蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解课件

五、分析鉴定
A、定性分析 、
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量：是在聚 丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂 丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂 分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构， 分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂 能使半胱氨酸之间的二硫键断裂， 能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还 原剂的SDS溶液中 溶液中， SDS分子按比例结合 分子按比例结合， 原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的 SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS， SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质 丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子 团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异， 团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异， 由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的 因此在进行电泳· 与蛋白质的结合是按重量成比例的， 由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳·时， 蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。 蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时 当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁 之间时， 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX， logMW=K-bX， 式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 为分子量， 为迁移率， 式中：MW为分子量 数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线， 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳， 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。 可在标准曲线上求得分子量。
值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 值得注意的是，在洗脱时， 质一同被洗脱下来， 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。 以除去小分子的配基。
凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合 属最常用的蛋白质分离方法。
物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中， 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞， 缓慢，致使最后流出柱外。 缓慢，致使最后流出柱外。
三、蛋白质粗提取
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步骤： 步骤： ：利用蛋白质在 原理： 原理 利用蛋白质在PH等电点时的溶 等电点时的溶 1．向试管中加入磷酸氢二钠和柠檬酸，使其。 ．向试管中加入磷酸氢二钠和柠檬酸，使其PH=4。 解度最小，因而会以沉淀的方式析出。 。 解度最小，因而会以沉淀的方式析出 2．将提取的溶液加入到第 步骤所配的缓冲液中。 步骤所配的缓冲液中。 ．将提取的溶液加入到第1步骤所配的缓冲液中 试剂：柠檬酸、 试剂：柠檬酸、磷酸氢二钠 3．静置一段时间，待沉淀完全。 ．静置一段时间，待沉淀完全。 4．过滤或离心出粗产品。 ．过滤或离心出粗产品。 注意事项：防止局部过酸或过碱造成蛋白质变性。 注意事项：防止局部过酸或过碱造成蛋白质变性。
一、材料的选定：大鼠脑组织 材料的选定： 预处理： 将切取的组织用4℃预 预处理： 将切取的组织用4 冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血渍 漂洗去血渍， 冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再用 滤纸吸干残留的PBS（ 滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲液 ） 。
二、a 细胞的破碎
⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破 常用器械有： 玻璃匀浆器（ 坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相 互摩擦，将细胞磨碎） 高速组织捣碎机（ 互摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可 ），宜用于 达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于 ，具高速转动的锋利的刀片）， 动物内脏组织的破碎 主要通过各种物理因素的作用， ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织 细胞破碎的方法。 细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超 声波法 ⑶化学及生物化学方法
个阶段： 整个实验过程一般可分为 5 个阶段：
细胞的破碎（ ①材料的选择和预处理 ②细胞的破碎（有时 需进行细胞器的分离） 纯化（ 需进行细胞器的分离）③提取 ④纯化（包括等 电点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、 电点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、 分析鉴定。 等）⑤分析鉴定。
实验步骤： 实验步骤：
四、精细纯化
金属螯合亲和层析 固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面 的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来进行 蛋白质分离的一项技术。 蛋白质分离的一项技术。过渡态金属离子能够与电 子供体，如氮、 氧等原子以配位键结合， 子供体，如氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属 离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点， 离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，当它在 溶液中会被水分子或阴离子占据。 溶液中会被水分子或阴离子占据。 钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端 有两个球形的末端,中 钙调蛋白的外形似哑铃 有两个球形的末端 中 间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端 间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连 每个末端 有两个Ca 结构域,每个结构域可以结合一个 每个结构域可以结合一个Ca 有两个 2+ 结构域 每个结构域可以结合一个 2+ , 这样,一个钙调蛋白可以结合 一个钙调蛋白可以结合4个 钙调蛋白与 这样 一个钙调蛋白可以结合 个Ca2+ ,钙调蛋白与 Ca2+ 结合后的构型相当稳定 。
生化实验设计 ——蛋白质的提取与分离纯化 ——蛋白质的提取与分离纯化
主讲人： 主讲人：
第三组组员： 第三组组员：
华中师范大学化学学院
已知某蛋白的分子量约为17 已知某蛋白的分子量约为 kDa，等电点 ， 3.9~4.1，它能耐一定的高温，在90 °C加热 ，它能耐一定的高温， 加热 3~4 min后仍然能够保持 后仍然能够保持80%的活性。该蛋白 的活性。 后仍然能够保持 的活性 含有较多的疏水性残基， 含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴 露它的疏水基团。 露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体 内酶的激活剂。 内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和 分离纯化该蛋白的实验方案， 分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的 步骤和理由，以及检测方法。 步骤和理由，以及检测方法。
文献查得： 文献查得： 钙调蛋白（CaM）是由148个氨基 钙调蛋白（CaM）是由148个氨基 酸组成的单链分子, pI值在3.9-4.1之 酸组成的单链分子,其pI值在3.9-4.1之 间,分子量约为17KDa.该蛋白能够耐一 分子量约为17KDa. 定的高温，在90 加热3 4min后仍然 定的高温，在90oC加热3-4min后仍然 能够保持80%的活性。该蛋白分子中 能够保持80%的活性。该蛋白分子中 含有较多的疏水性残基，与Ca 含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合 后可以暴露出它的疏水基团。
玻璃匀浆机
b、细胞器的分离 、
细胞器的分离一般采用差速离心法 细胞器的分离一般采用差速离心法。细 离心 胞经过破碎后， 胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。 离心。
三、蛋白质粗提取
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 需进一步纯化。 需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质 分开，将各种不同的蛋白质分开。 分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是 有其它物质伴随混入提取液中。 有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质 如脂肪）以事先除去为宜。 （如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。 操作。常用有机溶剂提取除去。
B、定量分析 、
紫外检测法、考马斯亮蓝法、Folin-酚试剂法（最常用方法） 紫外检测法、考马斯亮蓝法、Folin-酚试剂法（最常用方法） Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下， 酚试剂法包括两步反应： 是在碱性条件下， 酚试剂法包括两步反应 蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物 铜络合物； 蛋白质与铜作用生成蛋白质 铜络合物；第二步是此络合物 将磷钼酸-磷钨酸试剂 磷钨酸试剂（ 试剂）还原， 将磷钼酸 磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色 磷钼蓝和磷钨蓝混合物）， ），颜色深浅与蛋白质含量成正 （磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正 此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范 比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高 围为5～ 蛋白质。 试剂显色反应由酪氨酸、 围为 ～100µg 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色 氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、 氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和 巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、 巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、 色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。 色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。