细胞分离和破碎
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生物分离工程5(细胞破碎技术)
01
02
03
04
生物制药
用于提取和分离药物、蛋白质 、酶等生物制品。
食品工业
用于提取植物和动物细胞中的 营养成分，如植物油、动物蛋
白等。
环境科学
用于处理废水中的有害物质， 如重金属、有机污染物等。
农业领域
用于提取植物细胞中的有用成 分，如植物激素、天然色素等
。
02
细胞破碎技术的基本原理
物理法
01
表面活性剂法
利用表面活性剂改变细胞 壁的通透性，使细胞内容 物释放出来。
有机溶剂法
利用有机溶剂如丙酮、乙 醇等溶解细胞壁，使细胞 内容物释放出来。
生物法
酶解法
利用酶如溶菌酶、蛋白酶等将细胞壁分解，使细胞内容物释 放出来。
细菌分泌的蛋白酶
利用某些细菌分泌的蛋白酶将细胞壁分解，使细胞内容物释 放出来。
细胞破碎技术的历史与发展
最早的细胞破碎技术可以追溯到19世纪末，当时人们开始使用机械研磨法破碎细胞。
随着科技的发展，出现了多种新型的细胞破碎技术，如超声波破碎、高压均质破碎、 化学渗透压破碎等。
近年来，随着生物技术的快速发展，细胞破碎技术也在不断改进和完善，以满足更 高效、环保和低成本的需求。
细胞破碎技术的应用领域
细胞破碎过程需要消耗大量的能量，这可能导致生产成本的增
加。
可能引起样品污染
02
在破碎过程中，如果设备或条件控制不当，可能会引起样品的
交叉污染或样品中原有成分的降解。
对细胞的损伤
03
高强度的破碎条件可能会对细胞内部结构造成损伤，影响后续
的分离和提取过程。
04
细胞破碎技术的应用案例
在制药行业中的应用
第四章 细胞破碎和分离技术
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
（2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
举例
珠磨法 固体剪切作用 便宜 大规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 适中 大规模处理 超声波法 液体剪切作用 昂贵 小规模处理
（二）物理法 1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
核酸的提取原理
核酸的提取原理
核酸的提取原理主要包括以下几个步骤：细胞破碎、核酸分离、蛋白质去除和纯化。
首先，细胞破碎是将待提取的细胞样品通过物理或化学方法破坏细胞膜，使细胞内的核酸暴露出来，常见的方法有机械破碎、温度变化、酶解等。
细胞破碎后，核酸与其他细胞成分如蛋白质、碳水化合物等混合在一起，因此需要进行核酸的分离。
分离方法主要有酚-氯
仿萃取法、硅胶柱层析法和离心沉淀法等。
酚-氯仿萃取法通
过酚的亲脂性和氯仿的亲水性选择性地萃取核酸。
硅胶柱层析法则是利用硅胶封填在滤柱中，利用核酸与硅胶的亲附作用来纯化核酸。
离心沉淀法是通过高速离心将核酸从样品中沉淀下来。
在核酸分离的过程中，常常伴随着蛋白质的存在。
蛋白质的存在会干扰核酸的定量和纯度检测，因此需要进行蛋白质去除的步骤。
常用的去除蛋白质的方法有蛋白酶处理、酸性酒精沉淀和有机溶剂提取等。
最后，为了提高核酸的纯度和浓度，还需要进行纯化步骤。
纯化方法有乙醇沉淀法、酚-氯仿萃取法、离心过滤法等。
综上所述，核酸提取原理是通过细胞破碎、核酸分离、蛋白质去除和纯化等步骤将待提取样品中的核酸分离出来，以获得高质量的核酸样品。
生物提取方法
生物提取方法
生物提取方法主要包括以下步骤：
1. 细胞破碎：通过物理或化学手段破坏细胞膜，使细胞内容物释放出来。
常见的细胞破碎方法有超声波法、高压法、等离子打破法等，还有一些基于化学原理的破碎方法。
2. 分离：将目标化合物从破碎后的细胞残渣中分离出来。
分离的方法包括离心、过滤、萃取等。
3. 纯化：通过一系列的物理和化学手段，将目标化合物从其他杂质中分离出来，以获得较高纯度的化合物。
纯化的方法包括凝胶层析法、离子交换层析法、亲和层析法、透析等。
4. 浓缩：将目标化合物进行浓缩，以减少后续处理的工作量。
常见的浓缩方法有蒸发、结晶等。
5. 干燥：将目标化合物进行干燥，以使其便于储存和运输。
干燥的方法包括真空干燥、冷冻干燥等。
这些方法的选择往往取决于所要提取的有机化合物以及其来源。
例如，从植物中提取叶绿素的方法一般采用离心法；从动物组织中提取结缔组织蛋白则一般采用酸性溶液溶解后再用盐析法进行提取；从微生物中提取二氧化碳酶则可使用超声波法进行细胞破碎后，利用凝胶层析法进行提取。
生物分离工程 第二章
细胞分离与破碎
（2）珠磨
影响因素：搅拌速度、停留时间、微珠粒径、细胞本身 适用对象：绝大多数微生物细胞
2
细胞分离与破碎
（3）喷雾撞击破碎
喷雾撞击破碎器结构简图
特点：细胞破碎程度均匀，可避免过度破碎，适用 于细胞器（线粒体、叶绿体等）的回收 适用对象：大多数微生物细胞和植物细胞
2
细胞分离与破碎
（4）超声波破碎 机理：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的 形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞 破碎。 影响因素：细胞种类，细胞浓度，频率、功率 适用对象：多数微生物细胞
物理渗透法
（1）渗透压冲击法
（2）冻结-融化法
2
细胞分离与破碎
2.2.4 目标产物的选择性释放
细胞破碎的目的是使胞内的目标产物释放出来，以 进行进一步的分离纯化，因此，理想的破碎方法应当是
使目标产物尽可能多的释放出来，而杂质成分尽可能少 得释放。 ① 仅破坏或破碎目标产物的周围。
① 选择性溶解目标产物。
Rc
W
A
kp
m
一般需缓慢增大操作压力，最终操作压力不超过 0.3 ～ 0.4MPa。
2
细胞分离与破碎
2.1.3.2
过滤设备
工业上常用的过滤设备：加压叶滤机、板框过滤机、 转鼓真空过滤机。
加压叶滤机
转鼓真空过滤机
2
细胞分离与破碎
板框过滤机
2
细胞分离与破碎
2.2 细 胞 破 碎
2.2.1 细胞结构
不同生物细胞，其细胞结构差异很大。
2.2.2 细胞破碎和产物释放原理
摩擦力、撞击作用力、剪切力、化学溶解、酶解
渗透作用力等。
细胞的破碎与分离
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了 次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，纤维素和半纤维素含量比初
生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质 素的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有 很高的机械强度。
14
第十四页，共58页。
3 细胞壁的破碎
放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主 要成分，所以也能采用溶菌酶;酵母和真菌由于细胞壁的 组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤 维素酶、多糖酶等;植物细胞壁的主要成分是纤维素，常 采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。
41
第四十一页，共58页。
外加酶法
有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时 需确定相应的次序。
适中 便宜
细胞悬浮液大规模 处理
细胞悬浮液和植物 细胞的大规模处理
超 声 波 用超声波的空穴作用 适中 昂贵 细胞悬浮液小规模
法
使细胞破碎
处理
35
第三十五页，共58页。
机械破碎法
需要高能量，且产生高温和高剪切力，易使 不稳定产品变性失活；
破碎的有机体或释放的产物，不专一，并且 产生碎片的尺寸范围大，后处理难度大；
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
4
第四页，共58页。
1概述
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖， 及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。
有些目标产物存在于生物体中。
尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在 细胞内沉积。
脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
，利用革兰染色法使未受损害 的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞 呈现亮红色。
17
第十七页，共58页。
生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质 素的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有 很高的机械强度。
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第十四页，共58页。
3 细胞壁的破碎
放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主 要成分，所以也能采用溶菌酶;酵母和真菌由于细胞壁的 组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤 维素酶、多糖酶等;植物细胞壁的主要成分是纤维素，常 采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。
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第四十一页，共58页。
外加酶法
有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时 需确定相应的次序。
适中 便宜
细胞悬浮液大规模 处理
细胞悬浮液和植物 细胞的大规模处理
超 声 波 用超声波的空穴作用 适中 昂贵 细胞悬浮液小规模
法
使细胞破碎
处理
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第三十五页，共58页。
机械破碎法
需要高能量，且产生高温和高剪切力，易使 不稳定产品变性失活；
破碎的有机体或释放的产物，不专一，并且 产生碎片的尺寸范围大，后处理难度大；
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
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第四页，共58页。
1概述
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖， 及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。
有些目标产物存在于生物体中。
尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在 细胞内沉积。
脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
，利用革兰染色法使未受损害 的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞 呈现亮红色。
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第十七页，共58页。
分离细胞器常用的方法
分离细胞器常用的方法
分离细胞器常用的方法有以下几种：
1. 细胞破碎法：将细胞破碎，使得细胞器释放出来。
常用的方法包括机械破碎、超声破碎和液氮冷冻破碎等。
2. 差速离心法：通过差速离心，根据细胞器的大小和密度的不同，将其分离出来。
常用的差速离心法有差速离心、密度梯度离心和梯度离心等。
3. 亲和纯化法：利用特定染色剂或抗体与目标细胞器结合，然后通过凝胶过滤或亲和层析等方法，将目标细胞器从混合物中分离纯化。
4. 细胞器标记法：通过将细胞器标记上特定的荧光染料或放射性标记物，然后使用荧光显微镜或放射性探测技术，对细胞器进行定位和分离。
5. 电泳法：根据不同细胞器的电荷、大小和形状等特性，利用电场将其分离出来。
常用的电泳方法有凝胶电泳、等电聚焦电泳和免疫电泳等。
这些方法可以单独使用，也可以结合使用，根据需要选择适合的方法进行细胞器的分离和纯化。
第四章 细胞破碎和分离提取技术 PPT课件
eg.动物细胞和革兰氏阴性菌。 • 细胞于高渗介质中？脱水达到平衡后，迅速将其转置于低
渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂
• 2）冻结－融化法（Freezing and Thawing） • 细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破
坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较 为有效
• 原理：干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞 Wish株、人喉癌细胞株Hep-2等)产生抗病毒蛋白，从而使 细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不 同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。
• 材料： VSV、Wish细胞、MTT、二甲亚砜(DMSO)、10 ％FCS RPMI1640、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、 酶标检测仪。
or molarity of the buffer due to common ion effects
方案2
• Choose the buffer（with a pKa as close as possible to the desired pH） • Indentify whether the buffer is made from an acid or a base（buf
珠磨法、压榨法 高压匀浆、超声破碎、撞击法
非机械法
干燥处理 溶胞作用
1）酶溶法 2）化学法 3）物理法
超临界细胞破碎
1、机械方法破碎
• 1）珠磨法（bead milling） ：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻 璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互 碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物
• Before the protein can be isolated, it is necessary to conceive of(确定) an activity and to devise（设计） an appropriate assay.
渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂
• 2）冻结－融化法（Freezing and Thawing） • 细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破
坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较 为有效
• 原理：干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞 Wish株、人喉癌细胞株Hep-2等)产生抗病毒蛋白，从而使 细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不 同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。
• 材料： VSV、Wish细胞、MTT、二甲亚砜(DMSO)、10 ％FCS RPMI1640、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、 酶标检测仪。
or molarity of the buffer due to common ion effects
方案2
• Choose the buffer（with a pKa as close as possible to the desired pH） • Indentify whether the buffer is made from an acid or a base（buf
珠磨法、压榨法 高压匀浆、超声破碎、撞击法
非机械法
干燥处理 溶胞作用
1）酶溶法 2）化学法 3）物理法
超临界细胞破碎
1、机械方法破碎
• 1）珠磨法（bead milling） ：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻 璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互 碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物
• Before the protein can be isolated, it is necessary to conceive of(确定) an activity and to devise（设计） an appropriate assay.
第三章细胞分离与破碎蛋白质复性
第二节 细胞分离
2.2 离心分离设备： ①实验室用离心机：离心管式转子离心机
特点：间歇式操作
各种形式的离心机转子
第二节 细胞分离
②工业用离心机：管式离心机， 碟片式离心机 特点：可连续操作
管式离心机
管式离心机能澄清及分离流体物质，被应用于化学、生物化学、 制药、血浆等研究领域。设备简单，分离效率高；但生产能力 较小。
第二节 细胞分离
3 过滤（Filtration）
①定义——利用多孔性介 质截留悬浮液中的固体粒 子，进行固液分离的方法。
第二节 细胞分离
②过滤前处理 通常发酵液的黏度大，其中的微生物体
积小，造成过滤的困难 在过滤前，一般需对料液进行絮凝或凝
聚等预处理，此外可添加助滤剂提高过 滤速度。
第二节 细胞分离
蛋白质
孔蛋白 类脂A (Lipid A)
(脂多糖)
脂蛋白
磷脂分子
第三节 细胞质尽量少地 释放出来，并尽量降低细胞的破碎程度，有利 于下游分离纯化。
第三节 细胞破碎
4 细胞破碎技术 4.1 机械破碎：
原理：细胞在机械作用力下受到压缩和剪切而 破碎。 细胞越小，所需压缩或剪切力越大，越难破碎。 优点：处理量大、效率高、速度快，是工业规 模的主要手段
碟式离心机
碟式离心机是沉降式离心机中的一种，用于分离难分离的 物料（例如粘性液体与细小固体颗粒组成的悬浮液或密度 相近的液体组成的乳浊液等）。碟式分离机是应用最广的 沉降离心机。 碟式离心机可以完成两种操作：(1)液-固分离，称澄清操 作；(2)液-液（或液-液-固）分离（即乳浊液的分离），称 分离操作。
革兰氏阳性细菌的细胞壁结构
革兰氏阳性（G+） 细菌的细胞壁具有 较厚（30-40nm） 而致密的肽聚糖层， 多达20层
细胞器的分离方法
细胞器的分离方法1.细胞获取：首先需要获取细胞样品，可以是从动物或植物组织中获得的细胞，也可以是培养细胞。
获得细胞样品后，可以通过离心等方法将细胞分离出来。
2.细胞破碎：将获得的细胞样品放入细胞破碎缓冲液中，并使用机械或化学方法破碎细胞膜，释放细胞器。
3.离心分离：将细胞破碎液进行离心，以分离不同大小和密度的细胞器。
离心通常使用超高速离心机，根据不同细胞器的离心速度和时间来实现分离。
4.纯化和分析：将离心分离的细胞器进行纯化和分析。
纯化方法通常包括悬浮液密度梯度离心、膜过滤、离子交换色谱、凝胶过滤等技术。
分析方法可以是电镜观察、质谱分析、蛋白质组学等。
以下是一些常用的细胞器分离方法：超高速离心法：是最常用的细胞器分离方法之一、该方法利用离心力将不同大小和密度的细胞器沉积到不同的位置。
细胞破碎液被离心数次，每次离心的速度和时间都不同，以分离不同的细胞器。
悬浮液密度梯度离心法：该方法使用悬浮液密度梯度将细胞器分离。
悬浮液由不同密度的溶液组成，使得不同密度的细胞器可以沉降到合适的位置。
该方法适用于体积较大的细胞器，如线粒体和高尔基体。
膜过滤法：该方法使用膜过滤器将细胞器分离。
膜过滤器有不同的孔径大小，通过选择合适的孔径，可以分离不同大小的细胞器。
这个方法操作简单，但限制了分离的准确性和纯度。
离子交换色谱法：该方法通过利用离子交换材料吸附不同电荷的细胞器，来实现分离。
离子交换材料通常是带电的小颗粒，可以通过吸附和洗脱过程将细胞器分离出来。
凝胶过滤法：该方法使用凝胶过滤器将细胞器分离。
凝胶过滤器通常是由特定孔径的聚合物凝胶制成，可以根据孔径选择来分离不同大小的细胞器。
该方法操作简便，但也有一定的分离效率限制。
总之，细胞器的分离方法是通过根据细胞器的大小、密度、电荷等特性，利用不同的技术手段将其分离出来，以研究其结构和功能。
这些方法在细胞生物学、生物医学研究和药物开发中发挥着重要的作用。
第二章_细胞破碎技术
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖占 40 ％一 90％，其余是多糖和磷壁酸。 革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，最外面还有一 较厚的外壁层，外壁层主要由脂蛋白，脂多糖 组成。
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网 状结构，其网状结构的致密程度和强度取决 于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的 程度，如果交联程度大，则网结构就致密。
W S K 卧 式 高 效 全 能 珠 磨 机
ZM 系 列 卧 式 密 闭 珠 (砂) 磨 机
（三）超声破碎法 工作原理：利用超声波振荡器发射的1525kHz的超声波处理细胞悬浮液，由于超 声波的空化作用而使细胞破碎。 特点：超声波振荡容易引起温度的剧烈 上升，操作时可以在细胞悬浮液中投入 冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。
二、植物细胞
真核细胞具有真正的细胞核，其结构要比 原核生物复杂的多。和原核细胞一样，真 核细胞也具有一层细胞膜。 除了细胞膜，真核细胞具有一些有特殊作 用的细胞器。 植物和大多数真菌具有细胞壁。
动 物 细 胞 模 式 图
植 物 细 胞 模 式 图
对于已停止生长的植物细胞来说，其细胞 壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁 是细胞生长时期形成的。次生壁是细胞停 止生长后，在初生壁内部形成的结构。
一、微生物细胞
细胞外层结构
革兰氏阴性菌（Gram-negative），泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。葡萄 球菌、链球菌。 革兰氏阳性菌（Gram Positive）是能够用革兰氏染色染成深蓝或紫色的细菌。 大肠杆菌。
各种微生物细胞壁的结构及组成
微生物 壁厚（nm） 层 革兰式阳性菌 革兰式阴性菌 酵母 20～80 单层 肽聚糖(40~90%) 多糖 胞壁酸 主要组成 蛋白质 脂多糖 破碎难易程度 难 10～25 100～300 多层 多层 肽聚糖(5~10%) 葡聚糖(30~40%) 脂蛋白 甘露聚糖 （30％） 脂多糖 磷脂 蛋白质 蛋白质 脂类 相对易 最难
第四章 细胞破碎和分离技术
（2）有机溶剂法
有机溶剂能溶解细胞壁的脂类，从而改变细 胞通透性。
（3）表面活性物质
能溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞通透性增加。
化学法的优缺点 优点 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，
易于固液分离和进一步提取。
①通用性差； 缺点 ②时间长，效率低，一般胞内物质释放率 不超过 80％。 ③有些化学试剂有毒，后续工作需设法分 离除去。
纳豆激酶
1980年，日本心脑血管专家须见洋行博士， 从事溶解血栓药物研究工作
“下午两点半”实验 下午两点半：纳豆提取物加入到人工 血栓中；
下午五点半：血栓溶解2厘米
纳豆的制作
1、泡豆蒸豆
大豆，加水浸泡一夜后，蒸烂。
2、接种纳豆菌
纳豆菌用热水溶解后，加入到大豆中，搅拌均匀，分装。
3、在恒温下发酵14-36小时 4、后熟（活菌低温休眠）
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 （2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
（二）膨胀床分离技术
1、膨胀床的定义
（1）固定床：又称填充床，填充的固体物通常呈 颗粒状，堆积成一定高度的床层。床层静止不动， 流体通过床层进行分离纯化。 （2）流化床：当流体通过床层的速度逐渐提高到 某值时，填料颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床 层体积出现膨胀，但是颗粒仍逗留在床层内而不被 流体带出。床层的这种状态和液体相似称为流化床
（5）柱床的再生和清洗
2复件 3细胞的破碎与分离
2.细胞破碎方法的分类：
机械法
酶法 化学法 物理法 后面将作详细介绍。
（1）机械法 匀浆法 研磨法 细胞通过高的机械剪切力被破坏。 热量的产生是该法的一个缺点。 不容易规模放大: 如果一种方法可以在实验室规模下操作， 我们并不知道这种方法在大规模生产中是否可 行。所以，这部分内容主要作为实验的指导， 而不是工程分析。
（3）表面活性剂法 疏水基团将溶解的脂蛋白包在中心， 亲水基团在外，膜的通透性改变而溶解。 适用于与膜相结合的酶的溶解。
7.物理法
（1）渗透压冲击法 细胞经高渗溶液使之脱水收缩， 然后转入水或缓冲液， 渗透压突然变化，细胞快速膨胀而破裂。 为各种破碎方法中最温和的，适用于易破 碎的细胞。 如：溶血现象。
3.2 细胞破碎理论
1.细胞的破碎
压撞
剪切
渗透
冻胀
破壁破膜
（1）剪切力F 假定细胞直径为d(m)，维持球体所需的 综合维持力为(N/m)，则破碎细胞所需F(Pa)为：
如利用流体剪切力(Pa)的作用，则在 牛顿流体中：
则破碎细胞的速度梯度为：
du 4 dy d
意义：细胞直径，所需压力或剪切力， 破碎难度。
3.7 细胞破碎的评价 1.破碎率定义：
N0：原始细胞数 N：破碎后残存的正常细胞 N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。
2.直接计数法 （1）方法 样本稀释 --染色 --- 上样 --- 计数
（2）优点：方法简单。 （3）缺点： ①计数时间长 ②只有活细胞才被计数，误差大 ③细胞聚集时，不利计数 ④染色误差。
不少情况下，产物不在发酵液中，而 是包裹在生物体内，属胞内产物。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋 白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞 内沉积。 脂类物质和一些抗生素也是包含在生 物体中。不少情况下，产物还是包裹在生 物体内，属胞内产物。
细胞分离与破碎bei
适用于各种不同类型的细胞，尤其是对硬质 细胞壁的破碎具有较好的效果。
04
细胞分离与破碎技术的发展 趋势
细胞分离与破碎技术的联合应用
离心分离与超声破碎的联合
通过离心分离技术将细胞从混合物中分离出来，再结合超声破碎 技术对细胞进行破碎，提高细胞内物质的提取效率。
膜过滤与化学渗透的联合
利用膜过滤技术将细胞进行分离，再通过化学渗透技术对细胞进行 破碎，适用于处理大量细胞。
砂磨机
通过砂砾与细胞之间的摩 擦和挤压实现破碎，适用 于硬质细胞壁的破碎。
珠磨法
将细胞与玻璃珠或石英砂 混合，通过振动或搅拌使 细胞破碎，适用于软质细 胞壁的破碎。
化学破碎法
酸碱处理法
非离子表面活性剂处理法
利用酸或碱溶液处理细胞，使细胞壁 溶解，适用于对酸碱耐受性较好的细 胞。
利用非离子表面活性剂处理细胞，使 细胞膜溶解，适用于对非离子表面活 性剂耐受性较好的细胞。
详细描述
细胞吸附柱分离法是一种基于细胞表面特性的分离技术，利用特定的配体与细胞 表面受体结合，实现细胞的吸附和分离。这种方法具有高选择性、高纯度、低成 本等优点，适用于稀有细胞的分离和纯化，如干细胞、肿瘤细胞等。
03
细胞破碎技术
机械破碎法
01
02
03
高速组织捣碎机
利用高速旋转的刀片将细 胞破碎，适用于较大细胞 群体的破碎。
3
光热转换技术
利用光热转换效应对细胞进行加热，通过热刺激 使细胞破碎，具有非侵入性和环保性。
细胞分离与破碎技术在生物工程领域的应用前景
生物制药生产
通过细胞分离与破碎技术提取细胞内 的药物有效成分，提高药物产量和纯 度。
基因工程
利用细胞分离与破碎技术获取细胞内 的基因物质，进行基因克隆、基因表 达和基因编辑等研究。
04
细胞分离与破碎技术的发展 趋势
细胞分离与破碎技术的联合应用
离心分离与超声破碎的联合
通过离心分离技术将细胞从混合物中分离出来，再结合超声破碎 技术对细胞进行破碎，提高细胞内物质的提取效率。
膜过滤与化学渗透的联合
利用膜过滤技术将细胞进行分离，再通过化学渗透技术对细胞进行 破碎，适用于处理大量细胞。
砂磨机
通过砂砾与细胞之间的摩 擦和挤压实现破碎，适用 于硬质细胞壁的破碎。
珠磨法
将细胞与玻璃珠或石英砂 混合，通过振动或搅拌使 细胞破碎，适用于软质细 胞壁的破碎。
化学破碎法
酸碱处理法
非离子表面活性剂处理法
利用酸或碱溶液处理细胞，使细胞壁 溶解，适用于对酸碱耐受性较好的细 胞。
利用非离子表面活性剂处理细胞，使 细胞膜溶解，适用于对非离子表面活 性剂耐受性较好的细胞。
详细描述
细胞吸附柱分离法是一种基于细胞表面特性的分离技术，利用特定的配体与细胞 表面受体结合，实现细胞的吸附和分离。这种方法具有高选择性、高纯度、低成 本等优点，适用于稀有细胞的分离和纯化，如干细胞、肿瘤细胞等。
03
细胞破碎技术
机械破碎法
01
02
03
高速组织捣碎机
利用高速旋转的刀片将细 胞破碎，适用于较大细胞 群体的破碎。
3
光热转换技术
利用光热转换效应对细胞进行加热，通过热刺激 使细胞破碎，具有非侵入性和环保性。
细胞分离与破碎技术在生物工程领域的应用前景
生物制药生产
通过细胞分离与破碎技术提取细胞内 的药物有效成分，提高药物产量和纯 度。
基因工程
利用细胞分离与破碎技术获取细胞内 的基因物质，进行基因克隆、基因表 达和基因编辑等研究。
细胞破碎-分离纯化
细胞破碎
概述
/jpkc/bbs
细胞破碎 植物细胞初生壁的化学组成
组分
纤维素 半纤维素 果胶物质
结构和分类
β－1，4－D－葡聚糖
木葡聚糖 甘露聚糖 木聚糖(包括阿拉伯木聚糖和40-甲基-葡萄糖醛酸木聚糖） 半乳糖醛酸聚糖 、 鼠李半乳糖醛酸聚糖 半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖
biotechecusteducnjpkcbbs概述目前较流行的初生细胞壁结构是由lampert等人提出的经纬模型依据这一模型纤维素的微纤丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上面同一层次上的微纤丝平行排列而不同层次上则排列方向不同互成一定角度形成独立的网络构成了细胞壁的经模型中的纬是结构蛋白富含羟脯氨酸的蛋白它由细胞质分泌垂直于细胞壁平面排列并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联构成更复杂的网络系统
/jpkc/bbs
细胞破碎
概述
概
述
★但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细 胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞 分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类 rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞 破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然 后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
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细胞破碎
细胞破碎技术
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀 锥型阀 球型细胞破碎阀 高压匀浆器各种阀型设计
/jpkc/bbs
细胞破碎
细胞破碎技术
高压匀浆法适用的范围
高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎。 料液细胞浓度可达到20%左右。 ☆团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高 压匀浆法。
第三章细胞的破碎与分离
胶体磨
德国进口珠磨机
结果与分析
甘蔗叶片和茎总RNA的提取及mRNA的分离纯化
图2-1甘蔗叶片总RNA Fig.2-1Total RNA isolated from sugarcane leaf
图2-2甘蔗茎总RNA
Fig.2-2 Total RNA isolated from sugarcane stem
珠磨机破碎作用方程
破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下 列公式： ln[1/(1-x)]=Kt x — 破碎率；K一 一级反应速度常数；t一 时间。 K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠 装量和珠体直径，以及温度等相关。 该式中t在间歇操作时为破碎操作时间，连续操作时为细胞 悬浮液在破碎室内的平均停留时间，即 t=V/Q V为破碎室的有效体积（即为悬浮液的体积），Q 为料液流量。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分 子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不 易分离而给后续操作带来的困难。
多层
多聚糖 (80-90%) 脂类 蛋白质
主要 肽聚糖(40组成 90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖(1-4%)
细胞破碎技术
细胞破碎技术
细胞破碎技术
破碎方式 机械法 非机械法
固体剪切 作用 压榨
液体剪切 作用 高 压 匀 浆 超 声 破 碎
干燥 处理 酶溶法
溶胞 作用 化学法 物理法
珠磨法
高压匀浆器的排出阀
影响高压匀浆器细胞破碎因素
• 被破碎的细胞分率符合如下公式：
• ln[1/(1-R)]=KNPɑ Rn与最大释放量Rm之比； • K － 与温度有关的速度常数；
• 式中 R — 破碎率，为N次循环后，蛋白质的释放量
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BIoseparatIon EngIneerIng
本章节重点：
离心沉降公式的推导及应用； 离心设备的分类及工作原理； 细胞破碎一般方法及原理。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
BIoseparatIon EngIneerIng
概述
通过微生物发酵或动植物细胞培养得到的原料液，应首先 将其中的菌体或细胞与培养液分离。
1.2.3.离心分离设备
实验室一般用转子离心机。
按速度分为低速离心机、高速离心机、超 离心机。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
1.2.1 离心沉降速度
单位质量的物质所受到的离心力为：
其中N为转速，r为离心机半径
离心设备的一个重要技术指标是：所 能达到的离心力与重力的比值，称为 分离因数。分离因数是衡量离心程度 的参数r用z表示：
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注意：科技文献中常将离心操作的条件用多少
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一些菌体细胞的大小和离心操作条件
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(2)区带离心
重力
Fg
1 6
dP3Sg
浮力
Fb
1 6
dP3L
g
阻力
FSζ L 2vg2× 4dP 2ζ dP 28Lvg2
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1.滞留区：stokes方程 10-4<Re<1
沉降速度
vg
dP2(S L)g 18L
2.过渡区：Allen公式 1<Re<103
BIoseparatIon EngIneerIng
1.1重力沉降
重力沉降在化工操作过程中常用的气-固、 液-固和液-液分离手段，在生物分离过程中 亦有较多的应用
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以液固沉降为例，重力沉降过程中固体颗粒受 到重力、浮力和阻力的作用。
g(如5000g、8000g等)表示．就是将离心力用
Zg形式表达的。将 stokes公式中的g用Zg代替，
得到离心沉降速度vs公式：
vs
22dP2(SL)N2r 9L
或者：
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需要注意的一个公式：
室温下（20℃）某物质在水中的沉降系数：
Hale Waihona Puke BIoseparatIon EngIneerIng
1.2 离心沉降
离心沉降是科学研究与生产实践中最 广泛使用的非均相分离手段，不仅适 用于菌体和细胞的回收或除去，而且 可用于血球、胞内细胞器、病毒以及 蛋白质的分离．也广泛应用于液---液 相分离。
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如果目标产物为胞外物，可直接利用培养液进行以后的分 离纯化操作；如果目标产物为胞内物，则要对菌体或细胞 进行适当的处理，释放目标产物，然后除去细胞或其碎片， 再进行目标产物的分离纯化。
本章介绍细胞分离、目标产物释放以及蛋白质复性的主要 方法和原理。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
1 细胞分离
S W ,20
S0 W ,20
1 kc
一些蛋白质的沉降系数表
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1.2.2 离心分离法
（1）差速离心分级
差速离心(Differential centrifugation)是生物化工 最常用的离心分离方法。
以菌体细胞的收集或除去为目的的固液 离心分离是分级离心操作的一种特殊情 况，即为一级分组分离。
vg
dP2(S L)g 18L
公式计算
当颗粒浓度较大时，颗粒之间相互碰撞相干扰，
影响沉降速度。此时，颗粒的沉降速度比单一颗
粒小，需用空隙率函数f (ε):
v
' g
vg
1 f (ε)
校正
f (ε) ε4.65为悬浮液的空隙率
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BIoseparatIon EngIneerIng
区带离心法可用于蛋白质、核酸等 生物大分子的分离纯化，但处理量 小，一般仅限于实验室水平。
20世纪60年代人们开发了区带转子， 利用其代替离心管，可增加处理能 力。
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区带离心是生化工程中的重要分离手段，根据离心操 作条件不同，又分差速区带离心和平衡区带离心。
两种区带离心法均事先在离心管中用某种低分子溶质 (如蔗糖溶液）调配好密度梯废，在密度梯度之上加待 处理的料液进行离心操作。
两者的区别在于溶质的密度梯度中的与待分离物质的 密度梯度不一样。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
另外，向含菌体的料液中加入聚丙 烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝 剂，可使菌体之间产生架桥作用而 形成较大的凝聚颗粒。
凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降， 而且还可以在过滤分离中大大提高 过滤速度和质量。当培养液中含有 蛋白质时．可使部分蛋白质凝聚而 同时过滤除去。
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菌体和动植物细胞的重力沉降虽然简 便易行，但菌体细胞体积很小，沉降 速度很慢。
因此，实用上需使菌体细胞凝聚成较 大颗粒后进行沉降操作，提高沉降速 度。在中性盐的作用下，可使菌体表 面双电层排斥电位降低，有利于菌体
之间产生凝聚。
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沉降速度
vg0.27[dP(SLL)gRe0.6]0.5
3湍流区：Newton公式 103<Re<2×105
沉降速度
vg
1.74[dP(SL)g]0.5 L
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一般而言单体细胞直径小、沉降速度很低，满足
10-4<Re<1，可使用
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概述
通过微生物发酵或动植物细胞培养得到的原料液，应首先 将其中的菌体或细胞与培养液分离。
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实验室一般用转子离心机。
按速度分为低速离心机、高速离心机、超 离心机。
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1.2.1 离心沉降速度
单位质量的物质所受到的离心力为：
其中N为转速，r为离心机半径
离心设备的一个重要技术指标是：所 能达到的离心力与重力的比值，称为 分离因数。分离因数是衡量离心程度 的参数r用z表示：
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注意：科技文献中常将离心操作的条件用多少
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(2)区带离心
重力
Fg
1 6
dP3Sg
浮力
Fb
1 6
dP3L
g
阻力
FSζ L 2vg2× 4dP 2ζ dP 28Lvg2
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1.滞留区：stokes方程 10-4<Re<1
沉降速度
vg
dP2(S L)g 18L
2.过渡区：Allen公式 1<Re<103
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1.1重力沉降
重力沉降在化工操作过程中常用的气-固、 液-固和液-液分离手段，在生物分离过程中 亦有较多的应用
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以液固沉降为例，重力沉降过程中固体颗粒受 到重力、浮力和阻力的作用。
g(如5000g、8000g等)表示．就是将离心力用
Zg形式表达的。将 stokes公式中的g用Zg代替，
得到离心沉降速度vs公式：
vs
22dP2(SL)N2r 9L
或者：
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需要注意的一个公式：
室温下（20℃）某物质在水中的沉降系数：
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1.2 离心沉降
离心沉降是科学研究与生产实践中最 广泛使用的非均相分离手段，不仅适 用于菌体和细胞的回收或除去，而且 可用于血球、胞内细胞器、病毒以及 蛋白质的分离．也广泛应用于液---液 相分离。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
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如果目标产物为胞外物，可直接利用培养液进行以后的分 离纯化操作；如果目标产物为胞内物，则要对菌体或细胞 进行适当的处理，释放目标产物，然后除去细胞或其碎片， 再进行目标产物的分离纯化。
本章介绍细胞分离、目标产物释放以及蛋白质复性的主要 方法和原理。
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1 细胞分离
S W ,20
S0 W ,20
1 kc
一些蛋白质的沉降系数表
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1.2.2 离心分离法
（1）差速离心分级
差速离心(Differential centrifugation)是生物化工 最常用的离心分离方法。
以菌体细胞的收集或除去为目的的固液 离心分离是分级离心操作的一种特殊情 况，即为一级分组分离。
vg
dP2(S L)g 18L
公式计算
当颗粒浓度较大时，颗粒之间相互碰撞相干扰，
影响沉降速度。此时，颗粒的沉降速度比单一颗
粒小，需用空隙率函数f (ε):
v
' g
vg
1 f (ε)
校正
f (ε) ε4.65为悬浮液的空隙率
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区带离心法可用于蛋白质、核酸等 生物大分子的分离纯化，但处理量 小，一般仅限于实验室水平。
20世纪60年代人们开发了区带转子， 利用其代替离心管，可增加处理能 力。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
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区带离心是生化工程中的重要分离手段，根据离心操 作条件不同，又分差速区带离心和平衡区带离心。
两种区带离心法均事先在离心管中用某种低分子溶质 (如蔗糖溶液）调配好密度梯废，在密度梯度之上加待 处理的料液进行离心操作。
两者的区别在于溶质的密度梯度中的与待分离物质的 密度梯度不一样。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
另外，向含菌体的料液中加入聚丙 烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝 剂，可使菌体之间产生架桥作用而 形成较大的凝聚颗粒。
凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降， 而且还可以在过滤分离中大大提高 过滤速度和质量。当培养液中含有 蛋白质时．可使部分蛋白质凝聚而 同时过滤除去。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
菌体和动植物细胞的重力沉降虽然简 便易行，但菌体细胞体积很小，沉降 速度很慢。
因此，实用上需使菌体细胞凝聚成较 大颗粒后进行沉降操作，提高沉降速 度。在中性盐的作用下，可使菌体表 面双电层排斥电位降低，有利于菌体
之间产生凝聚。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
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沉降速度
vg0.27[dP(SLL)gRe0.6]0.5
3湍流区：Newton公式 103<Re<2×105
沉降速度
vg
1.74[dP(SL)g]0.5 L
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
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一般而言单体细胞直径小、沉降速度很低，满足
10-4<Re<1，可使用