同源重组的应用专题讲义(ppt 20页)
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《DNA重组》幻灯片
2. 插入序列结构特征:
2. 插入序列结构特征:
(1)它们都是小的DNA片段(约1kb )
(2)两端有反向重复序列(inverted repetitive sequence, IR)
(3)除了IS1以外,所有已知IS序列都只有一个
开放读码框,具有编码转座酶的基因。
(4)转座时往往复制宿主靶位点一小段(415bp)DNA,形成位于IS序列两端的正向重复 区。
(1)转座依赖转座酶。 (2)转座因子两端有被转座酶识别的反向重复序列。 (3)转座的靶位点是随机的,靶位点交错切开,插入 转座因子后经修复形成两侧正向重复序列。
1.不同点:
(1)真核细胞内只要存在转座酶,任何具有该酶识 别的反向重复序列的DNA片断均可以转移,而无需 由被转移序列自身编码这种酶。
者在重组中起的作用不同) 二者有共同的核心序列(O区)长度为15bp。
2.酶及蛋白质:
整合是由λDNA编码的λ重组酶完成的,称为λ整合酶 (λintegrase, Int)。
在反应过程中涉及几种辅助蛋白,这些蛋白有些是寄 主编码的,如宿主编码的整合宿主因子(integration host factor, IHF)
二、λ噬菌体DNA 的整合与切除
(一)简介
当λDNA进人大肠杆菌细胞时,一种复杂的调控系统 使得DNA采取两种命运中的一种:
1.溶菌(裂解)周期:λDNA独立存在,进行大量 复制以产生更多的子代噬菌体,在这种情况下,它最 后破坏寄主细胞,释放子代噬菌体;
2.溶原周期:λDNA整合进寄主染色体,随着寄主 染色体复制而一代代传下去。整合到细菌DNA中的 λDNA被称为前病毒。
(3)它发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列中的专一核
苷酸上;在高等生物细胞中,专一抗体基因的多样性即是通 过一组前体序列的位点特异重排构建的。
DNA重组培训讲义.pptx
5、连接分子的拆分
链交换形成的连接分子必须拆分 (resolution),彼此分离为双链DNA 分子。由于交联在一起的两条双链DNA 分子实际上处在不断地异构化中,切口 可能在两对同源链中任意一对上发生。
根据链裂断切开的方式不同,得到的重组产物也不 同。如果切开的链并非原来断裂的链,重组体异源 双链区的两侧来自不同亲本DNA,则称为拼接重组 体(splice recombinant),此种重组又叫做交 互重组(reciprocal recombination)。
3、分支迁移
两个双螺旋形成的交 叉连接很容易以拉链 式效应扩散,也就是 链交换可沿着双链滑 动,这个过程称为分 支迁移(branch migration)
4、Holliday结构
重组中连接两个 DNA双链的交换 中间物含有4股 DNA链,在其连 接处为了转换配 对所形成交叉链 的连接点称为 Holliday结构。
转化(transformation)、 转导(transduction)、 细胞融合(cell fusion)。
1、细菌的接合作用
细菌的细胞相互接触时遗传信息可由一个细胞转移到另一细胞,称为接合作 用。供体细胞为雄性,受体为雌性。通过接合而转移DNA的能力由接合质粒 提供,与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。能够促使染色体基因 转移的接合质粒称为致育因子(fertility factor),简称性因子或F因子。
3、细菌的转导
转导(transduction)是通 过噬菌体将细菌基因从供体 转移到受体细胞的过程。
4、细菌的细胞融合
在有些细菌的种属中可发生由 细胞质膜融合导致的基因转 移和重组。
三、大肠杆菌重组的分子基础
在细菌重组反应中活性最为明显的是由 大肠杆菌染色体上rec 基因和ruv 基因 编码的一些酶。
RedET同源重组技术概述.pptx
引物设计方法
同源臂的长度在15~50bp时,重组效率就能满足实验要求, 重组效率随着同源臂长度的增加而增加。
同源臂长度对Red/ET重组效率的影响(数据来自Zhang et al. 1998)
源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA,露出粘性末端(15-50bp)。 随后重组酶介导单链退火修复(single- strand annealing),即载体 和插入片段的黏性末端(15-50bp) 互补形成稳定的带缺刻的环状重组 质粒,转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα:以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白, 5’-3’外切 酶活性。
Redα结构(A)和与DNA相互作用的模式(B) (图片来自Subramanian et al. 2003)
Redβ:与ssDNA结合形成丝状体,催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ:抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶 (Redα/Redβ 或者RecE/RecT)协同配合完成重组作用;
recE = red α :5’→3’ dsDNA核酸外切酶;
recT = redβ :ssDNA结合和退火蛋白;
3. 特点:
Red同源重组技术具有同源序列短(15~50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突 变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可 直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也 可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。
RedET同源重组技术概述(PPT 49页)
Red同源重组原理示意图
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) SC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡,这样才能使生物 体得以生存并能世代相传,繁衍不息。
2. RecE和RecT
RecE:C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需,对5’端为羟 基的底物也有活性。 RecT:与ssDNA结合形成丝状体,催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA 4个亚基形成有活性的RecA蛋白,细菌中广泛存在且高度保
守,有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等,提高电击后细胞的活
“线状DNA+线状DNA”重组,选用RecE/RecT重组酶系统; “线状DNA+环状DNA”重组,选用Redα/Redβ重组酶系统;
根据需要选择含不同抗生素抗性基因(Ampr、Hygr、Tetr)和不同 的诱导型启动子(pBAD、pTet)的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
引物设计方法
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) SC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡,这样才能使生物 体得以生存并能世代相传,繁衍不息。
2. RecE和RecT
RecE:C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需,对5’端为羟 基的底物也有活性。 RecT:与ssDNA结合形成丝状体,催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA 4个亚基形成有活性的RecA蛋白,细菌中广泛存在且高度保
守,有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等,提高电击后细胞的活
“线状DNA+线状DNA”重组,选用RecE/RecT重组酶系统; “线状DNA+环状DNA”重组,选用Redα/Redβ重组酶系统;
根据需要选择含不同抗生素抗性基因(Ampr、Hygr、Tetr)和不同 的诱导型启动子(pBAD、pTet)的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
引物设计方法
RedET同源重组技术概述(PPT 49页)
• 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生, 一种是突变,一种是遗传重组。
广义遗传重组:任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组:涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类(DNA序列、蛋白质因子)
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、 什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组 酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同
六、 Red/ET重组技术的主要应用
1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆(Subcloning) 4. 直接克隆(Direct cloning)
1. 重组质粒的构建
(1) 传统基因克隆技术的缺点
➢ 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切
酶的消化,当缺
少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时,
降低模板对筛选工作带来的难度;
(1)纯化回收PCR产物; (2)内切酶消化处理模板; (3)使用R6K复制子。
3. 线性载体的制备
线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1)酶切
选取合适的位点,单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底,将导致阴性 克隆的产生,为了提高阳性率,建议通过双酶切进行质粒线性化。 2)PCR扩增
“质粒多聚体”问题解决办法:
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式; 利用RecE/RecT重组酶系统;
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因(Kan)替换pUC19中的氨苄抗性基因(Amp)
解决办法: 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式; 利用RecE/RecT重组酶系统; 减低质粒拷贝数。
广义遗传重组:任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组:涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类(DNA序列、蛋白质因子)
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、 什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组 酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同
六、 Red/ET重组技术的主要应用
1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆(Subcloning) 4. 直接克隆(Direct cloning)
1. 重组质粒的构建
(1) 传统基因克隆技术的缺点
➢ 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切
酶的消化,当缺
少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时,
降低模板对筛选工作带来的难度;
(1)纯化回收PCR产物; (2)内切酶消化处理模板; (3)使用R6K复制子。
3. 线性载体的制备
线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1)酶切
选取合适的位点,单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底,将导致阴性 克隆的产生,为了提高阳性率,建议通过双酶切进行质粒线性化。 2)PCR扩增
“质粒多聚体”问题解决办法:
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式; 利用RecE/RecT重组酶系统;
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因(Kan)替换pUC19中的氨苄抗性基因(Amp)
解决办法: 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式; 利用RecE/RecT重组酶系统; 减低质粒拷贝数。
植物分子生物学植物基因的同源克隆PowerPoint 演示文稿
18
植物总RNA提取的难点 1.内外源RNase的污染。 2.多酚类物质的干扰 3.蛋白质的干扰 4.多糖的干扰
19
创造一个无RNase的环境
20
1.器械的消毒:用0.1%DEPC—二乙基焦碳酸盐 (Diethyl Pyrocarbonate )浸泡处理2hr以上, 然后高压灭菌去除DEPC;或高温(250℃) 干热消毒4hr以上或200℃干热消毒过夜。
9
植物DNA提取的难点
1.多酚类物质的干扰:多酚类物质被氧化后,与DNA 分子发生不可逆的结合,使提取的DNA样品呈棕 褐色。
2.多糖类物质的干扰:多糖与DNA形成粘稠的胶状 复合物,DNA被包埋在这种复合物中难于溶解。
3.其它次生物质的干扰:乳胶、树脂等,与DNA共 沉淀。 这种褐色、粘稠的DNA不易被限制性内切酶和Taq DNA聚合酶所识别,从而导致PCR扩增和酶切的 失败 。
29
植物RNA提取过程中蛋白质污染的排除
30
1.在冷冻条件下研磨植物材料,以抑制 RNase的活性。 2.在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂(苯 酚、胍、SDS、CTAB等)。 3.利用蛋白酶K降解蛋白质。 4.利用苯酚、氯仿抽提。 5.用70%高氯酸钠溶液沉淀蛋白质。
31
植物DNA和RNA的检测
5.研磨时加入大分子聚合物或吸附剂除多酚: PVP、PVPP:2-6.0%(W/V);活性炭: 0.1-0.3%(W/V)。
13
6.高盐去多糖法:在氯仿/异戊醇的抽提后的水相 中加入0.5V的5MNaCl混匀,然后加入2V的无 水乙醇沉淀DNA,大部分多糖留在上清液中; 在DNA的水溶液中,加入5MNaCl使其终浓度 为0.5-3.0M,以2.0M除糖效果最好。
植物基因的同源克隆
植物总RNA提取的难点 1.内外源RNase的污染。 2.多酚类物质的干扰 3.蛋白质的干扰 4.多糖的干扰
19
创造一个无RNase的环境
20
1.器械的消毒:用0.1%DEPC—二乙基焦碳酸盐 (Diethyl Pyrocarbonate )浸泡处理2hr以上, 然后高压灭菌去除DEPC;或高温(250℃) 干热消毒4hr以上或200℃干热消毒过夜。
9
植物DNA提取的难点
1.多酚类物质的干扰:多酚类物质被氧化后,与DNA 分子发生不可逆的结合,使提取的DNA样品呈棕 褐色。
2.多糖类物质的干扰:多糖与DNA形成粘稠的胶状 复合物,DNA被包埋在这种复合物中难于溶解。
3.其它次生物质的干扰:乳胶、树脂等,与DNA共 沉淀。 这种褐色、粘稠的DNA不易被限制性内切酶和Taq DNA聚合酶所识别,从而导致PCR扩增和酶切的 失败 。
29
植物RNA提取过程中蛋白质污染的排除
30
1.在冷冻条件下研磨植物材料,以抑制 RNase的活性。 2.在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂(苯 酚、胍、SDS、CTAB等)。 3.利用蛋白酶K降解蛋白质。 4.利用苯酚、氯仿抽提。 5.用70%高氯酸钠溶液沉淀蛋白质。
31
植物DNA和RNA的检测
5.研磨时加入大分子聚合物或吸附剂除多酚: PVP、PVPP:2-6.0%(W/V);活性炭: 0.1-0.3%(W/V)。
13
6.高盐去多糖法:在氯仿/异戊醇的抽提后的水相 中加入0.5V的5MNaCl混匀,然后加入2V的无 水乙醇沉淀DNA,大部分多糖留在上清液中; 在DNA的水溶液中,加入5MNaCl使其终浓度 为0.5-3.0M,以2.0M除糖效果最好。
植物基因的同源克隆
实验同源重组PPT讲稿
λ噬菌体的pL操纵子示意图来自l phagegba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶 (Redα/Redβ 或者RecE/RecT)协同配合完成重组作用;
recE = red α :5’→3’ dsDNA核酸外切酶;
recT = redβ :ssDNA结合和退火蛋白;
实验同源重组课件
内容
一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持
一个恰到好处的平衡,这样才能使生物 体得以生存并能世代相传,繁衍不息。
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα:以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白, 5’-3’外切 酶活性。
Redα结构(A)和与DNA相互作用的模式(B) (图片来自Subramanian et al. 2003)
Redβ:与ssDNA结合形成丝状体,催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ:抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
“线状DNA+线状DNA”重组,选用RecE/RecT重组酶系统; “线状DNA+环状DNA”重组,选用Redα/Redβ重组酶系统;
根据需要选择含不同抗生素抗性基因(Ampr、Hygr、Tetr)和不同 的诱导型启动子(pBAD、pTet)的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
《遗传学遗传重组》课件
在DNA修复过程中,重组机制可以起到关键作用。通过重组机制,受损或突变的DNA可以 与正常的DNA进行交换,从而实现DNA的修复和重排。
DNA修复机制在维持基因组稳定性和防止基因突变等方面具有重要作用。
03
遗传重组的生物学 意义
维持基因组的稳定性
遗传重组可以修复和纠正基因组中的 突变和异常,保持基因组的稳定性和 遗传信息的完整性。
通过遗传重组,可以消除有害突变, 防止它们在基因组中积累,从而维持 基因组的稳定性。
促进生物进化
遗传重组是生物进化的重要驱动力之一,它能够产生新的基 因组合和变异,为生物适应环境变化提供物质基础。
通过遗传重组,生物可以产生新的性状和特征,增加物种的 适应性和多样性,促进生物进化。
在生物发育过程中的作用
转座重组的机制
转座重组是指DNA片段从一个位置转移到另一个位置的重组方式。
在转座重组过程中,转座子首先从原位置上切割下来,然后通过与新位置上的靶序 列的转座酶的作用,将转座子插入到新位置上。
转座重组在基因组重排、基因表达调控和进化等方面具有重要作用。
重组的DNA修复机制
DNA修复是指对受损或突变的DNA进行修复的过程。
《遗传学遗传重组》 ppt课件
目录
CONTENTS
• 遗传重组的概述 • 遗传重组的机制 • 遗传重组的生物学意义 • 遗传重组的应用 • 遗传重组的挑战和前景 • 参考文献
01
遗传重组的概述
遗传重组的定义
遗传重组是指生物体在DNA复制过程中,由于DNA的两条链发生断裂,然后通 过同源或非同源的DNA片段交换,重新连接形成新的DNA分子的过程。
遗传重组也是生物多样性的重要来源 之一,它能够促进物种的进化和发展 。
DNA修复机制在维持基因组稳定性和防止基因突变等方面具有重要作用。
03
遗传重组的生物学 意义
维持基因组的稳定性
遗传重组可以修复和纠正基因组中的 突变和异常,保持基因组的稳定性和 遗传信息的完整性。
通过遗传重组,可以消除有害突变, 防止它们在基因组中积累,从而维持 基因组的稳定性。
促进生物进化
遗传重组是生物进化的重要驱动力之一,它能够产生新的基 因组合和变异,为生物适应环境变化提供物质基础。
通过遗传重组,生物可以产生新的性状和特征,增加物种的 适应性和多样性,促进生物进化。
在生物发育过程中的作用
转座重组的机制
转座重组是指DNA片段从一个位置转移到另一个位置的重组方式。
在转座重组过程中,转座子首先从原位置上切割下来,然后通过与新位置上的靶序 列的转座酶的作用,将转座子插入到新位置上。
转座重组在基因组重排、基因表达调控和进化等方面具有重要作用。
重组的DNA修复机制
DNA修复是指对受损或突变的DNA进行修复的过程。
《遗传学遗传重组》 ppt课件
目录
CONTENTS
• 遗传重组的概述 • 遗传重组的机制 • 遗传重组的生物学意义 • 遗传重组的应用 • 遗传重组的挑战和前景 • 参考文献
01
遗传重组的概述
遗传重组的定义
遗传重组是指生物体在DNA复制过程中,由于DNA的两条链发生断裂,然后通 过同源或非同源的DNA片段交换,重新连接形成新的DNA分子的过程。
遗传重组也是生物多样性的重要来源 之一,它能够促进物种的进化和发展 。
同源重组的应用专题讲义PPT(20张)
◆ 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物 学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的 技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理 ,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原 理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和 iRNA,它们同样可以达到基因敲除的目的。 ◆基因敲除和敲进的原理都是同源重组,即同源双交换,用 克隆的外源基因取代基因组中野生型等位基因。 ◆两者不同点在于,基因敲除导入的外源基因是失活的、无 功能的基因,基因敲进导入的是有活性和功能的基因。因 而两者的具体用途有所不同。 ◆基因敲除和敲进都可用于基因功能的研究,基因敲进则也 可用于突变基因的修复。
一、转基因动物 ◆转基因动物是把外源基因导入
动物的生殖细胞中,并整合该
细胞后发育成为个体整合的外 源基因,整合的外源基因又能 影响其后代遗传的动物。
转基因动物生产药用蛋白的基本过程
药用蛋白基因→表达细胞株→细胞核 受体动物
供体动物→受精卵→无核受精卵→组装的核细胞→多细胞胚胎→假孕
动物→动物幼崽→雌性转基因动物→乳汁→药用蛋白
同源重组的应用 09生工夏章传
同源重组概述 同源重组(homologous recombination) ◆即一般重组,是染色体之间进行遗传信息的方式之一,几乎所 有生物都发生同源重组。 ◆如真核生物减数分裂中染色体的交换,细菌结合、转化、普遍 性转导的遗传重组都属于同源重组。 ◆同源重组要求两个DNA分子的序列同源,同源区越长越有利于 重组;同源区太短,则难于发生重组。因为它依赖于大范围 DNA同源顺序的联会,负责DNA配对和重组的蛋白质因子无碱 基序列特异性,只要两条DNA序列相同或相近,重组便可以在 联会部分的任何位置发生。当然,也存在重组热点,即某些序 列发生重组的概率高于其它序列。 ◆同源重组也是对损伤DNA修复的一种重要途径,即重组修复。
实验同源重组PPT讲稿
Red同源重组原理示意图
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) pSC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
“质粒多聚体”问题解决办法:
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式; 利用RecE/RecT重组酶系统;
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因(Kan)替换pUC19中的氨苄抗性基因(Amp)
解决办法: 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式; 利用RecE/RecT重组酶系统; 减低质粒拷贝数。
插入选择标记
插入无选择标记的DNA片段
E. coli染色体上插入抗性基因
传统基因工程技术(A)和Red/ET重组技术(B)修饰E.coli染色体实验步骤比较
3. 亚克隆 (Subcloning)
4. 直接克隆 (Direct cloning)
(A)亚克隆和直接克隆示意图
(B) 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白,在重组酶系统(Redα/Redβ或 RecE/RecT)的相互配合下,含短同源臂(15~50bp)的供体
DNA分子能直接重组到受体DNA分子上,实现替换、插入、删 除、突变等;
3. 特点:
Red同源重组技术具有同源序列短(15~50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) pSC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
“质粒多聚体”问题解决办法:
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式; 利用RecE/RecT重组酶系统;
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因(Kan)替换pUC19中的氨苄抗性基因(Amp)
解决办法: 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式; 利用RecE/RecT重组酶系统; 减低质粒拷贝数。
插入选择标记
插入无选择标记的DNA片段
E. coli染色体上插入抗性基因
传统基因工程技术(A)和Red/ET重组技术(B)修饰E.coli染色体实验步骤比较
3. 亚克隆 (Subcloning)
4. 直接克隆 (Direct cloning)
(A)亚克隆和直接克隆示意图
(B) 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白,在重组酶系统(Redα/Redβ或 RecE/RecT)的相互配合下,含短同源臂(15~50bp)的供体
DNA分子能直接重组到受体DNA分子上,实现替换、插入、删 除、突变等;
3. 特点:
Red同源重组技术具有同源序列短(15~50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
DNA重组PPT课件
• 两个插入序列中间夹着一段序列即可构成一个转座单 位。
• 每个插入序列两端为反向重复,因此,无论两插入序 列处于正向还是反向位置,作为转座单位其两端均有 可被转座酶识别的反向重复序列。
.
36
• 如果两个插入序列正好位于抗性基因两侧,该转座单 位携带的性状对宿主细胞是有利的,因而具有选择优 势。
• 复合型转座子的两个插入序列以正向或反向(更常见) 位于两端,它们的序列可以不完全相同,有时只有一 个插入序列具有转座活性,另一个已在多次传代中失 去活性。
.
4
联会(synapsis),亦称配对,指同源染色体两两配对。在细 胞减数分裂前期的偶线期,来自父本和母本的同源染色体,两 两靠拢进行准确的配对,形成四分体,即一对染色体含有四条 染色单体,但仅有两个着丝点,是减数分裂的重要特征。
联会是在减数分裂的偶线期两条同源 染色体侧面紧密相贴并进行配对的现象。 联会染色体间的配对是专一性的, 可以同 时发生在分散的几个点上。
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12
.ห้องสมุดไป่ตู้
13
“patch recombinants”
.
14
.
15
图6-1 同源重组的Holliday模型
图6-2 电镜下的Holliday连接
.
16
6.1.1.3 双链断裂模型
一个DNA分子上两条链的断裂才启动了链的交换。 产生断裂的双链称为受体双链(recipient duplex),不产 生断裂的称为供体双链(donor duplex)。
当供体双链被取代的链到达受体双链空
隙的另一侧,它将和空隙末端的另一个
3’-单链末端退火。于是被取代的单链提
供了序列,填补了受体双链一开始被切
除的序列。
• 每个插入序列两端为反向重复,因此,无论两插入序 列处于正向还是反向位置,作为转座单位其两端均有 可被转座酶识别的反向重复序列。
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• 如果两个插入序列正好位于抗性基因两侧,该转座单 位携带的性状对宿主细胞是有利的,因而具有选择优 势。
• 复合型转座子的两个插入序列以正向或反向(更常见) 位于两端,它们的序列可以不完全相同,有时只有一 个插入序列具有转座活性,另一个已在多次传代中失 去活性。
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联会(synapsis),亦称配对,指同源染色体两两配对。在细 胞减数分裂前期的偶线期,来自父本和母本的同源染色体,两 两靠拢进行准确的配对,形成四分体,即一对染色体含有四条 染色单体,但仅有两个着丝点,是减数分裂的重要特征。
联会是在减数分裂的偶线期两条同源 染色体侧面紧密相贴并进行配对的现象。 联会染色体间的配对是专一性的, 可以同 时发生在分散的几个点上。
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.ห้องสมุดไป่ตู้
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“patch recombinants”
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图6-1 同源重组的Holliday模型
图6-2 电镜下的Holliday连接
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6.1.1.3 双链断裂模型
一个DNA分子上两条链的断裂才启动了链的交换。 产生断裂的双链称为受体双链(recipient duplex),不产 生断裂的称为供体双链(donor duplex)。
当供体双链被取代的链到达受体双链空
隙的另一侧,它将和空隙末端的另一个
3’-单链末端退火。于是被取代的单链提
供了序列,填补了受体双链一开始被切
除的序列。
同源重组的分子机制PPT课件
pdx +
--
-+
-+
-+
+
+
+
+
+-
+-
-+
-+
-+
基因转-变+(gene conve-rs-ion):一个基因- 转+ 变为它的等位
基因的遗++ 传学现象(源++于基因内重组)。++
+-
+-
+-
-+
-+
-+
-+
+-
+
+-
+
+-
染色单体转变粪生粪壳菌(Oliv半e)染: 色g单+ ×体转g 变-
A
B
a
C
b
a
T
b
A
G
b
A
A
b
a
T
B
a
C
B
哈工大-遗传学
第六章 同源重组的分子机制
哈工大-遗传学
第六章 同源重组的分子机制
Holliday 模型中,由于重组而产生的异源双链区存在 不配对碱基,可被细胞内的修复系统能够识别并以一条链 为模板进行切除修复:
(1). 两个杂种分子均未得到校正,有丝分裂后分离形成4:4 或 3:1:1:3的异常孢子分离比,属于半染色单体转变;
基因转变的实质:重组过程中留下的局部异源双链 区,在细胞内的修复系统识别下不同的修复产生的 结果;
哈工大-遗传学
第六章 同源重组的分子机制
哈工大-遗传学
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① 研究基因功◆能细菌和一些低
等真核生物在
进行基因取代
时,克隆的基
因能精确地插
入到染色体的
同源部位,所
以他们是研究
◆基因取代法除成功用于细菌和酵母菌的基因基分因析外取,代还的成功理
地应用到老鼠和鸡的基因功能分析中。
想材料。
② 转基因动物的制备
◆◆转基转因动基物因的应动用领物域 的应用领域
1、生物反应器:药用或食品蛋白的大量生 产,即转基因动物制药;
“生物反应器”生产药 ◆转基因动物生物产。药物不仅开辟了制药业的新纪
元,而且它也是转基因动物研究最活跃的领域。
◆基因工程药物3 个阶段:
1、细菌基因工程,即把目的基因通过适当的改建导 入大肠杆菌中,再通过细菌等原核微生物表达的目 的蛋白作为药物;
2、是细胞基因工程药物,这是把人或哺乳动物的基 因直接导入哺乳动物的细胞中,生产有生物活性的 产品;
◆基因敲除和敲进的原理都是同源重组,即 同源双交换,用克隆的外源基因取代基因 组中野生型等位基因。
◆两者不同点在于,基因敲除导入的外源基 因是失活的、无功能的基因,基因敲进导 入的是有活性和功能的基因。因而两者的 具体用途有所不同。
◆基因敲出实小际鼠操基因敲除实验
作简要步骤:
1、克隆目的基因及 其两侧的DNA序 列。
◆动物模型的意义和优越性 : (一)避免了在人身上进行实验所带来的风险 。 (二)临床上平时不易见到的疾病可用动物随时
复制出来。 (三)可以克服人类某些疾病潜伏期长,病程长
和发病率低的缺点 。 (四)可以严格控制实验条件,增强实验材料的
可比性 。 (五)可以简化实验操作和样品收集 。 (六)有助于更全面地认识疾病的本质。
◆转基因动物生产药物的优点:
1、品种多、产量高、质量好。 2、设备简单、不耗能、无环镜污染。 3、生产周期短。 4、生产成本低。
◆2006年报道:我国目前已有乳铁蛋白、白蛋 白、凝血因子等进入临床试验阶段,首个转 基因动物生产的药物有望在5年内上市。“究 竟是哪种转基因药物率先上市,还得由临床 疗效说了算。”
◆基因敲进(knock in of gene):利用基因同 源重组,将外源有功能的基因转入基因组中 不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源
◆ 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物 学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的 技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理 ,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原 理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和 iRNA,它们同样可以达到基因敲除的目的。
③ 用于药物筛选的动物模型
◆用于药物筛选的动物模型例如: 帕金森病动物模型,用于药物筛选。 建立抗丙型肝炎病毒药物筛选的动物模型。 精神分裂症动物模型及其药物筛选。 高尿酸血症动物模型的建立及抗痛风中药的筛选。 ◆要求: (一)相似性 (二)重复性 (三)可靠性 (四)适用性和可控性
③ 用于药物筛选的动物模型
3、其三是利用转基因动物生产低成本、高活性的药 物。
◆转基因动物是一把、外转源基基因动物
因导入动物的生殖细胞 中,并整合该细胞后发 育成为个体整合的外源 基因,整合的外源基因 又能影响其后代遗传的 动物。
转基因动物生产药用蛋白的基本过程
药用蛋白基因→表达细胞株→细胞核
受体动物
供体动物→受精卵→无核受精卵→组装的核细胞→多细胞胚胎→假孕 动物→动物幼崽→雌性转基因动物→乳汁→药用蛋白
同源重组的应用
◆同源重组的应用价值 主要是用于基因敲除(knock-out)和基因敲 进(knock-in)
❖ ① 研究基因功能
❖ ② 转基因动物的制备
基因敲进和敲进
◆基因敲除(knock out of gene):是基因打靶 技术的一种,指外源DNA与受体细胞基因组 中序列相同或相近的基因发生同源重组,从 而代替受体细胞基因组中的相同或相似的基 因序列,整合入受体细胞的基因组中。
2、通过插入抗性基 因或者DNA缺失, 对克隆的目的基因 进行体外遗传改造, 使克隆的目的基基因序列 两侧或外面的断裂点,用同源序列的目的基 因整个置换内源基因。目前用于基因敲除的 技术有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。
◆此法可产生精确的基因突变,也可正确纠正 机体的基因突变。
2、疾病的动物模型:用于研究、药物筛选、 药物治疗、毒物测试;
3、通过增加或删除基因来研究基因的功能、 调控和发育,如癌基因、免疫系统等;
4、异种器官的移植; 5、家畜品种的改良。
③ 用于药物筛选的动物 模型
◆诱发性或实验性动物模型 (ExperimentalAnimalModels)
用同源重组的方法,将致病因素作用于动物, 造成动物组织、器官或全身一定的损害,出现 某些类似人类疾病时的功能、代谢或毒使动物 患相应的传染病,又如用化学致癌剂、放射线、 致癌病毒诱发动物的肿瘤等。诱发性疾病动物 模型具有能在短时间内复制出大量疾病模型, 并能严格控制各种条件使复制出的疾病模型适 合研究目的需要等特点,因而为近代医学研究 所常用,特别是药物筛选研究工作所首选。但 诱发模型和自然产生的疾病模型在某些方面毕
同源重组概述
同源重组(homologous recombination) ◆即一般重组,是染色体之间进行遗传信息的
方式之一,几乎所有生物都发生同源重组。
◆如真核生物减数分裂中染色体的交换,细菌 结合、转化、普遍性转导的遗传重组都属于 同源重组。
◆同源重组要求两个DNA分子的序列同源,同 源区越长越有利于重组;同源区太短,则难 于发生重组。因为它依赖于大范围DNA同源
◆转基因动物就是指通过实验方法,人工地把 外源基因导入动物的受精卵, 使外源基因与
动物本身的基因组整合在一起,因而外源基 因能随细胞的分裂而增殖,并能稳定地遗传 给下一代。在此基础上,人们只要将事先提
The end, thanks!