青霉素生产菌种的制备与保藏方法

青霉素生产菌种的制备与保藏方法

生命科学学院生物10-2 赵鑫指导教师：朴永哲

摘要：青霉素发酵属单一纯菌种发酵，青霉素生产菌种的制备是青霉素发酵过程的关键环节，生产菌种的质量是影响发酵生产水平的重要因素。在生产过程中既要有优良的菌种，又要有良好的培养条件才能获得高质量的种子。本文将对青霉素生产菌种的制备与保藏方法进行介绍。

关键词：产黄青霉；青霉素；制备工艺；保藏方法

1.概述

1.1 青霉素的定义

青霉素（Benzylpenicillin / Penicillin）又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。

1.2 青霉素的应用

青霉素类抗生素的毒性很小，由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁，而人类只有细胞膜无细胞壁，故对人类的毒性较小，除能引起严重的过敏反应外，在一般用量下，其毒性不甚明显，是化疗指数最大的抗生素。

临床应用：主要控制敏感金黄色葡糖球菌、链球菌、肺炎双球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌、螺旋体等引起感染，对大多数革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体有抗菌作用。青霉素针剂和口服青霉素能分别治疗肺炎、肺结核、脑膜炎、心内膜炎、白喉、炭疽等病。

工业应用：可用于生产柠檬酸、延胡索酸、葡萄糖酸等有机酸和酶制剂。

2.菌种及保藏方法介绍

2.1 菌种介绍

产黄青霉属无性型真菌，一种属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目从梗孢科青霉属的真菌。分布于土壤、空气及腐败的有机材料等基物。最适生长温度为20-30°C。产生青霉素、多种酶类及有机酸，是重要的工业用真菌，也产生真菌毒素。

产黄青霉的发现和大规模地生产、应用，不仅对抗生素工业的发展起了巨大的推动作用，而且加上其他抗生素的广泛使用，比如像磺胺药物，使人类的平均寿命，再次延长了四岁。此外，有的青霉菌还用于生产灰黄霉素及磷酸二酯酶、纤维素酶等酶制剂和有机酸

2.2 菌种的保藏

从自然界土壤中获得的能产生产黄青霉的微生物，经过分离，选育和纯化后即成为菌种。为了使优良菌种的性状保持稳定，人为地创造条件，使菌种的新陈代谢活动处于不活泼状态。菌种的保藏方法有：斜面菌种低温保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷冻干燥法。

2.2.1 斜面菌种低温保藏法

利用低温对微生物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液等，直接放入4～5℃冰箱中。保藏时间一般不超过3个月，到时必须进行移接传代，再放回冰箱。

2.2.2 砂土管保藏法

将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土管，然后接种保藏。若把砂土管放在低温或抽气后密封，效果更佳。此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。保藏期1～10年。

2.2.3 甘油封藏法

向培养好的菌种斜面上，加入灭菌甘油，高出斜面1cm，然后蜡封管口，放入冰箱。该法既可防止培养基水分蒸发，又能使菌种与空气隔绝。保藏期1～2年。

2.2.4 真空冷冻干燥法

是目前比较理想的一种方法。在低于-15℃下，快速将细胞冻结，并保持细胞完整，然后在真空中使水分升华致干。在此环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异，故可长时间保存，一般为5～10年，最多可达15年之久。此法兼备了低温、干燥及缺氧几方面条件，使微生物可以保存较长时间，但过程较麻烦，需要一定的设备。

2.2.5 液氮超低温保存法

将生长稳定期的细胞悬浮在10%甘油或其他低冰点液体中，密封于安瓿管内，然后控制冷却速度，使安瓿管温度逐步下降至-35℃时，即可置于-150～-196℃的液氮罐中保存。大多数微生物如病毒、噬菌体、多种细菌、放线菌、酵母和原虫、特别是一些用冷冻干燥法有困难的微生物，都可用此法长期保存。

3.制备工艺介绍

3.1 工艺流程示意图

产黄青霉→斜面孢子（25°C，孢子培养，7d）→大米孢子（26°C，孢子培养56h）→一级种子培养液（27°C，种子培养，24h）→二级种子培养液（27~26°C，发酵，7d）→菌种保藏（4～5℃冰箱，不超过三个月）。

1.沙土孢子

2. 斜面孢子

3. 扁瓶孢子

4. 种子罐

5. 发酵罐

3.2 培养基成分

孢子制备所需培养基成分：琼脂斜面培养基，大米天然培养基。

种子制备所需培养基成分：玉米浆，蔗糖，硫酸铵，碳酸钙，豆油，消沫剂；pH6.2～6.5。

3.3 孢子的制备

2.3.1 将生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃下培养7天。2.3.2 将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶大米天然培养基上，于26℃培养56h。

2.3.3 将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入4℃冰箱中备用。

3.4 种子的制备

种子罐级数是在指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。青霉素种子制备一般为二级种子罐扩大培养。

3.4.1 一级种子培养液（27°C，种子培养，24h）

将上述获得的大量孢子作为种子罐的种子。

种子罐的目的是使接入有限的孢子迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。

其中的培养基组分包括碳源（蔗糖）和氮源（玉米浆），及无机盐（碳酸钙）等。

3.4.2 二级种子培养液（27~26°C，发酵，7d）

将一级培养中得到的生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常的菌体接种至发酵罐进行二级种子培养。

接种量一般在10%～20%。

4. 参考文献

[1] 汤羽. 青霉素发酵生产工艺研究[J].卫生与健康，2012，(15)：278-278

[2] 吴旭国. 浅谈青霉素的生产工艺过程[J].科技论坛，2012，(02)：31-37