CRISPR_Cas9_基因编辑技术简介24页PPT
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crispr cas9原理简介
crispr cas9原理简介CRISPR-Cas9基因编辑技术，是一种通过靶向剪切基因组中特定DNA序列的方法。
该技术最初源自一种天然的细菌免疫系统，可用于编辑生物体的基因组。
CRISPR（簇状规律间隔短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是细菌和古细菌基因组中的一种特殊DNA序列，以重复、间隔和短回文特点而命名。
CRISPR序列常常与Cas（CRISPR-associated protein）基因一起出现，这些Cas基因编码一类能够识别并修剪DNA的酶。
CRISPR-Cas系统中最常用的是Cas9酶，它是通过向CRISPR-Cas9复合物中引入特定的RNA分子来实现DNA靶向。
这种RNA分子称为单导RNA（sgRNA），它是一种具有20个核苷酸的短链RNA，结合了用于指引Cas9定位到特定目标序列的脱氧核苷酸。
sgRNA与Cas9酶形成复合物后，可以通过碱基互补配对与基因组DNA中的目标序列结合。
当sgRNA与Cas9复合物与目标DNA序列配对时，Cas9酶便会被激活并剪切其靶向序列。
这一过程引发DNA修复机制，使得目标序列得以重组或删除。
如果提供了外源DNA修复模板，修复机制还可以将该模板中的DNA片段插入到被剪切的部分，实现想要的基因修饰。
CRISPR-Cas9技术的优势在于其简单性和高效性。
相较于传统的基因编辑技术，CRISPR-Cas9可以更加准确地指定目标序列，并在短时间内完成基因组的编辑。
它已被广泛应用于基础科学研究、生物医学研究以及农业领域，为基因治疗和作物改良等领域带来了突破性的进展。
crispr-cas基因编辑技术原理与应用PPT精选文档
力因子测试和MLST 基因型明显相关。
31
进展
2 在斑马鱼研究方面，通过注射两个 简单的体外合成的组件(即使用一个密 码子优化的Cas9 和单链向导 sgＲNA) 到单细胞期胚胎中，使目标基因突变。 这种灵活的基因失活的方法为斑马鱼 基因功能和基因相互作用提供了一个 有效的方式。
32
进展
3 干细胞中的定点突变，包括引进或疾病患者特异性突变模 型的修正。然而，在人类胚胎干细胞中将一个报告基因整合成一 种内源性基因还需要漫长艰苦的两步:首先要正确识别目标然后 要排除耐药性。研究发现，tracrＲNA 和crＲNA 分开单独表达， 还能够提高切割的效率。这个发现让大家意识到:可以通过进一 步修改 sgＲNA 的设计方案，让它与双 ＲNA 复合体的结构更加 相近，就能够进一步提高 Cas9 系统的基因组编辑效率。
缺陷
成本高,应用的物种有限,操纵的基因亦有限。
16
基因编辑功能应用
CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能主要应用于在不同物种 的基因组产生需要的等位基因突变,来研究基因功能或建立疾病模 型。
如果CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能如果真如研究者 报道那样强大的话，那该技术在先天性突变或获得突变所致疾病 的修复治疗中将有巨大的潜在价值。这一点还有待研究。
33
进展
4 在拟南芥研究方面，利用C ＲISPＲ/Cas 系统对分裂组织有 针对性地定点诱变产生遗传突变， 结果表明，在拟南芥中使用 CＲ ISPＲ/Cas系统为 RNA 引导的核 酸内切酶(RGEN)定点突变分裂组 织提供了一种有效的遗传基因工 程的方法。
34
进展
5 CRISPR/Cas 的 打 靶 效 率 比 较 高，最
缺陷：1、不能预期引入的ZFN蛋白是
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进展
2 在斑马鱼研究方面，通过注射两个 简单的体外合成的组件(即使用一个密 码子优化的Cas9 和单链向导 sgＲNA) 到单细胞期胚胎中，使目标基因突变。 这种灵活的基因失活的方法为斑马鱼 基因功能和基因相互作用提供了一个 有效的方式。
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进展
3 干细胞中的定点突变，包括引进或疾病患者特异性突变模 型的修正。然而，在人类胚胎干细胞中将一个报告基因整合成一 种内源性基因还需要漫长艰苦的两步:首先要正确识别目标然后 要排除耐药性。研究发现，tracrＲNA 和crＲNA 分开单独表达， 还能够提高切割的效率。这个发现让大家意识到:可以通过进一 步修改 sgＲNA 的设计方案，让它与双 ＲNA 复合体的结构更加 相近，就能够进一步提高 Cas9 系统的基因组编辑效率。
缺陷
成本高,应用的物种有限,操纵的基因亦有限。
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基因编辑功能应用
CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能主要应用于在不同物种 的基因组产生需要的等位基因突变,来研究基因功能或建立疾病模 型。
如果CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能如果真如研究者 报道那样强大的话，那该技术在先天性突变或获得突变所致疾病 的修复治疗中将有巨大的潜在价值。这一点还有待研究。
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进展
4 在拟南芥研究方面，利用C ＲISPＲ/Cas 系统对分裂组织有 针对性地定点诱变产生遗传突变， 结果表明，在拟南芥中使用 CＲ ISPＲ/Cas系统为 RNA 引导的核 酸内切酶(RGEN)定点突变分裂组 织提供了一种有效的遗传基因工 程的方法。
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进展
5 CRISPR/Cas 的 打 靶 效 率 比 较 高，最
缺陷：1、不能预期引入的ZFN蛋白是
基因编辑技术比较CRISPR Cas9,casF,Cpf1 ppt
CRISPR-CPf1作用原理
cas9 / casF /cpF1总结
Part.4
Cpf1/Cas9比较
Cas9/ casF / Cpf1总结
谢谢观看
CRISPR：
CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中 的特殊DNA重复序列家族，是成簇的规律间隔的短 回文重复序列。右图展示了完整的CRISPR位点的结 构。
CRISPR/cas9基因编辑原理
主要内容
crRNA ( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activatingRNA )结合形成 tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。
CRISPR/cas9、casF、Cpf1 基因编辑技术
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
➢ 1. CRISPR/cas9基因编辑技术 ➢ 2. CRISPR/casF基因编辑技术 ➢ 3. CRISPR/cpF1基因编辑技术 ➢ 4. cas9 / casF /cpF1总结
CRISPR/cas9的基本原理
Part.1
CRISPR/cas9基因编辑原理
CRISPR/casF基因编辑技术
Part.2
CRISPR/ casF基因编辑技术
原理： casF能切割与crRNA互补的DNA，并且使用单个RuvC活 性位点进行pre-crRNA加工和切割。 casF分子量：cas9蛋白的一半 Cas蛋白结构域:HNH、RuvC 向导RNA：crRNA pre-crRNA加工方式：casF蛋白加工 DNA识别区：富含T的PAM 序列（5′TBN 3′，B是G、T或C） 优点：分子量小、对PAM区要求低，有利于基于载体向细胞内 递送和更广泛的可靶向基因组序列范围
《crisprcas9技术》课件
CRISPR-Cas9的应用
基因组编辑及修补
CRISPR-Cas9技术可以精确的定位基因组中特定位点 进行编辑和修补，是医学、农业、工业等领域中重 要的基因体系。
基因靶向表达
利用CRISPR-Cas9技术的靶向控制基因表达可以实现 治疗疾病、生产有用生物制品等应用。
基因调控
CRISPR-Cas9技术可选择性、有 Nhomakorabea地进行基因调控，
应用前景
• CRISPR-Cas9技术未来将 广泛用于医疗、农业、 工业、环保等领域，成 为生物技术创新的重要
• 推基动于C力R。ISPR-Cas9技术的 新产品、新技术、新应 用也将成为未来投资的 热点领域。
2
编辑系统的工作原理
CRISPR-Cas9通过识别、结合、切割目标基因位点，进一步实现对基因组的编辑 和修补，使基因组发生特定改变，达到治疗或改良目的。
3
PAM序列的特点
PAM序列指的是Cas9靶序列的附近序列，是单导RNA结合Cas9蛋白并定位于靶点 上的关键信息之一，其特点包括长度和序列的多样性。
农业遗传改良
利用CRISPR-Cas9技术对商业作物进行精准改良是未
CRISPR-Cas9技术的局限和挑战
1 异源物质的干扰
2 细胞外的嵌合酶
CRISPR-Cas9技术会受到外部异源物质的干扰， 影响其在目标细胞内的有效性。
CRISPR-Cas9技术需要有效的嵌合酶才能达到 预期效果，因此嵌合酶的研究一直是制约该 技术发展的瓶颈之一。
应用领域
CRISPR-Cas9技术已广泛应用于基因组编辑、基因表达调控、疾病治疗和药物筛选等领域，且 应用前景广阔。
CRISPR-Cas9系统的构成和原理
crispercas9基因编辑原理
crispercas9基因编辑原理
CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种利用RNA-Cas9蛋白复合物进行特定基因的精确编辑的技术。
CRISPR-Cas9是一种轻松无痛的基因修饰技术。
它可以有效地定向编辑、插入或
删除特定基因，以修复基因突变以治疗多种遗传性疾病。
CRISPR-Cas9技术来源于天然防御机制，是由一种被称为CRISPR-Cas9的蛋白复合物
组成的，由一条RNA夹带着伴侣蛋白Cas9和一种叫做tracrRNA的RNA组成。
RNA是一种
单链核酸，Cas9是一种酶，能够在DNA双链中定位、切开并结合某些RNA片段。
CRISPR-Cas9蛋白复合物是一种复杂的分子结构，它具有定位、辨别及酶切的功能。
研究人员可以将CRISPR-Cas9的某些部分改造，以使其能识别目标基因，并将人工构建的DNA片段插入
目标位置以覆盖原始突变。
CRISPR-Cas9技术的运作原理很简单，通常情况下它以一种叫做“现场DNA剪切”的
方式运作。
首先，RNA复合物会识别特定基因的序列，然后Cas9蛋白切开 DNA双螺旋，
最后，人工构建的DNA片段插入目标位置，并将原始突变覆盖掉。
由于设计原理的简单性，CRISPR-Cas9技术的应用极为广泛，如人类基因编辑、植物基因编辑等等都可以使用它。
CRISPR-Cas9技术的优势在于可以快速有效地编辑基因，而且相较于传统基因编辑技
术而言，这种新型技术能够快速精准地编辑指定基因序列。
另外，这一技术也可更加节省
时间和资源，因此，CRISPR-Cas9的出现是一个突破，将加速基因工程及治疗遗传性疾病
的进程，改变着人类进化的历史。
crisper cas9技术简介
pAAV-miCMV-Cas9
6.2kb
pAAV-U6-gRNA-CMV-EGFP
编号 H422 H423
说明 腺相关病毒, Cas9 腺相关病毒,表达gRNA
Thanks!
更多内容欢迎访问我们公司网站:
联系方式: 杨兴林, yxl@
Cas9位点查找
Cas9位点查找
选择最优的cas9靶点
Cas9载体构建
Cas9载体活性验证
Cel1实验原理示意图
Control
Cas9
PCR产物~500bp 预测切割产物~340bp
预测切割产物~160bp
Cas9质粒活性检测实例
和元公司CRISPR/Cas9系统介绍
和元Cas9载体系统
11.9kb pLenti-CMV-Puro-T2A-3Flag-Cas9n
7.9kb
pLenti-U6-gRNA-CMV-EGFP
编号 H136 H137 H140
说明 Puro抗性标记 Cas9n, Puro抗性标记 慢病毒, gRNA载体
基于腺相关病毒载体的Cas9系统
载体大小
载体全名
7.4kb
基因组编辑技术 -CRISPR/Cas9
杨兴林 博士
主要内容
1. CRISPR/Cas9技术的基本原理 2. CRISPR/Cas9主Байду номын сангаас实验流程 3. 和元公司CRISPR/Cas9系统介绍
CRISPR/Cas9技术的基本原理
基因组编辑技术
一种利用同源重组 (Homologous Recombination,HR) 或者非同源末端连接(Non-homologous End Joining, NHEJ) 原理改变生物体内源基因 的遗传学技术。
CRISPRCas9ppt
CRISPR/Cas系统在植物上也取得了重 大突破
2013年8月8日, 《 Nature Biotechnology 》上 同时报道了在重要农作物水稻、小麦以及模 式植物拟南芥和本生烟中取得了多个基因的 成功定点敲除、插入等基因组定点编辑的操 作,首次证实CRISPR/Cas系统能够用于作物基 因组定点编辑, 该技术的突破有望加速重要农 作物水稻、小麦性状改良与分子定向育种。
CRISPR-Cas系统靶向要求
• 最主要的要求： • PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。
• Cas9蛋白来源于细菌，因此要让Cas9蛋白高
• 效地转运到哺乳动物细胞核内，需要在Cas9 蛋白的N端或是C端加上真核细胞的核定位 信号。从目前发表的论文来看，在Cas9蛋白 的C端添加核定位信号，似乎是提高Cas9蛋 白的核转运最有效的方法。
可以对任何后面紧随NGG(PAM)的20 bp的序列进行编辑; 能同时作用于多个靶位点。
更容易在实验室中得到推广和应用。
局限性
• 脱靶效应 • Cas9蛋白对于目标序列的切割不仅仅依靠
crRNA序列的匹配，在目标序列(protospacer) 附近必须存在PAM。 • CRISPR/Cas9系统所靶向的序列仅需十余个 碱基对精确配对，这可能会降低 CRISPR/Cas9系统切割的特异性。 • CRISPR/Cas9系统也面临着如何控制双链断 裂之后的非同源末端连接修复可能随机产 生细胞毒性的问题。
2005年，三个研究小组均发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的 染色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传 物质入侵的免疫系统有关
2007年，Barrangou等首次发现并证明细菌可能利用CRSPR系统对抵 抗噬菌体入侵
基因编辑方法CRISPR-Cas9
Thanks
参考文献
[1] Patrick D. Hsu, Eric S. Lander,and Feng Zhang.Development and Applications ofCRISPR-Cas9 for Genome Engineering. Cell .2014 (157):1262-1278. [2] 左其生等. CRISPR-Cas 介导的基因编辑工具.生物技术通 报.2014(7):37-43. [3]贾良杰. CRISPR/Cas基因组靶向编辑技术综述.中国医药学 报.2014,11(22):154-164. [4]齐波等. CRISPR干扰:一种由假说到现实的基因沉默技术. 遵 义医学院学报.2014,37(3):348-352. [5]张曼,孙秀萍,宋铭晶.慢病毒载体用于转基因技术的研究进 展.中华临床医师杂志.2014,8(10):1949-1953.
CRISPR-Cas9技术的应用进展
2. 利用 Cas9 系统在转录水平对基因表达的调节
Cell 2014 157,1262-1278 Figure6G
通过点突变使 Cas9 蛋白的两个核酸内切酶结构域活性全部丧失获得 dCas9，将 dCas9-sgRNA 作为与 DNA 特异性识别的平台，令转录因子或 表观调控酶与dCas9-sgRNA 融合表达，即可实现转录水平对基因表达的调 节。
重组质粒导入细胞/生物体
Cell 2014 157,1262-1278 Figure6C,D,E
C、将编码Cas9和sgRNA的表达质粒直接转染至细胞系中。 D、将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵，快速得到转 基因动物模型。 E、将编码CRISPR组分的高效价的病毒载体转导至组织或细胞，完成特 定时间，组织的基因编辑。CRISPR-CasFra bibliotek技术的应用进展
crispr cas9技术课件PPT
8
2.CRISPR/Cas9技术的缺点 1.脱靶效应
2021/3/10
7
CRISPR/技术的前景及优缺点
➢ 3.2 CRISPR-Cas9系统的应用前景 ➢ 1.在基因敲除方面具有绝对的优势 ➢ 2.可以用于因单基因突变造成的遗传病治疗 ➢ 3.在家畜及农业育种方面带来新的基因编辑技术
2021/3/10
1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重 新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。
只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单方便。 较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来的并发症。
➢ 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质 高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。
➢ 2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞
EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引 导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似， 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
2021/3/10
3
CRISPR/cas9作用机理
1.CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在 的 PAM（NGG序列），将临近 PAM 的序列 作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基 因座的5'端合成重复序列；最后新的间隔 序列整合到两个重复序列之间
CRISPR-Cas9-基因编辑技术简介ppt课件
CRISPR基因座的表达（包括转录 和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的crRNA 前体，然后逐步加工成小的成 熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
crRNA结合相关的Cas蛋白后，
形成NA-Cas蛋白复合体，
精选版课件ppt
5
2.CRISPR/Cas系统结构
2.2CRISPR结构：
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
沈彬，2015
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6.降低脱靶效应
添加同源臂(homology arm,HR)
Yu Hisano et al.2014
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6.降低脱靶效应
FoKI-dCas9
Nicolas Wyvekens et al.2015
精选版课件ppt
20
6.降低脱靶效应
CRISPR/Cpf1系统
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4.CRISPR/Cas9系统
酿脓链球菌
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12
4.CRISPR/Cas9系统
精选版课件ppt
13
4.CRISPR/Cas9系统
gRNA 在线设计工具：
CRISPR Design Tool: / E-CRISPR: ZiFiT: / Cas9 Design: http://cas9 /index.jsp Cas-OFFinder: /cas-offinder/ CCTop: http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/
crisprcas基因编辑技术原理与应用 ppt课件
模式
动物 关的基因来用小鼠或其他模型动物建立
相应的疾病模型。研究者可以应用这些
疾病模型研究疾病的发病机制,再现疾病
发生过程;也可用于筛选有效治疗药物,
或通过研究特异的表面分子、信号通路
等开发新的靶向治疗药物等。
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传统方式
用特定的手段将目的DNA片段插入到小鼠胚胎干细 胞中,筛选出成功修饰的胚胎干细胞,应用显微操 作技术将其移入到早期胚胎(即囊庇)中,将改造后 的脏胎移植到假孕母鼠中,再自生出的小鼠筛选疾 病模型。
利用CRISPRCas进行基因组工程，图中不同颜色的剪刀
代表着不同的Cas9酶
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应用
用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作过程,可快速而有效地建立 携带多个基因突变的小鼠。因其不依赖在胚胎干细胞上操作,可用于多生物 细胞的基因操作。模型生物的建立也不再局限于小鼠及少数大鼠中,任何可 进行胚胎操作的物种都能成为基因组工程的目标。
好 相比其它编辑技术CRISPR/Cas基因编辑技术好用吗？
怎
怎么用CRISPR/Cas基因编辑技术？
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目录
CRISPR/Cas基因编辑技术
发现 原理 应用 优点 缺点 发展
前景
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发现
在1987年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不 足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现 了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复 核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚 不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在 为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。2000年，相似的重复序列在其 它真细菌和古细菌中被发现并被命名为短间隔重复序列（Short Regularly