HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解
《HPLC流动相的选择》课件
为什么选择合适的 流动相很重要？
选择合适的流动相能够 提高分离的效果、减少 分析时间，并保证色谱 分析的准确性和可靠性。
HPLC流动相的类型
1 极性溶剂
2 非极性溶剂
极性溶剂在HPLC中用于分离具有极性 和亲水性据分析需求和柱子的要求，优化
流动相的流量和温度。
3
离子对的选择
4
在需要对离子化合物进行分离时， 选择适当的离子对和缓冲剂。
品质控制
实时监测流动相的质量，保证其稳 定性和一致性。
PH值的调节
根据样品和柱子的要求，调节流动 相的pH值以提高分离效果。
案例分析
如何鉴别目标分离物
通过调整流动相的组成或柱 子的条件，有效鉴别目标分 离物。
非极性溶剂适用于分离具有非极性和疏 水性的化合物，如脂溶性物质。
3 混合溶剂
4 离子对和缓冲剂
混合溶剂可以在不同程度上调节极性， 用于复杂样品的分离，如有机溶剂和水 的混合物。
离子对和缓冲剂可以控制溶液的离子强 度和pH值，用于特定的分析和分离需 求。
选择合适的流动相
样品的特性
考虑样品的极性、 酸碱性、稳定性等 特性，选择适合的 流动相。
柱子的特性
根据柱子的填充物、 尺寸和性能要求， 选取与之相匹配的 流动相。
目标分离物 的物理化学 性质
考虑目标分离物的 极性、分子量、分 子结构等性质，并 选择适合的流动相 进行分离。
可行性和可 靠性
评估不同流动相对 分离效果和分析结 果的可行性和可靠 性，选择最佳的组 合。
HPLC流动相的优化
1
HPLC流动相的选择
hplc流动相选择
1. 色谱柱的平衡 反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。 新柱应先使用 10－20 倍柱体积的甲醇 或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。 每天用足够的 时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的 寿命也会变得更长！操作步骤： a. 平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐 或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡） b. 如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用 纯水冲洗 30 分钟以上再用缓冲盐流动相平衡； 分析结束后必须先用纯水冲洗 30 分钟以上 除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗 30 分钟保护柱子。
在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的强度 随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度婕缘脑銮慷跞酢?BR>正相色谱的流 动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。 反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂， 再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂， 如 甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有 显著影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价 格低，是反相色谱最常用的流动相。但 Snyder 则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与 甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外 185~205nm 处检测的要求， 因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。 在分离含极性差别较大的多组分样品时， 为了使各组分均有合适的 k 值并分离良好， 也 需采用梯度洗脱技术。 反相色谱中，如果要在相同的时间内分离同一组样品，甲醇/水作为冲洗剂时其冲洗强 度配比与乙腈/水或四氢呋喃/水的冲洗强度配比有如下关系： C 乙腈＝0.32C 2 甲醇＋0.57C 甲醇 C 四氢呋喃＝0.66C 甲醇 C 为不同有机溶剂与水混合的体积百分含量。 100%甲醇的冲洗强度相当于 89%的乙腈/水或 66%的四氢呋喃/水的冲洗强度。
HPLC固定相与流动相
复杂样品中各种组分的方法。
02
它利用不同物质在固定相和流动 相之间的分配平衡进行分离，通 过检测器检测各个组分的性质和 含量。
HPLC的原理
高效液相色谱法基于物质在固定相和 流动相之间的分配平衡进行分离。
不同物质在固定相和流动相之间的分 配系数不同，因此通过色谱柱时，会 按照一定顺序流出，从而实现分离。
流动相以避免干扰。
测需求选择合适的固定相和流动相组合。
05 HPLC固定相与流动相的 优化
优化分离效果
01
02
03
选择合适的固定相
根据待测物质的性质，选 择具有适宜极性、选择性、 稳定性和寿命的固定相， 以提高分离效果。
调整流动相组成
通过调整流动相的组成， 如改变溶剂类型、比例和 pH值，可以改善分离效果。
固定相的选择
根据化合物性质选
择
对于不同极性和性质的化合物， 应选择具有相应极性和功能基团 的固定相。
根据分离要求选择
根据分离要求，如分离度、分析 时间等，选择具有合适粒度和性 能的固定相。
实验验证
在实际应用中，对固定相的选择 应进行实验验证，以确保其性能 和分离效果符合要求。
03 HPLC流动相
控制温度
适当升高温度可以提高流 动相的流速和降低黏度， 有助于提高分离效果。
提高检测灵敏度
选择高灵敏度检测器
根据待测物质的性质，选择高灵敏度的检测器，如紫 外、荧光、电化学检测器等。
优化检测波长
选择合适的检测波长可以降低背景干扰，提高检测灵 敏度。
降低样品浓度
通过优化样品处理和稀释方法，降低样品浓度，可以 降低检测限和提高灵敏度。
流动相的组成和性质也会影响分离效果。例如，使用不同的有机溶剂或 混合溶剂可以改变流动相的极性和粘度，从而影响物质在固定相上的吸 附和解析能力。
高效液相色谱流动相选择
高效液相色谱流动相选择流动相流动相的性质要求：一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
流动相选择1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。
2：三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。
这是一个聪明而又省力的办法。
调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。
3：粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
选择流动相时应考虑以下几个方面：①流动相应不改变填料的任何性质。
低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。
碱性流动相不能用于硅胶柱系统。
酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。
色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。
使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。
当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
④粘度要低(应<2cp)。
高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。
最好选择沸点在100℃以下的流动相。
⑤对样品的溶解度要适宜。
如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。
⑥样品易于回收。
应选用挥发性溶剂。
流动相的pH值采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。
对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在;对弱碱，情况相反。
hplc流动相选择_GAOQS
液相色谱的柱子通常正相柱和反相柱。
正相柱以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS ）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。
另外还有离子交换柱，GPC 柱，聚合物填料柱等。
本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：一、反相色谱柱的选择1．柱子的PH 值使用范围反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。
但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH 范围。
一般的C18柱PH 值范围都在2-8，流动相的PH 值小于2时，会导致键合相的水解；当PH 值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。
一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。
同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。
如果流动相PH 较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH 范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim 柱PH 2-9或Zorbax 的PH 2-11.5的柱子。
2．填料的端基封尾（或称封口）把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。
如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。
3．戴安公司Acclaim 柱子介绍—极性封尾C16固定相柱戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim 反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。
PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。
尤其是2003年推出的Acclaim 极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O 链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。
对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有好的立体选择性。
（下图是Acclaim 极性封尾C16柱和市售极性封尾一流色谱柱分离酸性化合物谱图的比较）二、液相色谱柱的使用色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。
高效液相色谱流动相的选择
按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。
常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、 乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可 在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间 缩短。
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期 累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。 在液—液色谱中，流动相与固定性不互溶，否则固定性 流失，柱的保留特性改变。
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱头沉积。 （4）溶剂的黏度小些为好，黏度大降低组分的扩散系 数，造成柱效下降，温度相同柱压随着黏度的增加而增 加。 （ 5）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。
流动相的选择 与注意事项
1. 流动相性质
（1）液相色谱的流动相根据作用可分为底剂和洗脱剂。
底剂决定基本的色谱分离情况，洗脱剂对某几个组分选择分
离。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；
（ 2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正
相柱。正相柱的底剂若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液
液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上
的出峰顺序相反。反相柱通常以水为流动相的主体，再加入 不同配比的有机溶剂做调节剂。
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性；
高效液相色谱流动相选择
高效液相色谱流动相选择流动相流动相的性质要求：一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
流动相选择1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。
2：三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。
这是一个聪明而又省力的办法。
调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。
3：粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
选择流动相时应考虑以下几个方面：①流动相应不改变填料的任何性质。
低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。
碱性流动相不能用于硅胶柱系统。
酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。
色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。
使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。
当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
④粘度要低(应<2cp)。
高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。
最好选择沸点在100℃以下的流动相。
⑤对样品的溶解度要适宜。
如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。
⑥样品易于回收。
应选用挥发性溶剂。
流动相的pH值采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。
对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k 值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在;对弱碱，情况相反。
HPLC方法开发如何选择流动相的pH
HPLC方法开发如何选择流动相的pH 2014-02-16 蒋竞波谱分析
HPLC方法开发如何选择流动相的pH
1) 流动相的pH到底由什么决定？
理论上说流动相的pH决定于化合物的pKa 和pKb,
流动相的pH对于酸性化合物至少要远离其pKa 2个单位，也就是说pH-pKa的绝对值需要大于2，对于碱性化合物流动相的pH应该至少远离其pKb 2个单位，就是说pH-pKb的绝对值大于2，
2）为什么是2呢？
pKa=pH-"lg"([A^(-)])/([HA]) 即
pKa=-log ka=-log 氢例子浓度*酸根浓度/分子态酸的浓度=pH-log酸根浓度/分子态酸的浓度
当pka与pH相差两个单位的时候，酸根离子的浓度就与分子态酸的浓度就会相差一百倍，
即pH在pKa,以下两个单位的时候，这个酸性化合物在这个流动相体系中分子态比例为100/101,离子态的比例为1/101，所以最安全的pH最好是离pKa距离 3个单位，这个时候，化合物只有0.1%左右处于离子态。
3）为什么酸性化合物最好选择pKa一下，而碱性化合物却学则pKb以上呢？
从上面分析可以知道，如果酸性化合物选择pKa以上两个单位，这个化合物主要以酸根的形式存在，而我们常用的HPLC体系是反相体系，出峰会比较早，另外带电荷的离子在柱子上也更加容易与填料作用而产生拖尾和峰型不好的问题
4）常见流动相的pH
蒋竞 12-Feb2014。
hplc的流动相
hplc的流动相HPLC的流动相HPLC（高效液相色谱法）是一种常用的分析方法，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
在HPLC分析过程中，流动相是至关重要的组成部分，它直接影响着分析结果的准确性和可靠性。
流动相是指在HPLC柱中流动的溶剂或溶液，它能够将样品带入柱中进行分离。
流动相的选择要根据待分析物的性质和目的来确定，常见的流动相包括有机溶剂和水的混合物，以及酸性或碱性缓冲液等。
有机溶剂是HPLC中常用的流动相之一。
有机溶剂具有良好的溶解性和流动性，能够有效地溶解待分析物，并在柱上产生合适的保留时间。
常见的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈等。
选择有机溶剂时，要考虑其溶解度和挥发性，以及对柱和检测器的影响。
水是另一种常用的流动相。
水是广泛存在于自然界中的溶剂，具有良好的溶解性和流动性。
在HPLC中，水常用作极性物质的流动相，能够有效地分离极性化合物。
此外，水还可以与有机溶剂混合使用，以调节溶剂的极性，实现对不同化合物的分离。
除了有机溶剂和水，酸性或碱性缓冲液也常用作流动相。
酸性或碱性缓冲液可以调节流动相的pH值，对某些具有酸碱性的化合物具有良好的溶解性和分离能力。
常见的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸缓冲液等。
选择缓冲液时，要考虑其缓冲能力、稳定性以及对柱和检测器的影响。
在HPLC分析中，流动相的选择要根据待分析物的性质和目的来确定。
一般来说，对于非极性物质，可以选择有机溶剂作为流动相；对于极性物质，可以选择水或酸碱缓冲液作为流动相。
此外，还需要考虑流动相与柱和检测器的相容性，以及流动相的流速和温度等因素。
HPLC的流动相是HPLC分析中不可或缺的组成部分，它直接影响着分析结果的准确性和可靠性。
在选择流动相时，需要根据待分析物的性质和目的来确定，并考虑流动相与柱和检测器的相容性。
合理选择和优化流动相的使用，可以提高HPLC分析的效果，为科学研究和生产实践提供可靠的数据支持。
关于高效液相色谱仪流动相的选择如何呢
关于高效液相色谱仪流动相的选择如何呢高效液相色谱仪（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种将混合物分离成单一组分的有效工具。
为了实现这种分离，高效液相色谱需要两种相：固定相和流动相。
其中，流动相是高效液相色谱仪中至关重要的组成部分之一，因为它决定着分离效果和分离时间。
因此，选择正确的流动相对于分离的精度和效率来说非常重要。
流动相简介流动相是指在柱床中连续流动的溶液。
在高效液相色谱中，流动相主要由溶剂和缓冲液组成。
溶剂是用于将样品分离的液体，在高效液相色谱仪中通常采用多种溶剂的混合物，称为流动相溶剂或者移动相溶剂。
缓冲液是在溶剂中加入的一种化学物质来调节流动相的pH值，缓冲液的作用是保持样品成分的稳定性和防止封堵柱床。
流动相的选择取决于样品的特性、分离要求和分析环境的条件。
因此，选择合适的流动相是高效液相色谱仪分离分析的关键因素之一。
流动相的分类根据溶剂的极性，流动相可分为两种类型：有机相和水相。
具体分类如下：有机相有机相通常由疏水性的有机溶剂组成，这些有机溶剂的极性比水低。
主要有以下三类：•极性较小的有机溶剂：含有醚、酮或者类似于苯、四氢呋喃等非极性有机溶剂的混合物。
•极性中等的有机溶剂：含有乙腈、甲醇、乙醇等极性有机溶剂的混合物。
•极性较大的有机溶剂：如乙二醇、N-甲基吡咯烷酮等。
水相水相是由水和缓冲液组成的混合物。
水是极性溶剂，本身具有良好的溶解性和稳定性。
缓冲液是在水中加入的一种化学物质来调节流动相的pH值。
流动相的选择原则在选择流动相时，需要考虑分析的目标和样品的特性。
下面列举几种常见的流动相选择原则：根据分析目标选择流动相首先，需要根据分析目标选择流动相。
如果需要分离极性物质，则应选择相对极性较强的水相，如果需要分离非极性物质，则应选择相对极性较弱的有机相。
如果需要同时分离多种溶质，则可以选择相组合。
根据样品的特性选择流动相如果样品是非极性的，则应选择相对极性较弱的有机相，例如乙酸乙酯-甲醇体系。
HPLC方法开发——流动相的选择
HPLC方法开发——流动相的选择高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析技术，广泛应用于各个领域的分析和质量控制。
在HPLC方法开发中，流动相的选择是非常重要的一步，它直接关系到分析物的分离和检测的灵敏度。
在选择流动相时，需要考虑以下几个因素：1.溶解性：流动相应具有较好的溶解性，以溶解待测样品，保证样品能够均匀地进入和流出色谱柱，并使分离柱表面保持通透性。
2.酸碱性：流动相的pH值对于分离和保护色谱柱都有一定的影响。
如果待测物具有弱酸或弱碱性，应选择酸性或碱性流动相，以提供足够的离子态物质，促进待测物与色谱柱的相互作用。
3.性能物质：流动相中的性能物质可分为有机和无机两类。
有机性能物质通常用作有机试剂，如甲醇、乙酸乙酯等。
无机性能物质通常用作缓冲剂，如磷酸二氢钠、草酸钠等。
4.流动相比例：流动相比例指的是有机相和水相的比例。
比例的选择应该根据待测样品的特性、分析目的以及色谱柱的类型和性能来确定。
一般来说，比例的选择应该尽量保证样品在色谱柱中保持均匀分布。
5.流速：流动相的流速直接影响色谱柱的分离效果和分析时间。
一般来说，流速越快，分离效果可能越差，但分析时间会缩短。
因此，在流速选择时需要在分离效果和分析时间之间做一个权衡，使得两者达到一个较好的平衡。
在选择流动相时，还需要考虑其他可能的影响因素，如温度、压力等。
温度对于很多分析物的分离效果有重要影响，通常来说，提高温度可以加快分离速度，但也可能导致一些物质不稳定。
压力对于色谱柱的分离效果和寿命有一定影响，高压可以提高分离速度，但也可能损坏色谱柱。
综上所述，流动相的选择在HPLC方法开发中是非常重要的一步。
通过合理选择溶剂、酸碱性、性能物质、比例和流速，可以得到一个合适的流动相组合，以获得较好的分离效果和检测灵敏度。
在选择过程中还需要考虑其他可能的影响因素，以确保色谱分析的准确性和可靠性。
HPLC中固定相和流动相
HPLC中固定相和流动相在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。
以下是填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质（担体）HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。
无机物基质主要是硅胶和氧化铝，无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀；有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯，有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
1、基质的种类：1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。
除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。
硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。
缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。
通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2～8。
硅胶的主要性能参数有：①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布，与比表面积成反比。
③比表面积：在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）：在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性：在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾：在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状：硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差，后者无此缺点。
⑧硅胶纯度：对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。
它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。
但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。
不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
HPLC流动相的选择课件
②纯度 色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是 当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。
u使用UV检测器时，所用流动相在检测波长 下应没有吸收，或吸收很小。
u使用示差折光检测器时，应选择折光系数与 样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
④粘度要低(应<2cp) 粘度太高时：
l会影响溶质的扩散、传质，降低柱效； l还会使柱压降增加，使分离时间延长； l最好选择沸点在100℃以下的流动相。
五、液相色谱流动相的过滤
u所有溶剂使用前都必须经0.45μm (或0.22μm) 滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外
(除非在标签上标明“已滤过”)。
u用滤膜过滤时，有机相滤膜一般用于过滤有机 溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤 膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂， 否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于 HPLC。
u极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的 保留值和分离选择性有显著影响。
u一般情况下，甲醇-水系统是反相色谱最常 用的流动相，具有粘度小、价格低的特点。
uSnyder推荐采用乙腈-水系统。溶剂强度较 高且粘度较小，并可满足在紫外205nm处检 测的要求，但价格较贵。
梯度洗脱(Gradient Elution)
u 超声波脱气法
超声脱气优点： 10-20分钟已足够；
不影响溶剂组成。 注意： 超声时应避免溶剂瓶与超声槽底部或壁 接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出 水面太多。
七、液相色谱流动相的贮存 u流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈 钢容器内，不能贮存在塑料容器中。
(许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的 增塑剂，导致溶剂受污染，造成柱效降低。)
三、液相色谱流动相的pH值
HPLC流动相的选择ppt课件
使用示差折光检测器时，应选择折光系数与 样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
④粘度要低（应<2cp） 粘度太高时： 会影响溶质的扩散、传质，降点在100℃以下的流动相。
四、液相色谱流动相的选择 在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直 接与它的极性相关。
对于混合流动相，可在混合前分别滤过，如 需混合后滤过，首选有机相滤膜。现在已有混 合型滤膜出售。
六、液相色谱流动相的脱气 1.脱气的必要性
所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统 内逸出气泡，影响泵的工作。
气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的 灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。
溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相 甚至固定相（如烷基胺）反应。
Snyder推荐采用乙腈-水系统。溶剂强度较 高且粘度较小，并可满足在紫外205nm处检 测的要求，但价格较贵。
3.梯度洗脱技术
在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了 使各组分均有合适的k’值并分离良好，也需采 用梯度洗脱技术。
梯度洗脱（Gradient Elution）
Solvent polarity (composition) continuously varied or stepped
（3）对电化学检测器 在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧 的影响更大。
（4）除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检 测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中 的灵敏度。
3.脱气方法 氦气脱气法
电磁脱气法
超声波脱气法 超声脱气优点：10-20分钟已足够；
不影响溶剂组成。 注意：超声时应避免溶剂瓶与超声槽底部或壁 接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出 水面太多。
溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离 或分析结果带来误差。
高效液相色谱流动相的选择课件
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20世纪80年代
HPLC技术进一步发展，出现了微径 柱和超高效液相色谱（UPLC），提 高了分离效率和灵敏度。
20世纪90年代至今
HPLC技术不断改进和完善，应用领 域不断扩大，成为一种重要的分离分 析手段。
02
流动相的基本知识
流动相的定义和作用
定义
流动相是高效液相色谱法中携带样品 通过色谱柱的液体，也称为载液。
案例三：分离手性化合物的流动相选择
总结词
手性化合物在高效液相色谱中的分离通常需要使用手性固定相，而流动相的选择对于分 离效果具有重要影响。
详细描述
手性流动相通常用于调节手性固定相的选择性。常见的流动相包括天然手性化合物、合 成手性化合物和手性离子液体等。这些流动相的选择应根据目标手性化合物的性质和分 离要求进行优化。此外，流动相的浓度、pH值和温度等因素也会影响分离效果。因此
准备流动相
根据实验需求，准备适量 的流动相，确保其纯度和 质量符合实验要求。
实验操作技巧
调整流动相比例
优化实验条件
通过调整流动相的比例，可以改变样 品的溶解度和分配系数，从而优化分 离效果。
在实验过程中，需要不断优化实验条 件，如温度、检测波长等，以提高分 离效果和准确度。
控制流动相流速
合适的流动相流速有助于提高分离效 果和缩短分析时间，需要根据实验需 求进行适当调整。
实验后处理
清洗和维护色谱柱
在实验结束后，需要清洗色谱柱 ，去除残留的样品和杂质，以延
长色谱柱的使用寿命。
数据处理和分析
对实验数据进行处理和分析，包括 峰识别、定量和定性分析等，以获 得准确的实验结果。
HPLC流动相的选择PPT学习教案
2. 反相色谱
流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定 量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙 腈、四氢呋喃等。
极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的 保留值和分离选择性有显著影响。
一般情况下，甲醇-水系统是反相色谱最 常用的流动相，具有粘度小、价格低的特点 。
Snyder推荐采用乙腈-水系统。溶剂强度较 高且粘度较小，并可满足在紫外205nm处检 测的要求，但价格较第贵9页/共。21页
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（2）对荧光检测器 在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起 淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。 在某些情况下，荧光响应可降低达95%。
（3）对电化学检测器 在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧 的影响更大。
（4）除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检 测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中 的灵敏度。
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二、流动相选择原则 ①流动相应不改变填料的任何性质 低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料 有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改 变色谱柱填床的性质。 碱性流动相不能用于硅胶柱系统。 酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附 剂的柱系统。
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②纯度 色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是 当溶剂所含杂质在柱上积累时。 ③必须与检测器匹配。
所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统 内逸出气泡，影响泵的工作。
气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的 灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。
溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相 甚至固定相（如烷基胺）反应。
溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离 或分析结果带来误差。
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2.溶解氧的危害 （1）对紫外检测器 溶解氧能与甲醇、四氢呋喃等形成有紫外吸收 的络合物。 此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以 下），并导致检测灵敏度的轻微降低； 会在梯度淋洗时造成基线漂移。
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9. 梯度洗脱
在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变 化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视： 要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱 的流动相。 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高 混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出
现压力的变化 。要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输 液泵或色谱柱能承受的最大压力。
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2. 常用溶剂的重要性质
极性 黏度 沸点 紫外截止波长
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常用溶剂参数表
Solvent
Hexane(正己烷) Carbontetrachloride(四氯化碳) Toluene(甲苯) Benzene(苯) Methylenechloride(二氯甲烷) n-propanol(异丙醇) Tetrahydrofuran(四氢呋喃) Ethanol(乙醇) Chloroform(氯仿) Acetone(丙酮) Acetonitrile(乙腈) Dimethylformamide(二甲基甲酰胺) Methanol(甲醇) Ethyleneglycol(乙二醇) Dimethylsulfoxide(二甲亚砜) Water
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4. 脱气
氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低， 连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。
超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声 波振荡10-15min。
在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜 渗透技术，在线脱气。
1. 流动相的一般要求
流动相对样品具有一定的溶解能力 流动相具有一定惰性 流动相应不改变填料的任何性质 纯度高 流动相的黏度要尽量小 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应 流动相沸点不要太低 应选用挥发性溶剂 流动相配置好后要进行过滤 流动相配制好后要进行脱气
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Polarity
0.06 1.60 2.40 3.00 3.40 4.00 4.20 4.30 4.40 5.40 6.20 6.40 6.60 6.90 7.20 10.20
Viscosity(cp20℃)
0.33 0.97 0.59 0.65 0.44 2.27 0.55 1.20 0.57 0.32 0.37 0.92 0.60 19.90 2.24 1.00
解
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8. 等度洗脱
在反相色谱中，极性越强的溶剂洗脱能力越弱。
等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒 定，适合于组分数目较少，组分极性有一定差别 的样品，多用于含量测定。
优点：基线平稳，保留时间重现性好，对流动相 纯度要求低。
缺点：较早洗脱出的色谱峰时分离度差，较晚洗 脱出的色谱峰展宽理论塔板数低。
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知识讲解
3. 过滤
溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器 起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。
色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小， 溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容 易堵塞。
仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的 堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞 杆和活塞的磨损。
每次梯度洗脱之后必须10~30倍柱容积的初始流动相流经 色谱柱，使其恢复到初始状态。
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10．流动相的pH值
反相离子抑制技术：
采用反相色谱法分离弱酸或弱碱样品时，通 过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离， 增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术。
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5. 溶剂过滤器的防护
溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从 而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液。以下几种 方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。
（1）严格执行溶剂过滤 （2）勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液 （3）避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶 盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配 制使用，不要贮存超过规定的有效期。
容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶 液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的 微生物。
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7．HPLC实验用水
HPLC实验用水除满足药典对纯化水 一般要求外，还需要满足以下要求：
项目
指标
电阻率，MΩ·cm，25℃，最小
18.0
总有机碳（TOC)，mg/L，最大
0.5
微粒，µm滤器
0.22
• HPLC级水增加紫外加吸收要求： 在1cm池中，用HPLC级水作空白，1/在3/2012910nm、200nm和250~400nm
的吸收度分别不得过0.01、0.01和知识讲
Boiling Point(℃)
69 77 111 80 40 98 66 79 61 57 82 153 65 197 189 100
UV CutOff(nm)
210 265 285 210 245 210 220 210 245 330 190 270 205 210 260 210
HPLC方法开发流动相的选择医学
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9. 梯度洗脱
梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的 组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于 分析组分数目多样品。
优点：
缩短分析时间 提高分离度 改善峰形 提高检测灵敏度
缺点：
增加基线漂移 较长平衡时间
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堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸 （35%）中浸泡1h，然后用蒸馏水冲洗干净。
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6．流动相的贮存
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器内，不 要贮存在塑料容器中。
贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变 化，也防止氧及尘埃溶入流动相。