残留溶剂检查方法研究

原料药或制剂中有机溶剂的残留量一般要求控制在几个至几千个ppm之间，属于微量或痕量测定，与常量测定有着不同的特点。

残留溶剂检查方法的选择对测定结果有着重要的影响，有时采用不同的方法测定同一个样品会得到截然不同的结果。

通过对最近一段申报资料的审评，经常发现在残留溶剂的检查方法尚不合理的情况下，若样品的色谱图中未出现溶剂峰，也未经其它系统验证，研究者就简单地作出样品无该溶剂残留的结论，进而不将其残留定入质量标准，药检所也不再进行复核。

针对这种情况，从审评的角度出发，就如何评价残留溶剂检查方法的合理性谈自己的一些认识，与各位业内同仁交流。

有机残留溶剂检查一般采用气相色谱法，评价色谱系统的适用性和方法学验证资料遵循与液相色谱方法评价相同的原则，不再赘述。

与液相方法不同的是，气相色谱有多种进样方式，残留溶剂检查常用直接进样法或顶空进样法。

针对这两种进样方法不同的特点，评价方法合理性的要点应有所不同。

对于直接进样法，应着重评价方法的灵敏度和重复性。

目前已普遍用毛细管柱取代填充柱，因为毛细管柱的柱效高，其灵敏度也较填充柱大为提高。

但由于毛细管柱直接进样的体积小，一般仅几微升，即使提高供试溶液的浓度，对于测定限量极低的溶剂（如：苯、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等）及对FID检测器响应低的溶剂（如：含氯的溶剂），其检测限一般接近或高于限量，灵敏度难以满足测定的需要。

测定此类溶剂最好采用顶空进样法，对含卤素的溶剂可改用电子捕获检测器（ECD）。

进样量小也易造成进样重复性差，采用内标法较外标法的结果更为准确。

顶空进样法是将大量样品中的残留溶剂富集在顶空瓶上层的气体中，对绝大多数有机溶剂而言，灵敏度较直接进样法大为提高，但顶空进样系统中存在气液两相的平衡问题，对结果准确性的影响因素增多。

评价方法是否合理，应着重关注以下三个方面：1）顶空条件：顶空瓶的平衡温度和时间是最重要的参数，根据溶解样品的溶剂和待测溶剂的不同性质，达到气液平衡所需的温度和时间可能不同，应有试验数据作为选择的依据，但在申报资料中一般都未提及。

判断顶空条件是否适用，一般的规律是：顶空瓶的平衡温度应低于溶解样品所用溶剂的沸点10℃以下，能满足检测灵敏度即可；对于沸点过高的溶剂，如DMF、DMSO、聚乙二醇等，用顶空进样测定的灵敏度不如直接进样，不适宜采用顶空法；顶空瓶的平衡时间一般应为30至60分钟，才能保证气液两相达到稳态平衡。

2）供试品和对照品是否平行：由于供试品和对照品的液体部分状态不完全一致而造成的基质效应会直接影响到结果的准确性。

采用标准加入法可以消除基质效应，但目前在国内的申报资料中较少见到，其原因可能是方法较为繁琐，且需要消耗大量的样品，对新药研发初期样品量较少的情况或一些贵重的药品不太适用。

如果申报资料中提供了回收率数据，就容易判断基质效应的大小，但由于目前对此没有强制要求，大多数资料都未对回收率进行研究。

因此在评价方法时，至少应要求对照品和供试品采用相同的溶剂溶解，且液体部分的体积应完全一致。

3）重复性：由于顶空进样法存在气液平衡和气体进样的问题，粗放度较大，中国药典2005年版的要求是：内标法连续五次进样的相对标准偏差小于5％，外标法的相对标准偏差小于10％；欧洲药典则要求相对标准偏差小于15％，因此重复性应密切关注。

此外，无论是直接进样或顶空进样，都应尽量使供试液中的样品完全溶解，否则当残留溶剂被包裹在样品晶格中时就不能被检测出来，可能造成结果与实际情况完全不符。

对溶解性差的样品，可采用不挥发性酸或碱的溶液、高沸点的有机溶剂、混合溶剂等来溶解样品，即使样品在加热的条件下可能被破坏，只要待测的残留溶剂不被破坏（如：测定酯类溶剂不能采用酸或碱溶液，以免发生分解）且样品的热分解产物不影响测定，那么方法也是可以认可的。

如果确实有一些药物采用上述条件都不能达到溶解，则可考虑采用充分研磨或超声的方法破坏药物的结构，使其中的残留有机溶剂释放出来，当然，这种情况下一般应注意进行相应的方法学验证以确定方法的可行性。

在国外药典中，对残留溶剂检查的规定有所不同，其中以欧洲药典对残溶检查的要求最为严格，它建立了两个极性不同的色谱系统，对色谱系统的选择、色谱条件、溶液的配制方法、系统适用性试验、方法学验证等都作了详细的规定，以保证样品中所有的残留溶剂都能被逐一的、准确的检测出来，避免发生遗漏的情况；根据样品的具体情况选用其中一个系统测定后，还必须用另一系统加以验证，以保证结果的正确性。

欧洲药典的残溶检查方法看似繁琐、呆板，但在其严谨、严格的框架下，结果的可信度、准确度、专属性、耐用性大大提高，值得我们研发者和评价者共同借鉴。

一、概述药物中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中，以及制剂制备过程中使用的，但在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂。

按有机溶剂的毒性和对环境的危害，ICH将有机溶剂分为避免使用、限制使用、低毒和毒性依据尚不足四种情况。

因残留溶剂会影响产品的安全性，故需对其进行研究。

二、残留溶剂检查方法的选择残留溶剂的测定一般采用气相色谱法，推荐使用毛细管色谱柱-顶空进样系统，当然也可以使用普通填充柱，溶液直接进样方法。

对不宜采用气相色谱法测定的含氮碱性化合物，如N-甲基吡咯烷酮等可采用其它方法，如离子色谱法等。

测定残留溶剂应从以下几个方面考虑：确定被测的有机溶剂、选择合适的色谱柱、制备供试品溶液和对照品溶液、选择合适的进样方法和满足检测灵敏度要求的检测器，下面分别进行介绍：1、确定被测的有机溶剂根据制备工艺确定被测有机溶剂的范围。

通常应对制备工艺过程中使用的二类以上溶剂和重结晶用溶剂，以及根据工艺特点要求的其它溶剂进行残留量的研究。

建议对合成最后三步使用的三类溶剂也进行研究，这样能更好地对未知峰进行归属；对制剂过程中使用的有机溶剂也建议考察其残留情况，特别是缓、控释微丸包衣过程使用的有机溶剂更应引起注意。

残留溶剂的限度要求同ICH的规定。

2、选择合适的色谱柱按照相似相溶的原理选择色谱柱。

毛细管柱有极性柱、非极性柱、弱极性柱和中等极性柱。

填充柱有高分子多孔小球或涂渍适宜固定液的填充柱。

测定含氮的碱性有机溶剂时，由于普通气相色谱仪的不锈钢管路、进样器衬管等对有机胺等含氮的碱性化合物具有较强的吸附作用，致使其检出的灵敏度降低。

通常采用弱极性色谱柱或经碱处理过的色谱柱分析含氮的碱性有机溶剂，如果采用胺分析专用柱进行分析，则效果更好。

3、供试品和对照品的制备顶空进样方法通常以水为溶剂，对于非水溶性的药物，可采用DMF、DMSO或其他适宜溶剂。

溶液直接进样方法用水或合适的溶剂溶解样品。

制备供试品的溶剂的选择应兼顾供试品和被测有机溶剂的溶解度，且所用溶剂应不干扰被测有机溶剂的测定。

水是首选溶剂，特别是顶空进样系统。

因为水中不含有机溶剂，故干扰较少，且在FID检测器上，以水为溶剂时，各残留溶剂的灵敏度最高。

当药物不溶于水时，可加入适当的酸或碱以增加药物的溶解度，最好选用不挥发的酸或碱。

以DMSO等为溶剂时，可加入一定量的水以增加检测的灵敏度，或用盐析的方法增加灵敏度。

测定含氮的碱性溶剂时，供试品溶液应不呈酸性，以免被测物与酸反应后不易汽化。

对照品的制备方法应与供试品的制备方法相同。

在申报资料中发现对照品（溶液）为直接进样，供试品则为固体直接顶空进样，供试品和对照品不但制备方法不同，而且进样方法和进样量也不同，无法进行比较。

提请申报单位注意。

4、供试品溶液和对照品溶液浓度的确定配制供试品溶液的浓度应满足定量测定的需要，一般供试品取样量在0.1～1g之间。

限度检查时对照品溶液的浓度可按规定的限度配制，定量测定时按实际残留量配制，浓度相差最好以不超过2倍为宜。

5、检测器的选择一般选用FID检测器，对含卤素的有机溶剂如氯仿等，采用ECD检测器可得到更高的灵敏度。

通常可根据药物溶剂的残留情况选择合适的检查方法。

当需要检查的有机溶剂数量不多，且极性差异较小时，可选择毛细管色谱柱-顶空进样-等温法。

当需要检查的有机溶剂数量较多，且极性、沸点差异较大时，可选择毛细管色谱柱-顶空进样-程序升温法；也可选择填充柱或适宜极性的毛细管柱直接进样法。

限度检查（一类、部分二类溶剂）时采用内标法或外标法；定量测定（含量超过0.1%的二类或需要定量控制的三类溶剂）时采用内标法或标准加入法。

顶空进样法还要对顶空温度和顶空时间进行选择。

顶空温度应根据溶解供试品溶剂的特性及供试品中残留溶剂的沸点选择。

以水为溶剂及测定低沸点残留溶剂时，顶空温度不宜超过85℃；测定沸点较高的残留溶剂时，通常选择较高的顶空温度；但此时应兼顾供试品的热分解特性，尽量避免供试品产生的挥发性热分解产物干扰测定结果。

以DMSO为溶剂时，顶空温度不宜超过115℃。

例如，在申报资料中发现，以水为溶剂，顶空温度为100℃，柱温60℃，结果高浓度的乙腈比低浓度的二氯甲烷的峰面积还小，原因是顶空温度太高，大量的水被蒸发（或浓度被稀释），随着水蒸汽的凝结，在水中溶解度大的乙腈的灵敏度下降，产生了与事实不符的实验结果。

顶空时间是要确保供试品溶液的气-液两相达到平衡，一般通过测定顶空时间与顶空气体浓度的浓度—时间曲线来确定。

顶空时间不宜过长，一般为30～45分钟，如果超过60min，可能引起顶空瓶的气密性变差,导致定量的准确性降低。

如果平衡时间选择10分钟，就不能保证气-液两相达到平衡。

注意对照品溶液与供试品溶液必须使用相同的顶空条件。

甲酰胺、2－甲氧基乙醇、2－乙氧基乙醇、乙二醇、N-甲基吡咯烷酮等不适宜用顶空法测定。

三、残留溶剂检查方法的验证1、系统适用性试验柱效：用被测物的色谱峰计算，填充柱法的理论板数应大于1000，毛细管色谱柱的理论板数应大于5000。

分离度：色谱图中被测物色谱峰与其相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

重复性：以内标法测定时，对照品溶液连续进样5次，所得被测物与内标物峰面积之比的相对标准偏差(RSD)应不大于5%；以外标法测定时，所得被测物峰面积的相对标准偏差(RSD)应不大于10%。

2、准确度在规定的范围内，至少9个测定结果。

设计三个不同的浓度进行测定，计算回收率和相对标准偏差，含量测定的回收率应大于98%。

进行回收率试验时，由于采用顶空进样系统，供试品与对照品处于不完全相同的基质中，此时应考虑气-液平衡过程中的基质效应。

标准加入法可以消除供试品溶液基质与对照品溶液基质不同所致的基质效应的影响，故通常采用标准加入法验证定量方法的准确性。

当标准加入法与其它定量方法的结果不一致时，应以标准加入法的结果为准。

标准加入法为精密称（量）取被测定的残留溶剂对照品适量，配制成适当浓度的对照品溶液，取一定量精密加入到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定残留留剂的含量，再扣除加入的对照品溶液的含量，即得供试液溶液中残留溶剂的含量；或按下式计算残留溶剂的量。