分子荧光和磷光光谱分析法讲解
合集下载
荧光和磷光解析
一、基本原理
（1）螯合物中配位体的发光
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构， 分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金 属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大， 常会发生荧光。
如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但 其金属螯合物具有很强的荧光
一、基本原理
（2）螯合物中金属离子的特征荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发， 接着配位体把能量转给金属离子，导致dd 跃迁和ff 跃迁， 最终发射的是d*d跃迁和f *f 跃迁光谱。
一、基本原理
单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s， 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s 以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
一、基本原理
1.2 激发态分子退激 辐射跃迁方式 无辐射跃迁方式
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射
无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛 豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移 （EC）等
一、基本原理
（3）镜像规则
通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。
S2
S1 T1
S0
吸光1
吸光2
荧光3
一、基本原理
（3）镜像规则 通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。 吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能 级形成的。其形状决定于第一电子激发态中各 振动能级的分布 情况。
激发波长的选择与发射波长的判断
一、基本原理
2.3 荧光发射光谱的普遍特性： （1）Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长， 称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能 量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量 的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。
第七章 分子发光-荧光与磷光解读
激发光谱
发射光谱
l
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
三、荧光光谱的特征—激发光谱与发射光谱的关系
1、Stokes位移 在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激 发)光谱的波长长，荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes 位移。 处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量，
T1
紫 外 可 见 吸 收 光 谱
紫 外 可 见 共 振 荧 光 S0 光 谱
S1
迟 滞 荧 光
振动弛豫: Vr 10-12sec 外 转 移:无辐射跃迁 回到基态 内 转 移:S2~S1能级 之间有重叠 系间窜跃: S2~T1能级 之间有重叠 反系间窜跃:由外部获 取能量后 T1 ~ S2
磷 光
外转移
蒽的发射光谱
蒽的三维等高线光谱图
蒽的三维等荧光强度光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3.三维共振光散射光谱
ADS ATS ADS ATS RLS DS TS
RLS
DS
TS 散射片三维共振光散射光谱
固定lex=270nm
共振光散射 瑞利散射 拉曼光 二级共振光散射 三级共振光散射
500 550 600 650 700 750 800 850 900
2.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单 重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
S0→T1 禁阻跃迁；
通过其他途径进入
分子发光—荧光、磷光和化学
(L+S),(L+S0 1),…,(|L 1 -S|) 2 S 1 光 谱 项 n LJ
31 3 1 0
2, 1, 0
3.激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通 过辐射跃迁 ( 发光 )和无辐射跃迁等方式失去能量（去 活化） 传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
发 射 荧 光
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
能量传递过程
（1）振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR） 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因 碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振 动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。 （2）内转换（Internal Conversion，IC） 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振 动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子 可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如 S2-S1；T2-T1。 （3）外转换（External Conversion，EC） 受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而 使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭” 或“猝灭”。
激发态
单重态基态S0
辐吸 射收
单重态基态S0 激发后 S/T两态
泡利不相容原理 S= 1 2 1 2 1 辐吸 射收
通常自旋不变 激发态S1/ S2
自旋改变 激发态T1/T2
Hund 规 则
M=2S+1 3 三重态triplet state
平行自旋 能量更低
单重态与三重态
n
1 2
大学仪器分析教学课件(分子荧光与磷光分析法)
phosphorescence analysis and application
analysis
00:36:24
一、仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：
单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：氙灯和高压汞灯 样品池：石英 检测器：光电倍增管。
三、磷光分析法及应用
与荧光相比，磷光具有两个特点
（1）磷光辐射的波长比荧光长
（2）磷光的寿命比荧光长
1.磷光强度与磷光物质浓度的关系
当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质浓度c之 间的关系式为
Ip=2.3φpI0εbc 式中：φp为磷光效率，I0为激发光的强度，ε磷光物质的摩尔 吸收系数，b为试样池的光程。
00:36:24
00:36:24
7、磷光分析法的应用
磷光分析法在无机化合物的测定中应用 较少，它主要用于测定有机化合物。 (1).稠环芳烃分析
采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和 杂环化合物（致癌物质）；见表
(2).农药、生物碱、植物生长激素的分析 (3).药物分析
见表
00:36:24
00:36:24
（2）胶束增稳的溶液室温磷光法 当向溶液中加入适量的表面活性剂，形成胶
束，由于胶束的多相性，改变了磷光团的微 环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光 团的物理性质，减小了内转化和碰撞能量损 失等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了 三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测 量室温磷光。
第四章 分子发光分析法
molecular luminescence
analysis
00:36:24
一、仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：
单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：氙灯和高压汞灯 样品池：石英 检测器：光电倍增管。
三、磷光分析法及应用
与荧光相比，磷光具有两个特点
（1）磷光辐射的波长比荧光长
（2）磷光的寿命比荧光长
1.磷光强度与磷光物质浓度的关系
当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质浓度c之 间的关系式为
Ip=2.3φpI0εbc 式中：φp为磷光效率，I0为激发光的强度，ε磷光物质的摩尔 吸收系数，b为试样池的光程。
00:36:24
00:36:24
7、磷光分析法的应用
磷光分析法在无机化合物的测定中应用 较少，它主要用于测定有机化合物。 (1).稠环芳烃分析
采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和 杂环化合物（致癌物质）；见表
(2).农药、生物碱、植物生长激素的分析 (3).药物分析
见表
00:36:24
00:36:24
（2）胶束增稳的溶液室温磷光法 当向溶液中加入适量的表面活性剂，形成胶
束，由于胶束的多相性，改变了磷光团的微 环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光 团的物理性质，减小了内转化和碰撞能量损 失等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了 三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测 量室温磷光。
第四章 分子发光分析法
molecular luminescence
第二章第二节分子荧光和磷光分析法
带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基 丙氨酸，可以直借用荧光法测定。
芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多 能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶 、维生素等均可用荧光法进行分析。
见表.
11:04:30
11:04:30
磷光分析法基本原理
一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的
3.室温磷光 (1)固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子 刚性,减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 。 滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅胶等
11:04:30
(2)胶束增稳： 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变
磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减 小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性．
对于较浓溶液， 由于猝灭 现象和自吸收等原因，使荧光强 度与浓度不成线性关系。
问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高?
①荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大 倍数;
② I0↑
A= lg(I0/It)
11:04:30
（2）定量方法
1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)；
2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光
如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发 生荧光猝灭,建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法.
如:铀的测定:将80gNaF压制成片,取含铀溶液滴在片上,在 1000℃烧成熔珠后测量.
11:04:30
11:04:30
(2)生物与有机化合物的分析
脂肪族有机化合物—般需要与某些试剂反 应后才能进行荧光分析。
芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多 能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶 、维生素等均可用荧光法进行分析。
见表.
11:04:30
11:04:30
磷光分析法基本原理
一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的
3.室温磷光 (1)固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子 刚性,减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 。 滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅胶等
11:04:30
(2)胶束增稳： 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变
磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减 小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性．
对于较浓溶液， 由于猝灭 现象和自吸收等原因，使荧光强 度与浓度不成线性关系。
问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高?
①荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大 倍数;
② I0↑
A= lg(I0/It)
11:04:30
（2）定量方法
1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)；
2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光
如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发 生荧光猝灭,建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法.
如:铀的测定:将80gNaF压制成片,取含铀溶液滴在片上,在 1000℃烧成熔珠后测量.
11:04:30
11:04:30
(2)生物与有机化合物的分析
脂肪族有机化合物—般需要与某些试剂反 应后才能进行荧光分析。
分子荧光与分子磷光
光与物质作用产生激发态分子，其返回基态时的发光现象称为光致发光，荧光和磷光都是光致发光。
多环芳烃和某些金属配合物分子结构中含有大平面丌电子共轭体系，是常见的荧光分子，可以直接进行荧光分析。
对于那些无荧光或荧光较弱的分子，通过与荧光试剂反应后可进行间接荧光分析。
分子荧光光谱法某些物质被紫外光照射激发后，在回到基态的过程中发射出比原激发波长更长的荧光，通过测量荧光强度进行定量分析的方法。
测定原理：由光源发射的光经第一单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。
为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行。
为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光以及为将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二单色器。
荧光作用于检测器上，得到响应的电信号。
（1）激发光源在紫外-可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯。
（2）样品池荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以方形和长方形为宜。
（3）单色器光栅（4）检测器由光电管和光电倍曾管作检测器，并与激发光成直角。
荧光分析方法的特点：（1）灵敏度高（2）选择性强（3）试样量少和方法简单（4）提供比较多的物理参数荧光分析法的弱点是它的应用范围小。
因为本身能发荧光的物质相对较少，用加入某种试剂的方法将非荧光物质转化为荧光物质进行分析，其数量也不多；另一方面，由于荧光分析的灵敏度高，测定对环境因素敏感，干扰因素较多。
分子磷光光谱法处于第一最低单重激发态分子以无辐射弛豫方式进入第三重激发态，再跃迁返回基态发出磷光。
测定磷光强度进行定量分析的方法。
分子磷光与分子荧光光谱的主要差别是磷光是第一激发单重态的最低能层，经系间跨越跃迁到第一激发三重态，并经振动弛豫至最低振动能层，然后跃迁回到基态发生的。
与荧光相比，磷光具有如下三个特点：（1）磷光辐射的波长比荧光长，分子的T1态能量比S1态低。
第五章 荧光及磷光光谱法
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象。
光致发光
常见的光致发光现象是荧光和磷光。
荧光:
激发光停止照射后，发光过程持续
10-9-10-6s。
磷光:
激发光停止照射后，发光过程持续 10-3-10s。
分析方法特点： ★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个 数量级； ★线性范围宽，试样用量少，方法简便； ★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外 可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光；
活的机率下降，荧光量子效率提高。如荧光素和酚 酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有，
芴的荧光强，而联苯的荧光弱。
5.3 影响因素
5.3.1 温度与溶剂效应
溶剂效应
溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。 一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。 特殊溶剂效应指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作 用，如氢键的生成和化合作用。 一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于
12:36:43
去活化 (5) 磷光发射
T1最低振动能级→ S0时产生磷光辐射 10-2-10s，寿命长多了！能量更低！
室 温 无 磷 光
(6) 外部转换 external conversion
激发态分子和溶剂等能量转换 荧光/磷光 消失，称熄灭或猝灭
12:36:43
去活化演示 驰豫 吸收
e
e
e
基态单重态
激发单重态
激发三重态
5.2.2
去活化过程
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时， 通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能 量；激发态停留时间短、返回速度快的途径，发 生的几率大，发光强度相对大。
传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
医学：分子荧光与分子磷光分析法
在疾病诊断和治疗中的应用
肿瘤诊断
荧光与磷光分析法可用于肿瘤的早期 诊断和监测，通过检测肿瘤标志物或 特定基因的表达水平，为肿瘤治疗提 供依据。
感染性疾病诊断
药物疗效评估
荧光与磷光分析法可用于评估药物治 疗的效果，通过监测疾病标志物的变 化，了解药物治疗对疾病的影响。
荧光与磷光分析法可用于检测病原体 和抗体，快速准确地诊断感染性疾病， 如细菌、病毒和寄生虫感染。
06
未来展望
分析技术的发展趋势
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的快速发展，分析方法将更加智
能化，提高检测的准确性和效率。
高灵敏度
02
通过改进荧光和磷光的发光机制，提高检测的灵敏度，实现对
低浓度生物分子的快速检测。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，实现对复杂生物样本中多种生物分
子的快速、准确检测。
在医学领域的应用前景
01
02
03
疾病诊断
利用荧光和磷光分析法对 生物分子进行高灵敏度检 测，为疾病诊断提供准确 依据。
药物研发
通过荧光和磷光分析法对 药物与生物分子相互作用 进行研究，为新药研发提 供有力支持。
个体化医疗
根据个体基因组、蛋白质 组等信息的检测结果，制 定针对性的治疗方案，实 现个体化医疗。
在生物分子检测中的应用
蛋白质检测
荧光与磷光分析法可用于检测蛋白质的含量和性质，有助于研究蛋 白质的功能和相互作用。
核酸检测
通过荧光与磷光分析法，可以检测DNA和RNA的含量和序列，用 于基因诊断、基因表达研究和疾病诊断。
生物标记物检测
荧光与磷光分析法可用于检测生物体内的生物标记物，如肿瘤标志物、 炎症标志物等，有助于疾病的早期发现和治疗监测。
chapter5分子磷光和荧光
有不同衍射图
电子衍射：电子衍射是透射电子显微镜的
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能
级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能
级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位；
2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 分子中一对电子为自旋反平行，S=0，M=1，这 种态被称为单重态或单线态，大多数有机分子 的基态处于单重态。 处于S0态的一对电子吸收光子受激后，产生了在 两平个行轨自道旋中比自成旋 方 向 平 行 的 电 子 ， 这 时 S=1 ， M对=自3，旋这稳种定状(态洪称为三重态或三线态。 特规则)，三重 态能级比相应
11. 顺磁共振波谱分析法 在外磁场的作用下，电子的自旋磁矩
与磁场相互作用而裂分为磁量子数不同的 磁能级，吸收微波辐射后产生能级跃迁， 1根2. 据旋吸光收法光谱可进行结构分析。
溶液的旋光性与分子的非对称结构有 密切关系，可利用旋光法研究某些天然产 物及配合物的立体化学问题，旋光计测定 1糖3. 的衍含射量法。 X射线衍射：研究晶体结构，不同晶体具
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
电子衍射：电子衍射是透射电子显微镜的
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能
级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能
级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位；
2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 分子中一对电子为自旋反平行，S=0，M=1，这 种态被称为单重态或单线态，大多数有机分子 的基态处于单重态。 处于S0态的一对电子吸收光子受激后，产生了在 两平个行轨自道旋中比自成旋 方 向 平 行 的 电 子 ， 这 时 S=1 ， M对=自3，旋这稳种定状(态洪称为三重态或三线态。 特规则)，三重 态能级比相应
11. 顺磁共振波谱分析法 在外磁场的作用下，电子的自旋磁矩
与磁场相互作用而裂分为磁量子数不同的 磁能级，吸收微波辐射后产生能级跃迁， 1根2. 据旋吸光收法光谱可进行结构分析。
溶液的旋光性与分子的非对称结构有 密切关系，可利用旋光法研究某些天然产 物及配合物的立体化学问题，旋光计测定 1糖3. 的衍含射量法。 X射线衍射：研究晶体结构，不同晶体具
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
分子荧光与分子磷光光谱法
11
（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线 荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根 据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，固定测量波 长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测 得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制 激发光谱 曲线。
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三 重态，以T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度=2s+1=1，为单 重态，以S0表示。
三重态能级低于单重态 （Hund规则）
3
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁 性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性， 其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重 态和三重态）。
当两个电子能级非常靠近以至其振
动能级有重叠时，常发生电子由高
S2
能级以无辐射跃迁方式转移至低能
级。右图中指出，处于高激发单重
态的电子，通过内转移及振动弛豫，
均跃回到第一激发单重态的最低振
动能级。
S0
内转移
S1 T1
吸光1 吸光2
荧光、磷光 能级图
6
荧光发射
处于第一激发单重态中的电子跃回至
基态各振动能级时，将得到最大波长
指不同多重态间的无辐射跃迁，例如
S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发
生系间窜跃时，电子由S1的较低振动
能级转移至T1的较高振动能级处。有
S2
时，通过热激发，有可能发生T1→S1，
然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧
光的机理。
系间窜跃
S1 T1
S0 吸光1
吸光2 荧光3
（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线 荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根 据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，固定测量波 长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测 得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制 激发光谱 曲线。
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三 重态，以T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度=2s+1=1，为单 重态，以S0表示。
三重态能级低于单重态 （Hund规则）
3
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁 性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性， 其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重 态和三重态）。
当两个电子能级非常靠近以至其振
动能级有重叠时，常发生电子由高
S2
能级以无辐射跃迁方式转移至低能
级。右图中指出，处于高激发单重
态的电子，通过内转移及振动弛豫，
均跃回到第一激发单重态的最低振
动能级。
S0
内转移
S1 T1
吸光1 吸光2
荧光、磷光 能级图
6
荧光发射
处于第一激发单重态中的电子跃回至
基态各振动能级时，将得到最大波长
指不同多重态间的无辐射跃迁，例如
S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发
生系间窜跃时，电子由S1的较低振动
能级转移至T1的较高振动能级处。有
S2
时，通过热激发，有可能发生T1→S1，
然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧
光的机理。
系间窜跃
S1 T1
S0 吸光1
吸光2 荧光3
分子荧光和磷光光谱分析法讲解
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
涉及非键的孤对电子
随溶剂形成氢键能力增大
荧光光谱向短波方向移动
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 某些芳族羰基化合物和氮杂环化合物
非极性、疏质子溶剂中 激发单重态（n、π*） 荧光弱或无
高极性的氢键溶剂中 激发单重态（ π 、π*） 荧光强
例如: 异喹啉 在环己烷中 在水中
无荧光 发磷光 发荧光
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
S2
系间跨越
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0
l3
分子荧光和磷光
l 1 光谱分析法讲解l 2
l 2
➢ 假如分子被激发到S2以上的某个电子激发单重 态的不同振动能级上，处于这种激发态的分子，
很快（约10-12~ 10-14s）发生振动弛豫而衰减到该
电子态的最低振动能级，然后又经过内转化及振
π → π*：自旋许可的跃迁 摩尔吸光系数大， 104 激发态寿命短 S1 T1系间窜越概率较小
n → π*：自旋禁阻的跃迁 摩尔吸光系数小，102 激发态寿命长 S1 T1系间窜越的几率大
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
分子荧光和磷光分析法
3
荧光和磷光体系能级示意图
4
激发光谱和发射光谱
Ê 激发光谱：物质分子选择性地吸收某一波段
的光产生的光谱。激发光谱为荧光强度与激发波 长的关系曲线。
Ê 发射光谱：受激发光照射时，荧光（磷光）
物质发射的光谱。如果固定激发光波长为激发光 谱峰值所对应的波长，然后测定不同波长时所发 射的荧光（或磷光）强度，即得荧光（磷光）光 谱曲线。
定量分析关系式
If = 2.3 ϕ I0 ε l c
浓度
荧
光 量
样品池厚度
子 效
吸光系数
率 入射光强度
发射光量子数
ϕ = 吸收光量子数 ≤ 1
1) 增加入射光强度，荧光强度增加
2)
If = Kc
只有在极稀溶液中，即ε l c < 0.05，
If与c方呈线性关系
苯酚的荧光标准曲线
荧光法的灵敏度比分光光度法高2~4个数量级
荧光 样品池
发射光 单色器
检测系统
荧光光度计示意图
Ø 光源与检测器呈90度角，以避开激发 光、杂散光的干扰，增加检测灵敏度。
I0
It
If
荧光 检测器
紫外－可见 检测器
Ø样品池 四面透光
Ø 分光系统(双单色器)
激发光单色器作用：选择激发波长
发射光单色器作用：分离出荧光发射波长
荧光和磷光分析法的应用
荧光定量分析的步骤： 1)绘制激发光谱和发射光谱，根据光谱曲线确定 最大激发光波长(λex)和最大发射波长(λem)作为 工作波长。 2)确定适宜的分析条件：溶剂、试剂浓度、pH、 温度等。 3)采取工作曲线法或比率法与标准溶液的荧光强 度比较，测得未知样品中待测组分的浓度
11
荧光和磷光体系能级示意图
4
激发光谱和发射光谱
Ê 激发光谱：物质分子选择性地吸收某一波段
的光产生的光谱。激发光谱为荧光强度与激发波 长的关系曲线。
Ê 发射光谱：受激发光照射时，荧光（磷光）
物质发射的光谱。如果固定激发光波长为激发光 谱峰值所对应的波长，然后测定不同波长时所发 射的荧光（或磷光）强度，即得荧光（磷光）光 谱曲线。
定量分析关系式
If = 2.3 ϕ I0 ε l c
浓度
荧
光 量
样品池厚度
子 效
吸光系数
率 入射光强度
发射光量子数
ϕ = 吸收光量子数 ≤ 1
1) 增加入射光强度，荧光强度增加
2)
If = Kc
只有在极稀溶液中，即ε l c < 0.05，
If与c方呈线性关系
苯酚的荧光标准曲线
荧光法的灵敏度比分光光度法高2~4个数量级
荧光 样品池
发射光 单色器
检测系统
荧光光度计示意图
Ø 光源与检测器呈90度角，以避开激发 光、杂散光的干扰，增加检测灵敏度。
I0
It
If
荧光 检测器
紫外－可见 检测器
Ø样品池 四面透光
Ø 分光系统(双单色器)
激发光单色器作用：选择激发波长
发射光单色器作用：分离出荧光发射波长
荧光和磷光分析法的应用
荧光定量分析的步骤： 1)绘制激发光谱和发射光谱，根据光谱曲线确定 最大激发光波长(λex)和最大发射波长(λem)作为 工作波长。 2)确定适宜的分析条件：溶剂、试剂浓度、pH、 温度等。 3)采取工作曲线法或比率法与标准溶液的荧光强 度比较，测得未知样品中待测组分的浓度
11
分子磷光和荧光优质资料课件
19
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为
S1→
S0跃迁），发射波长为
λ
’ 的荧光；而且不论电子开始
2
被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为λ ‘2的荧光。时间
10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
λ
‘ 2
>
λ
2
>
λ
1
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
激发光的光源用单色器分光，测定不同波长激发光照射下 荧光强度的变化。以激发波长（λ）为横坐标，荧光强度（IF） 为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱 （图中曲线I ） 。
2 .化合物的结构与荧光
(1)跃迁类型
对于大多数荧光物质，首先经历π→π∗或n(非键电子轨道)→π∗ 激发，然后经过振动弛豫或其它无辐射跃迁，再发生π∗→π或 π∗→n跃迁而得到荧光。
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
6
（2）分子光谱 基于分子中电子能级、振-转能级跃迁 紫外光谱法（UV） 红外光谱法（IR） 分子荧光光谱法（MFS） 分子磷光光谱法（MPS）
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为
S1→
S0跃迁），发射波长为
λ
’ 的荧光；而且不论电子开始
2
被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为λ ‘2的荧光。时间
10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
λ
‘ 2
>
λ
2
>
λ
1
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
激发光的光源用单色器分光，测定不同波长激发光照射下 荧光强度的变化。以激发波长（λ）为横坐标，荧光强度（IF） 为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱 （图中曲线I ） 。
2 .化合物的结构与荧光
(1)跃迁类型
对于大多数荧光物质，首先经历π→π∗或n(非键电子轨道)→π∗ 激发，然后经过振动弛豫或其它无辐射跃迁，再发生π∗→π或 π∗→n跃迁而得到荧光。
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
6
（2）分子光谱 基于分子中电子能级、振-转能级跃迁 紫外光谱法（UV） 红外光谱法（IR） 分子荧光光谱法（MFS） 分子磷光光谱法（MPS）
〖医学〗分子荧光与分子磷光分析法
OH
无荧光
O—
有荧光
13
8.7.5 荧光光度计及荧光测定方法
I0
It
氙灯(或高压汞灯）
（200-800 nm)
F
荧光光度计示意图
光电倍增管
14
荧光仪部件
激发光源: 能够在紫外-可见光区连续发光，
常用氙灯、高压汞灯或激光光源.
样品池: 石英池, 四壁透明. 单色器: 两个光栅单色器, 分置于样品池前后. 检测器: 光电池或光电倍增管, 与激发光成直角的
A=lgI0/I = －lgT=Kbc，摩尔吸光系数，比吸光系数。式
中各参数的物理意义，定量计算。
3. 方法和仪器：基本部件，分光光度计的类型，测量误差
(准确度), 灵敏度( 、S、）。
4. 显色反应及条件的确定: 显色剂用量、酸度、时间、温度、 干扰及消除。
5. 应用: 单一组分测定示例、多组分测定、光度滴定、络合 物组成的测定、酸碱离解常数的测定。
〖医学〗分子荧光与分子磷光分析法
8.7.1 发光机理(Jablonski Diagram)
分子吸光与发光示意图
荧光寿命: 10－9～10－7 s 磷光寿命: 10－4～10 s
2
蒽的激发光谱（吸收光谱）和发射光谱（荧光光谱）
吸收光谱 发射光谱
激发光谱:Excitation Spectrum, 激发波长:ex 发射光谱 Emission Spectrum, 发射波长:em 3
4. 络合滴定的方式和应用:
直接滴定、返滴定、析出法、置换滴定、间接滴 定法应用示例；
EDTA标准溶液的配制和标定，水质对测定结果 的影响。
28
第5章
1. 条件电位: 离子强度、沉淀、络合、酸度的影响
分子荧光和磷光光谱讲解
?-R、-SO 3H、-NH 3+→对? f 无影响
影响荧光的外部效应
1.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都 将使化合物的荧光发生变化；
?极性↑→? f↑→F↑→l↑
?粘度↓→分子间碰撞几率↑→F↓ ?含重原子(CBr 4、CH 3CH 2I)→F↓ ?形成氢键→S1*(V=0) 分子↓→F↓
能级图l 2 ,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发
单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一
定的荧光(如l
‘ 2
)。
镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状 一样）成镜像对称关系。
镜像规则
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
(1)定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率? ： If = ? Ia
由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10-? l c ) If = ? I0(1-10-? l c ) = ? I0(1-e-2.3? l c )
浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 ? I0 ? l c = Kc
硫胺荧浓度
吡啶硫胺荧浓度
42
荧光分析法的应用
(1)无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
2001年美国遭受911袭击时，美国世贸大厦内一共 有2万5千多人，人们惊讶地发现了一个世界都为之惊 叹的纪录：两座大楼里，1万8千多人在上百层的大楼 完全断电的情况下，在一个半小时之内成功逃生。
第6章分子荧光与磷光
2
, 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最
低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 ‘2 )。
c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一
样）成镜像对称关系。
College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU
镜像规则的解释
第六 讲
分子荧光与磷光法
College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU
1. 分子荧光、磷光分析法的基本原理
2.荧光分析仪器
3. 分子荧光定量分析 4.荧光的影响因素，分子荧光的分析应用
College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU
从曲线上找出最大的 em
I
λfl,max
400
500
λ
波长（nm)
471nm
College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU
荧光光谱
固定 ex 激发光波长
荧 光 强 度
I
471nm
400
500
λfl,max
λ
波长（nm)
471nm
College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU
定量关系不同（1）同一种光强度的吸收，（2）另一种光的强度 仪器光路不同（1）直线，（2）一定的角度 荧光法有更优的检测性能
College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU
, 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最
低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 ‘2 )。
c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一
样）成镜像对称关系。
College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU
镜像规则的解释
第六 讲
分子荧光与磷光法
College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU
1. 分子荧光、磷光分析法的基本原理
2.荧光分析仪器
3. 分子荧光定量分析 4.荧光的影响因素，分子荧光的分析应用
College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU
从曲线上找出最大的 em
I
λfl,max
400
500
λ
波长（nm)
471nm
College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU
荧光光谱
固定 ex 激发光波长
荧 光 强 度
I
471nm
400
500
λfl,max
λ
波长（nm)
471nm
College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU
定量关系不同（1）同一种光强度的吸收，（2）另一种光的强度 仪器光路不同（1）直线，（2）一定的角度 荧光法有更优的检测性能
College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
2、荧光、磷光的寿命和量子产率
荧光寿命τf ：荧光分子处于S1激发态的平均寿命
f
1 (kf
K)
k f ：荧光发射过程的速率常数
K ：各种分子的非辐射衰变过程的速率常
数的总和。
典型分子的荧光和磷i 在光 10-8~ 10-10s
光谱分析法讲解
➢ 磷光寿命τp ：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。
f kf (kf K)
➢ 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射 跃迁过程的竞争结果。
K << k f
f 1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 磷光量子产率（p）
p
S
TKp
Kp
Kj
K p ：磷光发射的速率常数
ST ：S1 T1系间窜越的量子产率
Kj ：与磷光发射过程相竞争的从T1态发生 的所有非辐射跃迁过程的速率常数的
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。
内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。
例如： S1 S0
T2 T1
系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。
例如： S1 T1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
T1 S0
内转换
振动弛豫
内转换
总和。
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 荧光（或磷光）量子产率的大小，主要决定于
化合物的结构与性质，同时也与化合物所处环境
因素有关。可用参比法进行测定。
U
S
FU FS
AS AU
U 、FU、AU ：待测物质的荧光量子产率、积分
荧光强度、吸光度
S 、F S 、AS ：参比物质的荧光量子产率、积分 荧光强度、吸光度
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
激发态分子不稳定，它可能通过辐射跃迁和非 辐射跃迁的衰变过程而返回基态。
➢ 辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射，即产生 荧光或磷光。
➢ 非辐射跃迁：振动弛豫（VR） 内转化（ic） 系间窜越（isc）
这些衰变过程导致激发能转化为热能传递给介质。
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
动弛豫而衰变到S1态的最低振动能级。接着，有 以下几种衰变到基态的途径：
① S1 S0 ② S1 S0 ③ S1 T1
T1 S0
T1 S0
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
辐射跃迁 内转化 系间窜越 辐射跃迁 系间窜越
荧光 磷光
➢ 内转化速率很快（k为1011~ 1013s-1 ）， S2以上 的激发单重态的寿命很短（ 10-1~ 10-13s ），因 而除极少数例外，通常在发生辐射跃迁之前便 发生了非辐射跃迁而衰变到S1态。所以所观察 到的荧光寿命通常是来自S1态的最低振动能级 的辐射跃迁。
例如：F强度：苯＜萘＜蒽＜丁省 λem： 苯＜萘＜蒽＜丁省
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
2 、刚性平面构型
➢ 具有刚性平面构型的分子，其振动和转动的 自由度减小，从而增大了发光的效率
例如： 荧光素、曙红 强荧光
酚酞
无荧光
荧光素
曙红
芴有荧光 ，联二苯没有荧光
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
酚酞
3 、取代基的影响
分子荧光和磷光光 谱分析法讲解
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
分子荧光: Fluorescence 分子磷光: Phosphorescence
University of Science and Technology of China
分子荧光和磷光光谱分析法讲解
第一节 基本原理
University of Science and Technology of China
➢ 给电子取代基使荧光增强
-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-OH、-OCH3、-CN、-F
例如： F苯胺 > F苯
其激发态常由环外的羟基或氨基上的n电子激发 转移到环上而产生的，它们的n电子的电子云几 乎与芳环上的π轨道平行，从而共享共轭π电子 结构。
S2
系间跨越
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0
l3
分子荧光和磷光
l 1 光谱分析法讲解l 2
l 2
➢ 假如分子被激发到S2以上的某个电子激发单重 态的不同振动能级上，处于这种激发态的分子，
很快（约10-12~ 10-14s）发生振动弛豫而衰减到该
电子态的最低振动能级，然后又经过内转化及振
① 具有大的共轭双键（π键）体系； ② 具有刚性的平面构型； ③ 环上的取代基是给电子取代基团； ④ 其最低的电子激发单重态为（π，π*）型。
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
1、共轭π键体系
具有共轭双键体系的分子，含有易被激发的 非定域的π电子；
共轭体系越大，非定域的π电子越容易被激 发，且有更强的荧光。
➢ 系间窜越是自旋禁阻的，因而其速率常数小得 多（ 102~ 106s-1 ）。
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 荧光是来自最低激发单重态的辐射跃迁过程所伴 随的发光现象。发光过程的速率常数大，激发态的 寿命短。
➢ 磷光是来自最低激发三重态的辐射跃迁过程所伴 随的发光现象，发光过程的速率常数小，激发态的 寿命相对较长。
分子荧光和磷光光谱分析法讲解
一、荧光、磷光产生的机理
1、荧光、磷光的产生
当物质分子吸收入射光子的能量之后，发生 了价电子从较低的能级到较高能级的跃迁，这时 分子被激发而处于激发态，称为电子激发态分子。 这一电子跃迁过程经历的时间约为10-15 s。
跃迁所涉及的两个能级间的能量差，等于所 吸收光子的能量。紫外、可见光区的光子能量较 高，足以引起价电子发生电子能级间的跃迁。
T1 S0 k p << k f
自旋禁阻的跃迁
p >> f
p 达到毫秒级Leabharlann ➢ 荧光（或磷光）强度的衰变
lnI0lnIt t/
I 0 ：t=0 I t ：t=t
荧光强度 光强度
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 荧光量子产率（f）定义为荧光物质吸光后所发
射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比 值。
2、荧光、磷光的寿命和量子产率
荧光寿命τf ：荧光分子处于S1激发态的平均寿命
f
1 (kf
K)
k f ：荧光发射过程的速率常数
K ：各种分子的非辐射衰变过程的速率常
数的总和。
典型分子的荧光和磷i 在光 10-8~ 10-10s
光谱分析法讲解
➢ 磷光寿命τp ：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。
f kf (kf K)
➢ 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射 跃迁过程的竞争结果。
K << k f
f 1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 磷光量子产率（p）
p
S
TKp
Kp
Kj
K p ：磷光发射的速率常数
ST ：S1 T1系间窜越的量子产率
Kj ：与磷光发射过程相竞争的从T1态发生 的所有非辐射跃迁过程的速率常数的
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。
内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。
例如： S1 S0
T2 T1
系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。
例如： S1 T1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
T1 S0
内转换
振动弛豫
内转换
总和。
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 荧光（或磷光）量子产率的大小，主要决定于
化合物的结构与性质，同时也与化合物所处环境
因素有关。可用参比法进行测定。
U
S
FU FS
AS AU
U 、FU、AU ：待测物质的荧光量子产率、积分
荧光强度、吸光度
S 、F S 、AS ：参比物质的荧光量子产率、积分 荧光强度、吸光度
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
激发态分子不稳定，它可能通过辐射跃迁和非 辐射跃迁的衰变过程而返回基态。
➢ 辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射，即产生 荧光或磷光。
➢ 非辐射跃迁：振动弛豫（VR） 内转化（ic） 系间窜越（isc）
这些衰变过程导致激发能转化为热能传递给介质。
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
动弛豫而衰变到S1态的最低振动能级。接着，有 以下几种衰变到基态的途径：
① S1 S0 ② S1 S0 ③ S1 T1
T1 S0
T1 S0
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
辐射跃迁 内转化 系间窜越 辐射跃迁 系间窜越
荧光 磷光
➢ 内转化速率很快（k为1011~ 1013s-1 ）， S2以上 的激发单重态的寿命很短（ 10-1~ 10-13s ），因 而除极少数例外，通常在发生辐射跃迁之前便 发生了非辐射跃迁而衰变到S1态。所以所观察 到的荧光寿命通常是来自S1态的最低振动能级 的辐射跃迁。
例如：F强度：苯＜萘＜蒽＜丁省 λem： 苯＜萘＜蒽＜丁省
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
2 、刚性平面构型
➢ 具有刚性平面构型的分子，其振动和转动的 自由度减小，从而增大了发光的效率
例如： 荧光素、曙红 强荧光
酚酞
无荧光
荧光素
曙红
芴有荧光 ，联二苯没有荧光
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
酚酞
3 、取代基的影响
分子荧光和磷光光 谱分析法讲解
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
分子荧光: Fluorescence 分子磷光: Phosphorescence
University of Science and Technology of China
分子荧光和磷光光谱分析法讲解
第一节 基本原理
University of Science and Technology of China
➢ 给电子取代基使荧光增强
-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-OH、-OCH3、-CN、-F
例如： F苯胺 > F苯
其激发态常由环外的羟基或氨基上的n电子激发 转移到环上而产生的，它们的n电子的电子云几 乎与芳环上的π轨道平行，从而共享共轭π电子 结构。
S2
系间跨越
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0
l3
分子荧光和磷光
l 1 光谱分析法讲解l 2
l 2
➢ 假如分子被激发到S2以上的某个电子激发单重 态的不同振动能级上，处于这种激发态的分子，
很快（约10-12~ 10-14s）发生振动弛豫而衰减到该
电子态的最低振动能级，然后又经过内转化及振
① 具有大的共轭双键（π键）体系； ② 具有刚性的平面构型； ③ 环上的取代基是给电子取代基团； ④ 其最低的电子激发单重态为（π，π*）型。
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
1、共轭π键体系
具有共轭双键体系的分子，含有易被激发的 非定域的π电子；
共轭体系越大，非定域的π电子越容易被激 发，且有更强的荧光。
➢ 系间窜越是自旋禁阻的，因而其速率常数小得 多（ 102~ 106s-1 ）。
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 荧光是来自最低激发单重态的辐射跃迁过程所伴 随的发光现象。发光过程的速率常数大，激发态的 寿命短。
➢ 磷光是来自最低激发三重态的辐射跃迁过程所伴 随的发光现象，发光过程的速率常数小，激发态的 寿命相对较长。
分子荧光和磷光光谱分析法讲解
一、荧光、磷光产生的机理
1、荧光、磷光的产生
当物质分子吸收入射光子的能量之后，发生 了价电子从较低的能级到较高能级的跃迁，这时 分子被激发而处于激发态，称为电子激发态分子。 这一电子跃迁过程经历的时间约为10-15 s。
跃迁所涉及的两个能级间的能量差，等于所 吸收光子的能量。紫外、可见光区的光子能量较 高，足以引起价电子发生电子能级间的跃迁。
T1 S0 k p << k f
自旋禁阻的跃迁
p >> f
p 达到毫秒级Leabharlann ➢ 荧光（或磷光）强度的衰变
lnI0lnIt t/
I 0 ：t=0 I t ：t=t
荧光强度 光强度
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 荧光量子产率（f）定义为荧光物质吸光后所发
射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比 值。