光电化学竞争法检测生物素

光电化学竞争法检测生物素作者：刘世利等来源：《分析化学》2013年第10期摘要[HTSS]建立了光电化学系统竞争性检测生物素（Biotin）小分子浓度的方法。

采用联吡啶钌[Tris（2，2′bipyridine）ruthenium， Rubpy）]作为标记物，以氧化锡纳米颗粒为电极，草酸盐为电子供体还原标记物。

在470 nm光激发下，联吡啶钌的外层电子吸收能量后由基态变为激发态，注入半导体氧化锡纳米颗粒电极的导带，形成光电流信号；草酸盐还原失去电子的联吡啶钌使其恢复初始状态，从而可以再次作为电子供体受激发产生光电流信号。

在竞争性检测生物素（Biotin）浓度时，亲和素（Avidin）吸附到氧化锡纳米颗粒电极表面作为识别元件，在浓度大于0.5 g/L时能够达到最大的电极表面覆盖率。

1 μmol/L Rubpybiotin与不同浓度Biotin组成的混合溶液与电极表面的Avidin发生亲和反应，光激发后检测光电流大小；当溶液中Biotin的浓度增加时，致使与电极表面Avidin结合的Rubpybiotin量减少，在光照射下光电流信号降低。

这一竞争性光电检测方法检测Biotin时，检出限为8 μg/L。

本方法可进一步扩展，应用于有机化合物的竞争性免疫检测。

1引言小分子普遍存在于人类生命活动以及所处的环境中。

环境中多种持久性有机污染物也是有机小分子化合物，如多环芳香烃、氯代二苯并二恶英、多氯二苯并呋喃以及多氯联苯等。

在诸多常用的检测小分子化合物的分析方法中，基于抗体识别的免疫检测方法在速度、通量和成本方面具有显著的优势。

免疫检测小分子时，通常会采用竞争性检测的方式，即将待检测物标记后与其抗体结合产生可检测的信号；当加入未标记的待检测物时，与标记的待检测物竞争有限的抗体结合位点，导致信号下降[1]。

目前多种标记物和相关的检测方法与仪器已被开发应用，如放射性同位素、荧光染料、酶、氧化还原分子等。

目前量子产率最高的光电化学电池采用纳米TiO2颗粒膜组装在导电玻璃上，并利用表面吸附的钌吡啶化合物使之敏化[2]，Kalyanasundaram等[3]对其它宽带隙半导体电极和敏化剂也进行了研究。

使用敏化剂作为标记分子可以进行生物分子亲和反应的检测，并且光电化学检测方法理论上应该具有很高的灵敏度；因为在这种方法的激发信号（光）和检测信号（电流）不会产生相互干扰[4]。

利用Cd量子点（Quantum Dots）[5]和纳米管[6，7]进行光电化学传感已有报道；Pandey等[8]利用DNA嵌入染料蒽醌作为指示剂光电化学检测溶液中的DNA，该方法中光激发的蒽醌在溶液中被电子供体还原，利用修饰的石墨碳原子电极可以检测氧化还原电位的变化。

利用蒽醌的光电化学性质也可研究固定于金电极上的双链DNA的电荷传输性质，并可以用于疾病的单核苷酸多态性（SNP）分型[9]。

半导体纳米颗粒电极较其它电极在光电化学检测中具有明显优势，可以显著提高检测灵敏度，本研究组在检测溶液中的DNA研究中已经证明[10]。

除利用半导体纳米颗粒电极检测DNA[11，12]外，还可利用纳米颗粒电极非标记检测了多巴胺（Dopamine）[13]和ATP[14]的浓度。

关于光电化学检测生物结合反应已有报道，尤其值得注意的是抗体/抗原的结合反应的光电化学检测[15，16]。

联吡啶钌作为标记物已广泛用于电化学发光检测免疫反应[17，18]，可利用联吡啶钌合吩嗪（Ru（bpy）2dppz， dppz=dipyrido[3，2a：2′，3′c]phenazine）与dsDNA具有高亲和性（K=106-107 L/mol）[19]的特点检测金电极表面固定的双链DNA[20，21]。

Zhang 等[14]采用纳米颗粒电极和Ru（bpy）2dppz 检测了癌细胞中ATP的浓度。

本研究组曾采用染料敏化的光电化学系统定量检测溶液中的DNA[10]，该检测系统包括光电化学标记物Ru（bpy）2dppz，电子供体草酸盐和电极材料氧化锡纳米颗粒。

由于该分析系统具有许多高量子产率光电化学太阳能电池的优点，所以在检测溶液中的DNA时，灵敏度比导体电极、金电极和碳电极有显著改善。

本研究采用光电化学方法竞争性检测Biotin，Rubpybiotin复合物在此竞争性检测中作为光电化学标记分子；当各种浓度的Biotin（待检测物）与1 μmol/L Rubpybiotin混合溶液与电极表面的Avidin反应后，标记分子受激发所产生的光电流会随Biotin浓度的增加而减小。

本方法对Biotin的检出限为8 μg/L。

本研究为采用光电化学方法竞争性检测小分子的浓度提供了参考。

2实验部分2.1仪器与试剂双（联吡啶）4′甲基4羰基吡啶钌N琥珀酰亚胺酯双六氟磷酸酯（Ruthenium bis（2，2′bipyridine）（4methyl4′carboxyl2，2′bi pyridine） NHS ester（RuNHS），美国Fluka公司）；Avidin和Biotin（美国Sigma公司）；Succinimidyl 6（biotinamido）hexanoate （biotinLCNHS，美国Pierce公司）。

WLTNSI090铟锡氧化物镀膜玻璃（涂层（96±4） nm，片电阻（18±2）Ω），深圳伟光股份有限公司）。

2.2实验步骤2.2.1Rubpy标记avidin和biotinRubpy标记Avidin按文献[22]方法进行。

Rubpybiotin（图1）的合成：向溶于二甲基甲酰胺（Dimethylformamide， DMF）的RuNHS中加入10倍过量的乙二胺，冰浴中反应1 h；在减压情况下，去除未反应的乙二胺和DMF；将所得固体溶解在丙酮中，加入乙醚沉淀；沉淀所得固体和biotinLCNHS以摩尔比2∶1溶解在DMF中，室温反应3 h，Sephadex G25柱分离产物。

产物通过NMR， UVVis吸收和循环伏安法表征。

[TS（]图1Rubpybiotin复合物的结构Fig.1Structure of tris（2，2′bipyridine）ruthenium （Rubpy）biotin conjugate[HT5][TS）]2.2.2Biotin和Avidin的结合反应氧化锡电极按文献[22]方法制备。

氧化锡电极吸附Avidin 的方法是以25 μL Avidin蛋白溶液覆盖0.5 cm2 电极表面，静置30 min；以20 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）冲洗后，用1%牛血清白蛋白封闭电极，以减少非特异性结合。

进行Biotin和Avidin之间的结合反应时，将25 μL Biotin或Rubpybiotin混合液覆盖在Avidin吸附的电极上，并在无外力混合情况下室温反应1 h；冲洗后，在电解液中测定光电流。

2.2.3光电流测定光电流测定用CHI800型电化学分析仪，Pt作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极，电极间所加偏压为+0.3 V；激发光源来自蓝色发光二极管（深圳Lamp公司），照明面积为0.2 cm2。

在进行光谱测量时， 500 W的氙灯和光栅用于产生单色可变波长的光，用于激发。

3结果与讨论3.1检测条件的优化本研究以Biotin/Avidin为模式系统，研究光电化学方法检测小分子的可行性。

Biotin是一种水溶性维生素（244 Da）。

Avidin是蛋清中存在的糖蛋白（66 kDa）。

Avidin和Biotin的亲和性非常高，解离常数为1015 mol/L。

Avidinbiotin系统已被广泛用于免疫组化、酶联免疫吸附分析以及分子生物学测定。

本实验将Avidin固定在氧化锡电极表面，使之捕获溶液中的Biotin或Rubiotin，通过测量Ru标记物产生的光电流测量溶液中Biotin的浓度（图2）。

Avidin含有碱性氨基酸如赖氨酸和精氨酸，等电点约为10，易于吸附到带负电荷的电极表面。

实验表明，Avidin对氧化锡电极的吸附性很强，所以采用吸附法在电极上固定Avidin。

将电极在各种浓度的AvidinRu中浸泡2 h，冲洗后，通过测量光电流评估蛋白吸附效果。

由图3可见，当AvidinRu浓度从0增加至1 g/L时，光电流先随溶液中AvidinRu浓度增加而增大；AvidinRu浓度大于0.5 g/L时，光电流达到平台期，证明在这种浓度下蛋白吸附趋于饱和。

表面固定的AvidinRu保持相对稳定，[TS（]图3吸附在氧化锡电极上的AvidinRu产生的稳态光电流与AvidinRu浓度之间的关系，小图：AvidinRu吸附的氧化锡电极浸泡在Ph 7.5，20 mmol/L磷酸盐缓冲液中（a）0 h（b）2 h后的光电流Fig.3Steadystate photocurrent of Rulabeled avidin adsorbed on SnO2 electrode as a function of the protein concentration. Inset： Photocurrent of Rulabeled avidin coated SnO2 electrode after soaking in 20 mmol/L phosphate buffer， pH 7.5 for （a） 0 h （b） 2 h光电流测定采用pH 5.5，10 mmol/L草酸钠/100 mmol/L磷酸钠溶液，以470 nm光激发。

为了平衡光电信号和灵敏度的要求，标记物剂浓度选择1 μmol/L用于竞争性检测。

对照实验采用吸附牛血清白蛋白（BSA）的电极与1 μmol/L Rubpybiotin反应。

它的光电流仅为吸附Avidin电极的1/3，并和未与Rubpybiotin的BSA电极产生的光电流相同，对比证明吸附Avidin电极产生的光电流响应是由于Avidin和Botin之间的特异性相互作用。

电极吸附Avidin 反应的Rubpybiotin受激发产生光电流时，光电流随激发光波长的变化情况见图5。

光电流的谱形类似自由标记分子（插图）的吸收光谱，在470 nm处达到峰值。

Avidin/氧化锡电极本身并未表现出波长依存性，证明光激发所产生的光电流是由金属Ru络合物引起的。

3.2检测溶液中biotin的浓度确定了标记物Rubpybiotin的浓度后，在吸附了avidin的氧化锡电极上竞争性检测Biotin 浓度。

检测时，各种浓度的Biotin与1 μmol/L Rubpybiotin混合，并与吸附了Avidin的本研究组曾采用相同的光电化学检测系统定量检测了溶液中DNA的浓度[10]。

在本实验中。

利用标记物竞争性检测Biotin浓度，检出为8 μg/L，可与一些酶标记的电化学免疫测定方法相媲美。