一般要求分 离后组分的Rf值在0.2～0.8之间，各组 分的Rf值之差应大于0.05，以防斑点重 叠。
（一）薄层色谱法的原理
将一定粒度的吸附剂均 匀地涂铺在表面光洁 的玻璃板或塑料平板 上，制成薄层板。
薄层色谱法原理
薄层板
把待分析试样的溶液滴 加在薄层板的起始线 上（点样）
试样
原点
薄层色谱法原理
把薄层板放入层析缸中，底端浸入适当溶剂。
薄层色谱法原理
• 展开过程中，组分在 两相之间发生多次吸 附—解吸平衡，吸附
甚至多元溶剂 Rf太小——加入强极性展开剂 Rf过大——降低展开剂的极性
薄层色谱法原理
优化
1.占比例较大的溶剂为主要溶剂，可使 试样组分溶解并基本分离。
占比例较小的溶剂可进一步调整各组 分Rf值，改善分离效果。 2.分离酸性或碱性组分时，往往在展开 剂中加入少量酸或碱，以防这些组分 离解，使这些组分的斑点更加集中和 清晰，从而提高分离度。
薄层色谱法原理
（二）固、氧化铝、聚酰胺、活性炭和大孔吸 附树脂等。
• 吸附剂的选择要合适，与流动相、被分离化合物不反应
薄层色谱法原理
• 2、流动相（展开剂） 薄层色谱法中采用单一溶剂或多元
混合溶剂作流动相，称为展开剂。 与吸附柱色谱法中选择流动相的一
薄层色谱法原理
薄层色谱法原理
薄层色谱法（Thin Layer Chromatography，TLC）是一种常用
的色谱分离技术。
它基于混合物中不同成分在固定相上的亲疏性差异，利用了物质在固定相和移动相之间的分配行为来实现分离。
薄层色谱法的基本原理是将需要分离的样品溶解在合适的溶剂中，然后在一张薄石英玻璃或铝箔片上均匀涂覆一层薄的吸附剂作为固定相。
常用的吸附剂包括硅胶、氧化铝和硅胶凝胶等。
接下来，将涂层的薄片置于一个密闭的玻璃槽中，底部加入浸润吸附剂的移动相。
浸润过程中，样品分子会与固定相亲疏性不同，部分样品分子会被吸附在固定相上，而其他成分则会相对快速地移动。
移动相的选择是根据溶剂性质和样品成分的亲疏性来确定的。
当移动相通过薄片时，样品中的各个成分会根据其在固定相和移动相之间的分配系数在薄片上形成不同的斑点。
移动距离较短的成分代表亲吸附性较强，而移动距离较远的成分代表亲吸附性较弱。
通过比较样品成分的不同斑点之间的特征，可以确定其组成和相对含量。
为了可视化分离结果，通常会使用化学试剂进行显色。
不同的化学试剂可以与特定化合物反应，产生颜色变化或发光，从而使分离出的物质清晰可见。
薄层色谱法具有操作简单、快速、经济等优点，广泛应用于各个领域中，如药物分析、食品检验、环境监测等。
薄层色谱法
第二部分色谱分析第一章薄层色谱法（TLC）一薄层色谱法概述薄层色谱法是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法。
与HPLC不同，TLC将固定相涂铺在栽板上，使之形成均匀的薄层。
被分离的样品溶液点加在薄层板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流动相（深度约5mm）的密闭缸中，进行色谱展开，实现混合组分分离。
被展开的组分斑点即色谱谱带，通过适当技术对色谱谱带进行处理可得到定性和定量的检测结果。
薄层色谱法具有技术比较简单，操作容易，分析速度快，高分辨能力，结果直观，不需昂贵仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。
二薄层色谱法中的薄层板、薄层板的涂铺、点样和展开（一）薄层板TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。
可通过改变涂层材料的化学组成或对材料表面进行化学改性来实现改变薄层色谱分离的选择性。
此外，固定相的物理性质，如比表面积、比空容、平均孔径等也对其色谱行为产生影响。
（1）载体对TLC载体的基本要求为：机械强度好、化学惰性好（对溶剂、显色剂等）、耐一定温度、表面平整、厚度均匀、价格适宜。
（2）固定相TLC固定相包括改性固定相和未改性固定相两类。
硅胶和氧化铝是最常用的两种未改性固定相。
（3）粘合剂在制备薄层板时，一般需在吸附剂中加入适量粘合剂，其目的是使吸附剂颗粒之间相互粘附并使吸附剂薄层紧密的附着在载板上。
常用的粘合剂可分为无机粘合剂和有机粘合剂两类。
（4）荧光指示剂荧光指示剂是便于在薄层色谱图上对一些基本化合物斑点（无颜色斑点、无特征紫外吸收斑点）定位的试剂。
加入荧光指示剂后，可以使这些化合物斑点在激发光波照射下显出清晰的荧光，便于检测。
（二）薄层板的涂铺涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四类，其中涂布法是应用最广泛的涂板方法。
TLC固定相薄层涂铺大多采用湿法匀浆，要求薄层均匀、平整、无气泡、不易造成凹坑和龟裂。
薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高色谱分离效率和选择性。
薄层色谱法概述PPT课件【共52张PPT】
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k 反映了两种溶质的平均迁移速度，其由流动相溶剂强度 决定 I0 -（ IR + IT ）=差为被介质吸收并转换为热的光强 4 丙酮 0. 氧化铝—有碱性、中性、酸性 放置时间不宜太长，否则背景吸附剂也吸附碘，使信噪比降低。 硅胶G——将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一般为1份固定相与3份水)，迅速研磨均匀，立即涂铺。 薄层色谱定量测定的光学方法是基于测量斑点和薄层空白处光学响应信号的差值。 归一化法、内标法、外标法 这种影响一般使分配系数变小。 此外还有：化学键合相反相展开、化学键合相正相展开、离子交换、离子对色谱、凝胶、胶束、手性展开。 这类扫描仪技术上一些问题还未解决。 51 / 二氧六环 0. 展开距离一般为10-15cm。 单光束双波长——对背景不均匀引起的干扰有补偿作用，选择的两个波长应接近些。 HPLC一次只能分离一个样品，通常采用反相色谱，色谱后衍生化受限制。
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点样 要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。 采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。 点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍～几十倍为宜。 手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 –5ul），微量注射器。
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自动点样 Limomat IV 喷样仪——样品溶液通过气流成雾状喷向薄层，移动板台，使在薄层上流下样品条带。 特点：适合于大量稀样品溶液的喷加；条带宽度不超过2mm，有利于改善分辨率；便于狭缝式光密度计扫描；要求薄层板强度高。 自动薄层色谱点样仪——由计算机控制。 药典规定：点样基线距底边2.0cm, 样点直径2-4mm, 点间距离约为cm。
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薄层色谱参数
保留参数（Rf值） 用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，用Rf表示。 Rf=Ls/L。，
@薄层色谱法(TLC)讲稿(xin).
2.2点样器
毛细管 微量注射器 半自动及全自动点样器
2.3展开容器
专用平底或双槽展开缸、盖能密 闭
特殊水平展开缸
2.4显色设备
喷雾显色：玻璃喷雾瓶或专用喷
雾器，用压缩气体可使试剂呈均 匀细雾状喷出
浸渍显色
蒸气熏蒸显色
2.5色谱检视装置
可见紫外三用仪 装置可见紫外光源及相应滤光片
的暗箱 拍摄图像的设备
研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空
气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆 下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀 浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板 涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层 薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么 明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影 响不是很大，影响最大的是展开剂的配 制和展开系统的饱和。
3.操作方法
3.1薄层板制备
自制方法：硅胶：1份固定相加3份 水---研磨混合---涂布---晾干---活化--备用；纤维素：与水1：5或6；聚酰
胺：与水1：4，或与甲醇1：3
薄层板活化：硅胶、氧化铝、硅澡 土：110℃、30分钟；纤维素：105 ℃ 、30分钟；聚酰胺：60－80℃、 30分钟
用涂布器制板的要点：玻璃板要清
洁；调浆要均匀；涂布后的薄层板应低 温缓慢干燥。
自制薄板要求：表面均匀、平整、光
滑，无麻点、无气泡、无破损、无污染。
薄层厚薄对Rf值影响：硅胶G板当
厚低于150μm时， Rf值随薄层的减低而 增大，可变性大；板厚250 μm ， Rf改变 不显著。
薄层层析操作要点铺板用的匀浆不宜 过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动 或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后， 板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶 G:水=1：2～3，硅胶G:羧甲基纤维素 钠水溶液=1:2。
薄层色谱法
薄层色谱概念 薄层色谱属于液-固吸附色谱。同柱色谱 不同的是吸附剂被涂布在玻璃板上，形 成薄薄的平面涂层。干燥后在涂层的一 端点样，竖直放入一个盛有少量展开剂 的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂涂 层，借毛细作用向上移动。与柱色谱过 程相同，经过在吸附剂和展开剂之间的 多次吸附-溶解作用，将混合物中各组分 分离成孤立的样点，实现混合物的分离。
9、斑点的检出：将展开后的薄层板从展开槽中 取出，挥尽展开剂，应用下列几种方法对被分离 的化合物进行检出定位。 光学检出法： a：化合物本身有色，在自然光下可直接看出斑 点。 b：有些化合物在可见光下不显色，但可吸收紫 外线光，在紫外光灯下显现不同颜色的暗点。 c：有些化合物不仅能吸收紫外光，而且能发射 更长波长的光而显现不同颜色的荧光斑点。荧光 灯有短波型（254nm）和长波型（365nm）两种， 有的化合物需在短波荧光灯下观察，有的化合物 需在长波长荧光灯下检出即可。
d：在可见光、紫外光下都不显示，也没 有合适显色方法的化合物，可以用荧光 薄层法进行分离。化合物在紫外光灯可 以发亮的背景上显示暗点。这是由于这 些化合物减弱了吸附剂中荧光物质的紫 外吸收强度、引起了荧光的淬灭。 光学检出法不仅方便，而且不会改 变化合物的性质。对光敏感的化合物要 注意避光，以及尽量缩短用紫外光灯照 射的时间。
7、薄层板的预饱和：必要时，可 以将点样后的薄层板置内有展开 剂或规定的试液的展开室中放置 一定时间进行预饱和，起到克服 边缘效应及改善分离效果等作用。 用双槽展开室很容易做到，即先 将点好样品的薄层板放入展开室 没有溶剂的一侧槽中，平衡后再 将溶剂倾入此槽中展开。
8、展开：将展开室置于水平位置，将点好 样品的薄层板放入加有展开剂的展开室中， 薄层板浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜， 密闭，待展开至规定距离，除另有规定外， 一般为8～15cm，取出薄层板，晾干，以备 检测。一般采用上行展开。采用二次展开 的，第一次展开的展距为7cm；高效薄层板 的展距一般不超过7cm。少数沸点较高、扩 散系数较低的溶剂系统（如异辛烷、正丁 醇等）适当延长展距可提高分离度。但过 度延长展距会使斑点扩散。
薄层色谱法
⑵展开剂选择
薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，主要根据样品中 各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度等因素来考虑。 展开剂的极性越大，对化合物的洗脱力也越大。 选择展开剂时，除参照表列溶剂极性来选择外，更多地 采用试验的方法，在一块薄层板上进行试验： ①若所选展开剂使混合物中所有的组分点都移到了溶剂 前沿，此溶剂的极性过强； ②若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动，留 在了原点上，此溶剂的极性过弱。 当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶 剂作为展开剂。先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混 合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与 前一溶剂混合，调 整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组合。合适的混 合展开剂常需多次仔细选择才能确定。
4、薄层色谱应用 ⑴可用于判断两个化合物是否相同（同一展开 条件下是否有相同的移动值）； ⑵可用于确定混合物中含有的组分数； ⑶可用于为柱色谱选择合适的展开剂，监视柱 色谱分离状况和效果； ⑷可用于检测反应过程。
5、薄层色谱仪
薄层色谱法简称TLC，是在50年代从经典柱色谱法和纸 色谱法基础上发展起来的一种色谱技术。60年代后，人们对 薄层色谱法的标准化、规范化及扩大应用等方面进行了许多 工作，使该方法日趋成熟。 薄层扫描仪的基本结构及主要功能基本是相同的，每台 仪器都包括光源、分光器、检测器、数据处理及信号输出几 个部分。
3、薄层板经碘薰显色后，应马上用铅笔将显色斑点圈出。
实验：薄层色谱法
一、实验目的
学习薄层色谱法分离、鉴定化合物的原理 和方法 学习结构相似用一般方法难以分离的化合 物的分离、鉴定方法
二、实验原理
1、基本概念 薄层色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种， 是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实 验技术，属固—液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸 色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克， 甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时， 把吸附层加厚加大，因此，又可用来精制样品，此 法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而 不能用气相色谱分析的质。此外，薄层色谱法还可 用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预 试”。
薄层色谱法
制备薄层板
制成的浆料要求是均匀的，不带 团块，成胶状，粘稠适当。应将吸 附剂加入到溶剂中，要不断搅拌， 加完后，迅速搅动，盖好盖子，剧 烈摇动，保证充分混合。一般1g硅 胶G需要羧甲基纤维素钠水溶液 2~3mL，但是要根据实际情况予以 增减。铺好的薄层板的厚度要尽量 的均匀，为0.25~1mm为宜。
监测分离情况：用柱色谱进行 分离时，每隔一定时间用薄层板进 行点样，然后展开，根据样点判断 所分离的物质是否是同一物质。
薄层色谱的基本原理
薄层色谱主要是根据吸附剂的 极性，洗脱剂的极性，待分离物 质本身的性质等进行分离。 吸附剂：固定在玻璃板上的对 化合物进行吸附的物质。常用的 吸附剂有硅胶和氧化铝。
点样
在距离薄层板底1cm处画好一 条直线作为起点线，用毛细管吸 取样品垂直轻轻地接触到起点线 上，点样的次数视溶液的浓度而 定，斑点的直径为1~2mm，若多 处点样，样点间距为1~1.5cm。
薄 层 色 谱 点 样
薄层色谱的展开
将选好的展开剂加入到展析缸 中与缸内的空气饱和5~10min，然 后将薄层板放入进行展开，样品点 必须在液面之上，当各组分已经明 显分离或者是展开剂的前沿已到达 薄层板的前沿时，迅速取出薄层板， 标出溶剂前沿的位置。
铺板
将调好的浆料倒在玻璃片上， 涂布开，使表面均匀，无水层， 无气泡。然后将薄层板放在已经 校正好的平面上晾干。除了直接 涂布外，还可以使用平铺法（涂 布器），浸渍法（注意涂层之前 剧烈摇晃）。
薄 层 色 谱 铺 板
薄层板的活化
薄层板的活化即为除水过 程，一般在烘箱内min。活 化好的薄层板放在干燥器内备 用。
薄 层 色 谱 进 行 展 开
薄 层 色 谱 展 开 图
薄层色谱基础知识
薄层色谱基础知识第一篇基础部分第一章绪论薄层色谱是色谱分析技术中的一项重要分支。
由于这一方法具有简单、迅速、灵敏高度、分离效能好等优点，因此已广泛一应用于化学分析的多种领域。
目前在食品卫生化学分析中，也多采用薄层色谱技术，特别是对食品中的微量有机毒物的分离和分析，更显出薄层色谱的优越性，故已成为食品卫生化学分析中的一项重要技术。
第一节色谱分析的发展色谱分析是分离混合物组分的一种方法。
这种方法是借助于混合物中的组分，在互不相容的两组间进行吸附或分配，以达到分离的目的。
本世纪初，植物学家茨维特（Tsw-ett）用菊根粉柱及石油醚分离植物叶子提取物，结果在菊根粉柱上形成了几种植物色素的色谱带，从而分离出植物叶子中的各种色素。
这种分离分析的方法，被称为色谱分析法，茨维特因此而被认为是色谱分析的奠基人。
但这一方法在较长的时期内并没有被人们所重视。
直至1931年以后，人们在应用色谱分析方法分离类胡萝卜素等工作中，提出了色谱分析的原理及其实用价值的报告，于是才逐步完善了这一技术方法，促进了色谱分析的发展。
茨维特所建立的色谱分析方法，被称为液一固吸附色谱法。
这种方法是将溶解了的待分离组分的溶液，通过固体吸附剂柱，进行分离。
1941年马丁（Wartin）等人，用含有水份的惰性支持剂（如含水硅胶）代替液一固吸附色谱中的固体吸附剂，将样品溶于不溶于水的有机溶剂中，并使通过装有含水的惰性支持剂柱，由于被分离的各组分在有机溶剂及水之间的溶解度不同，从而在两相间进行分配分离，这就诞生了液一液分配色谱。
此后，康斯登（Consden）用滤纸代替含水硅胶作隋性支持剂，称之为纸色谱。
马丁等进一步将色谱分离系统中的流动相由液体改为气体，并在涂有硅铜油液体的硅藻土支持剂上成功地分离了脂肪酸，创建了一种新型的色谱分析方法。
由于这一方法具有分离效能高、速度快等优点，因而得到了迅速的发展，成为目前色谱分析中的一项重要的技术——气相色谱法。
五十年代中期，斯塔尔（Stahl）发展了一种新型的色谱分析技术——薄层色谱法。
薄层色谱 操作技术
试验四薄层色谱计划课时：3课时一、试验目标：1、了解薄层色谱基础原理和应用。
2、掌握薄层色谱操作技术。
二、试验原理：1、原理薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常见TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。
样品在薄层板上吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之间进行分离。
因为多种化合物吸附能力各不相同，在展开剂上移时，它们进行不一样程度解吸，从而达成分离目标。
2、薄层色谱用途：1）化合物定性检验。
（经过和已知标准物对比方法进行未知物判定）在条件完全一致情况，纯碎化合物在薄层色谱中展现一定移动距离，称比移值（Rf值），所以利用薄层色谱法能够判定化合物纯度或确定两种性质相同化合物是否为同一物质。
但影响比移值原因很多，如薄层厚度，吸附剂颗粒大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。
所以，要取得重现比移值就比较困难。
为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
距离溶剂前沿至原点中心的点中心的距离溶质最高浓度中心至原 f R2、快速分离少许物质。
（几到几十微克，甚至0.01µg ）3、跟踪反应进程。
在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点逐步消失，来判定反应是否完成。
4、化合物纯度检验（只出现一个斑点，且无拖尾现象，为纯物质。
）此法尤其适适用于挥发性较小或在较高温度易发生改变而不能用气相色谱分析物质。
三 、试验装置薄层板在不一样层析缸中展开方法四、试验操作步骤：1、吸附剂选择薄层色谱吸附剂最常见是氧化铝和硅胶。
1）、硅胶：“硅胶H”—不含粘合剂；“硅胶G”—含煅石膏粘合剂；其颗粒大小通常为260目以上。
颗粒太大，展开剂移动速度快，分离效果不好；反之，颗粒太小，溶剂移动太慢，斑点不集中，效果也不理想。
化合物吸附能力和它们极性成正比，含有较大极性化合物吸附较强，所以R f值较小。
酸和碱> 醇、胺、硫醇> 酯、醛、酮> 芳香族化合物> 卤代物、醚>烯> 饱和烃本试验选择吸附剂为薄层色谱用硅胶G。
薄层色谱法的基本原理及其应用
薄层色谱法的基本原理及其应用
薄层色谱法（Thin layer chromatography，TLC）是一种广泛应用于生物化学、有机化学等领域的分离技术。
它利用吸附剂或分子筛作为固定相，在薄薄的层面上，将要分析的混合物溶液涂敷在固定相表面上，然后通过溶剂的上升或下降逐渐分离出不同成分，最终在固定相表面形成各种不同的斑点，进而实现目标化合物的分离和纯化。
薄层色谱法的基本原理是根据不同化合物在固定相上的吸附性能、极性、分子大小等特性，将混合物中的各种成分按照不同程度的吸附和分配系数沿着固定相的表面迁移，从而实现分离纯化的目的。
固定相可以是硅胶、氧化铝、碳等物质，而溶剂可以是水、乙醇、乙醚、石油醚等有机溶剂。
薄层色谱法的应用非常广泛，主要用于对有机化合物的分离和鉴定。
例如，可以对不同的药物、天然产物、有机合成产物等进行初步分离和纯化，或者确定混合物中某个组分的含量、结构等信息。
此外，薄层色谱法也可以用于分离分子量较小的小分子物质，如脂肪酸、氨基酸、糖类物质等。
最近，薄层色谱法被广泛应用于食品、环境和生命科学领域，以对食品质量、毒性物质、植物代谢产物等进行鉴定或检测。
薄层色谱法培训讲义
薄层色谱法薄层色谱法是将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。
注意事项⏹样品的预处理。
⏹样品及对照药材和供试品及对照药材溶液制备应量化操作，目的是使样品的色谱与对照药材的色谱更有可比性。
⏹定量点样（除了鉴别有无，还可粗略进行量化评价）⏹在有条件的情况下，设化学对照品的同时设对照药材。
⏹注意环境条件对样品色谱行为的影响。
一、薄层板普通薄层板：硅胶G、H，硅胶GF254，聚酰胺薄膜等市售薄层板（商品预制板）高效薄层板自制薄层板：铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。
匀浆配比一般是硅胶G:水=1：2～3，硅胶G:羧甲基纤维素钠:水=1:2。
研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。
匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。
涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。
目前实验室使用的薄层板规格：10cm×10cm，10cm×20cm或20cm×20cm注意事项1、薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟后，置干燥器中备用。
最好随用随制，放入干燥器中保存仅作为使用前的一种过渡。
2、聚酰胺薄膜不需活化。
3、如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110℃活化30分钟后，置干燥器中备用。
4、使用前检查其均匀度，在反射光及透射光下检视，表面应均匀、平整、光滑、无麻点、无气泡、无破损及污染。
二、点样1、点样器：专用毛细管、半自动或自动点样器械、薄层用微升注射器等。
2、点样：要求在洁净干燥的环境下点样。
尽量用小的点样管。
如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。
这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。
实验薄层色谱法讲课文档
吸附色谱三要素－吸附 剂
⑵ 硅胶silica gel 它的吸附性来源于 硅胶氧原子上未成键 的电子对和可以形成 氢键的羟基。羟基有 结合型（Ⅰ）、活性 型（Ⅱ）和游离型 （Ⅲ）三种
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吸附色谱三要素－吸附
剂 活性
氧化铝含水 硅胶含水量
量（％）
（％）
Ⅰ
0
0
Ⅱ
3
样品： 1%偶氮苯和1%苏丹Ⅲ溶液混合样品 展开剂：9: 1石油醚/乙酸乙酯
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点样操作： 1.可利用铅笔画一条线； 2.样品溶液要点在 0.7-0.8 mm处； 3.采用多次点样时，应待前一次点
加的溶剂挥发后再进行;
4.点量应适中，避免斑点拖尾;
5.配制样品的溶剂具有挥发性和 小极性。
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色谱法原理
色 谱 法 （ Chromatography ） 亦 称 色 层 法 、 层 析法等。色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要 方法之一。
色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物 质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性 的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸 附或分配作用，从而使各组分分离。
在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将
薄层板以与原展开方向成 90 的方向进行展开。
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1 原点
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薄层色谱示意图
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薄层色谱法简介
固定相的选择：
✓ 硅胶 • 无定形多孔性物质，略具酸性， 适用于酸性和中性物质的分离 和分析。
✓ 氧化铝 • 有中性、酸性、碱性三种类型。 • 中性氧化铝（pH7.5）的用途 最广，适用于分离生物碱、萜 类、甾体、挥发油及酸碱中不 稳定的苷类、内酯类等化合物。
应用
优点
该技术中所应用的薄板是 采用颗粒较细的吸附剂利 用喷雾法制成的，具有涂 层均匀、重现性好等优点
定义
用高分离效能薄层 板的色谱法
比较
利用HPTLC指纹图谱， 通过比较斑点数目、 顺序和相对强度(或者 光密度扫描产生的峰) 可以进行稳定性测试
高效薄层板较普通薄层 板颗粒直径小，颗粒度 分布窄，分辨率提高， 展开距离缩短，因而展 开时间缩短，3～20min
可以完成一次分析
固定相的改造
2、反相薄层色谱法
概述 操作 应用 拓展
01
定义
利用化学键合反应， 将烃基键合到硅胶表 面，制成非极性固定 相，用极性较大液 体作流动相进行分离 分析的方法
02
优点
斑点扩散小，而且分 离效果高；化学键合 相硅胶的硅烷化程度 可调，为分离提供选 择性，因此可根据需 要挑选合适的固定材 料，获得最好的分离
✓ 聚酰胺 • 分离极性和非极性物质。（尤 其在黄酮类化合物、蒽醌类、 酚类化合物的分离方面，有明 显优势）
概述 操作 应用 拓展
1.薄层板的制备
• 薄层铺板的厚度 及均匀性对样品 的分离效果极大
• 一般厚度0.25mm 为宜
• 硬板的制备: 匀浆、制板 晾干、活化
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１１吸附剂或载体的选择及薄层的制备 －
（ １ 吸附剂或载体的选择：除了颗粒较细、 粒度范围较窄外，柱色谱用的吸附剂或载体薄层色 谱都能用。但要使一组混合物得到很好分离必须要
根据被分 离化 合物的性质来选择 合适的 固定相 。分
用于硬板。
１ 点状点样 借毛细作用吸样的定容管有 ） 两种，一是容积分别为０５１２３４ ． 、、 及５ 的定量毛 细管（ ｃｏａｓ， Ｍｉ ｅｐ）另一种是１０ ０ｎ的铂铱合金 ｒ ０及２０ｌ
定量毛细管（ａｏｉ ｔ ）注射器式的可变体积 Ｎ ｎｐ ｅｔ ； ｐ ｅ 的 点样器有５－２０ｌ ０ ３ 的毫微点样器 （ａｏＡｐ ｎ Ｎ ｎ－ ｌ － ａ ｃ ｉ
薄层色谱法虽已有卅多年历史，操作、设备等 有很多改进，但至今整个操作过程仍是不连续的， 其步骤如下：
术。 十 六 年代后，Ｓａｌ等人 对薄层色谱法的标准 ｔ ｈ 化、规格化及扩大应用等方面进行了许多工作，使 该法日 趋成熟。薄层色谱法具有设备简单、操作方 便、分离快速、灵敏度及分辨率高、显色剂选择性 大，以及制备薄层载量较纸色谱大，而切割色带较 柱色谱方便等优点。因此，在分离分析及小量制备 工作中基本取代了纸色谱法及经典柱色谱法。 薄层色谱法在仪器自动化程度、分辨率及重现 性等方面不如后来发展起来的气相色谱法和高效液 相色谱法，被认为只是一种定性和半定量的方法而 未受到足够的重视。但是薄层色谱法有如下特点： 固定相使用一次弃去， 样品的预处理比较简单； 对被 分离物质的性质没有限制， 使用范围较广； 平面薄层 具有多路柱效应，可同时进行多个样品的分离；在 同一色谱上可根据被分离化合物的性能选择不同显
Ｖ Ｒ１－ＫＳ ｈｍｂｒ Ａ ０ Ｃ ａ ｅ 是为２ ２ｃ ０ ０ｍ薄层板 设计的水平展开槽， 其优点是展开剂用量少， 对同一 块薄层上的几条被隔开的样品带可以用不同展开剂 同时展开，便于选择展开剂，也可在展开时用适当 水蒸气或不同的溶剂蒸气对薄层板进行饱和。 为了使展开槽内能被展开剂蒸气饱和，使展开 剂组成不变， 得到理想的分离及重现的结果， 展开槽 必须密闭。 除用夹心槽外， 当使用极性相差较大的多 组分展开剂时，必须将点样后的薄层板置展开槽内
类、胺类、脂溶性维生素及醛酮类；中性氧化铝适 用于酸性及对碱不稳定的化合物的分离；酸性化合 物可用酸性氧化铝分离。 硅藻土 本身不具吸附性，以一定量加入硅胶 等吸附剂中可以降低吸附力。适合于某些化合物的
涂布器。涂布后的薄层应水平放置，室 温 凉 干备 用。如需活化，则干燥温度及时间可根据活度要求 变化。这样制得的薄层厚度 约 为 ０ －０ ｍ 适 ． ． ｍ， ２ ３ 合定性或定量时使用。 制备薄层的厚度要求约 ０５ ．
中等极性的溶剂稀释或溶解 成一定浓度的溶液点
样。对生物样品 （ 动植物组织、体液… 等）中某 … 些成份的分离定量时，首先要将样品中的被测成份 定量地提取出来，视含量高低稀释或浓缩成一定浓 度的样品溶液，因为薄层吸附剂不必反复使用，且 层析过程同时也有净化的作用，所以多数情况样品 溶液可以直接点样，不必预处理。如果样品中欲测 成份量太低、杂质量太多或供试液中的杂质使展开 后的色谱背景太深或影响分离时，对样品溶液用萃
讲
座 薄 层 第一讲 色 谱 讲 座
薄层色谱法的基本技术 何
丽 一
（ 中国医学科学院 药物研 Байду номын сангаас所， 北京）
薄层色 谱法（ ｉ Ｌ ｙｒ ｒ ａｏｒ ｈ， Ｔｈ － ａｅ Ｃ ｏ ｔ ａ ｙ ｎ ｈ ｍ ｇｐ
简称Ｔ ） ｒｈ ｅ等人在五十年代从经典柱色 ＬＣ 是Ｋｉ ｎｒ ｃ
谱法及纸色谱法 的基础上发展起来 的一 种 色 谱 技
－２ ｍ。 ｍ
分离， 更常用来作为分配色谱的支持剂。
纤维素 用于薄层色谱的纤维素有普通纤维素 及微晶纤维素两种， 都是用作分配薄层时的支持剂。 离子交换纤维素 纤维素经过化学处理制成各 种改良纤维素。有具有阳离子交换基团的羧甲基纤 维素（ Ｍ） 具有阴离子交换基团的二乙 Ｃ ， 基氨基乙 基（ Ａ 、 ＤＥ Ｅ） 三乙胺基（Ｅ Ｓ） Ｔ Ａ 以及氨基乙基（Ｅ） Ａ 等纤维素，都可用作离子交换薄层。将硅胶或纤维 素薄层用液体离子交换剂三异苯胺等处理后也可得 同样效果，分离离子型化合物。 聚酰胺 聚酰胺分子内的酰胺基能与酚类、酸 类、醌类及硝基化合物等形成氢键，因而，对这些 化合物产生吸附作用，且因化合物中酚羟基数目及 位置的不同产生的吸附力也不同而使得到分离。 葡聚糖凝胶 利用分子筛的原理在凝胶过滤薄 层上分离蛋白质、多 肽、核酸、酶与多糖等亲水性
毛细管式的微量 点样器装在手动的 ｎｍ ｔ Ｎａｏ ａⅡ
型 样 置 磁性 样 上 点 头装 点 装 的 点 头 ， 样 在
簧 。 上
按下此点样头，毛细管借恒定的压力接 触 薄层表
面。点间距离由带准确的５ ｍｍ间隔的Ｖ字形缺刻装 置控制；注射器式的毫微点样器及微量点样器由测 微尺控制，也可与Ｎａｏ ａ 型点样装置配合，以 ｎｍ ｔ 使点样位置精确。 电动的Ｎａｏ ａ 型点样装置完全适用于上述 ｕｍ ｔ 各种点样器的配套使用，并且还可以自动控制点样
胺 等高 聚物 。
１２点 样 －
点样方式、点样量及点样器的选择决定于分析 的目 的、样品溶液的浓度及被测物质 的 检 出灵敏 度。如果仅仅为了定性，用内径约０ ｍ ． ｍ管口平整 ５ 的毛细管或微量注射器将样品溶液点在距薄层底边 约２ｍ处， ｃ 点样直径不超过５ ｍ， ｍ 点间距为１ ． ｍ －１ ｃ ５ 即可。在进行薄层定量时，原点直径的一致，点样 间距的精确，是保证定量精 确 度 的 关 键，为 此 Ｃ ＭＡＧ公司生产了系列点样设备，这些设备只适 Ａ
碳 ＜苯＜四 氯化碳＜二氯甲 烷＜乙 醚＜乙酸乙 酯＜
丙酮＜丙醇＜乙醇＜甲醇＜水。用单一溶剂不能分 离时，可用两种以上的混合展开剂，并不断改变混 合展开剂的组成和比例。每种溶剂在展开中都有其 一定作用，如： ｉ 展开剂中比例较大的溶剂起溶解物质和基 本分离的作用，极性相对较小； ｉ 展开剂中比例较小的溶剂，极性较大，对 ｉ 被分离物质有较强的洗脱力，帮助化合物在薄层上 移动，可以增大 Ｒ 值， 但不能提高分辨率； ｆ ｉ 展开剂中加入少量酸、碱可抑制某些化合 ｉ ｉ 物斑点的拖尾； ｉ 展开剂中加入丙酮等中等极性溶剂可使不 Ｖ 相混合的溶剂混溶，并可以降低展开剂粘度，加快
速度与固定相的量有关， 因此， 必须通过实验找到最 佳分离时的固定相量。这样处理的反相板在展开过 程中固定相会逐渐溶于展开剂而影响分离，因此， 现在多改用化学键合固定相作反相分配薄层。
化学键合固定相 将非极性不同碳链长度的烷 基共价键合于微粒硅胶表面游离羟基上。常用的有 十八烷基（ １ 、辛基（ ８和乙基（２ 等化学键合 Ｃ８ ） Ｃ） Ｃ） 固定相，作反相分配薄层用， 性能稳定， 重现性好。 ２ 薄层的制备：将吸附剂或载体均匀涂布 ） 在玻璃板、 塑料片或铝箔上的预制板已有商品出售， 规格齐全， 使用方便， 但价格较贵， 因此， 一般实验室 多用自制薄层。薄层有不含粘合剂的软板及含有粘 合剂的硬板两种。前者系将吸附剂或载体直接于玻 璃板上用干法涂成均匀的薄层即可使用，但软板疏 松，使用不便，现很少用；后者系在吸附剂中加入 适量粘合剂后用湿法涂层，粘合剂的加入可以增加 薄层的强度。理想的粘合剂要求亲水性好，粘结力 强且具有化学惰性。手工涂层时常用的粘合剂为羧 甲基纤维素钠（ ＭＣ 或煅石膏（ ａ Ｏ １ Ｈ２ ） Ｃ ） Ｃ Ｓ ４／ Ｏ 。 ２ 预制板的粘合剂有聚乙烯醇、聚丙烯酸或聚丙烯酰
中仍是被广泛应 用 的一种方法。 薄层色谱法是开放型的色谱法。将要分离的混 合物点在用固定相均匀涂布的薄层上，用合适的展 开剂在密闭的层析槽中展开，被分离的成份不随展 开剂流出而选择性地保留在原点和溶剂前沿之间， 被分离化合物在薄层上的位置 用 Ｒ 值 （ ｆ 原点至样 品斑点中心的距离／ 原点至溶剂前沿的距离）来表
大分 子物质 。
为了特殊需要可用各种方法制成具有特殊性能
的薄层， 如两种吸 附剂混合涂布的 薄层， 一块板 在同 上用不同吸附 剂涂成多区带的薄层， 在硅胶中 加入
硅酸锌或硫化镉等制成萤光薄层。加入碱或碱性缓 冲液的碱性薄层 （ 抑制某些碱性化合物在硅胶薄层 上的拖尾）。含有硫化物等沉淀剂的薄层用于分离 金属离子，含有硼酸盐等络合剂的薄层用于分离糖
ｔ ） ． ． 微量点样器（ ｃｏＡ ｐｉ ｔｒ， ｒ ｏ 及０ －２ ５ ３ Ｍｉ －ｐｌａｏ） ｒ ｃ 用于需要调节体积及没有毛细作用的键合相薄层的
点样。
硅胶是最常用的吸附剂， 市售硅胶Ｇ 即在硅胶 中已加入１－１％煅石膏，使用时只需将５硅胶Ｇ ２ ４ 加１－１ｍｌ 调成均匀的糊状，至石膏开始凝固 ５ ８ 水， 时，铺成 １ ２０ ０ ０ｃ的板四块，涂布薄层可用电动 涂布器 （ Ａ Ｇ涂布器）或自 如Ｃ ＭＡ 制有机玻璃手动
示， 当Ｒ 值为 ０ ，即样品 留在原点 ，在薄 层 上 ｆ 时
没被展开，Ｒ 值为１ 时，样品不 被保留，随溶剂 展开至前沿；合适的Ｒｆ 值应 在 ０ ０ 之间。按 ． ． ２ ８ 薄层色谱使用的固定相的性质及其 分离机制可 分 为吸附薄层、分配薄层、离子交换薄层及分子排阻
薄层等 。
离亲脂性化合物常选择氧化铝、硅胶、乙酰化纤维 素以及聚酰胺； 分离亲水性化合物常选择纤维素、 离 子交换纤维素、硅藻土及聚酰胺等；但也有例外， 如脂溶性叶绿素在氧化铝和纤维素上都能分离。常 用的吸附剂或载体有： 硅胶 硅胶表面带硅醇基，呈弱酸 性 （Ｈ＝ ｐ ４ ），活性硅胶适合分离酸性或中性化合物，如酚 ． ５ 类、醛类、生物碱类、尢体化合物以及氨基酸类， 是基于吸附作用；非活性硅胶含有一定的水， 在分 离色素时是基于分配作用。 氧化铝 有弱碱性（Ｈ＝９、酸性 （ ｐ ｐ Ｈ＝４及 中性（ ｐ Ｈ＝７ ． ５三种氧化铝。 弱碱性氧化铝用来分离 中性或碱性化合物，如多环碳氢化合物类、生物碱