总RNA 的提取电泳检测及浓度和纯度的测定

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总RNA 的提取

可以用蛋白酶K代替DEPC

配制 RNA 裂解试剂时，直接用灭菌的双蒸水配制，最后，加入
蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀，室温放置 15 分钟后即可。

枪头及离心管去除 RNase：先将枪头及离心管清洗干净后，移入
预先混好的含 1ug/ml 蛋白酶 K 的双蒸水，彻底浸入。室温放置 30 分钟后，连水一起高压灭菌。弃水后，烘干即可。
心管充分混匀），室温（15~30℃）放置10 min，12
000 g 4℃离心10 min。
6、小心弃去上清，沉淀中加入1 ml 75%的乙醇（DEPC水
配制）（沿管壁缓慢加入，切勿触及沉淀，轻轻上下颠
倒洗涤），混匀，7 500 g 4℃离心5 min。
7、弃上清，保留沉淀（尽量除净乙醇）。沉淀自然

注意： RNA不能干燥过分，否则极难溶解，可65℃处理10分钟（慎用）。
2、A260/A280<1.65
A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高。
B．样品匀浆时加的试剂量太少。 C．匀浆后样品未在室温放置5分钟。 D．水相中混有有机相或相分离后，吸取上清液时，不小心接触蛋白造成污染。 E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。

用于RNA的电泳槽洗净后，用3%的H2O2溶液浸泡2 hr以上，然后再用0.1%的DEPC水溶液处理；（如果只是检测RNA的浓度及纯度，看看质量的话用普通电泳槽也可以，但是最好是要泡电泳槽换缓冲液；如果要做 northern，就必须要这样处理，中间过程不能用手碰到电泳槽内部。电泳时，建议用保鲜膜覆盖，下次使用直接用H2O2泡再冲洗即可。低电压？）所有操作均应戴一次性手套和口罩，并勤换手套；应辟有专门的房间用于RNA的操作。尽量使用单独的一套移液枪专门用于RNA操作，用过后用酒精擦拭。

总RNA的提取和检测实验报告

总RNA的提取和检测实验报告实验二总RNA的提取和检测实验目的1.掌握从动物组织细胞中提取总RNA的方法；2.熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法；3.掌握RNA琼脂糖凝胶电泳方法并分析总RNA的电泳图谱；实验原理概述1. 10-5 μg RNA/细胞含有rRNA 80-85%：28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5%2. mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。

4.目前常用的是Trizol法。

Trizol的主要成分是一种新型总RNA 抽提试剂，主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。

异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。

2.酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA 酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。

3.溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。

4.取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA。

(三)总RNA的纯度检测原理：不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。

RNA在260nm紫外光波长处有最大的吸收峰。

因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/mL 的单链RNA。

用PH= 的TE稀释RNA样品n倍并以TE为空白对照，根据此时读出的OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度: RNA (mg/mL) = 40×OD 260 读数×稀释倍数(n)/1000实验步骤样品处理与Trizol用量1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol 试剂对组织进行裂解；2.悬浮细胞先离心沉淀，每5-10×106个细胞加1mL Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。

植物总RNA的提取与电泳

RNA的检测： RNA的检测：的检测
RNA的检测主要用琼脂糖凝胶电泳，分为 RNA 的检测主要用琼脂糖凝胶电泳，的检测主要用琼脂糖凝胶电泳非变性电泳和变性电泳。非变性电泳和变性电泳。一般变性电泳用的最多是甲醛变性电泳（如 Northern 实验过程中） blot 实验过程中）。
3. 实验材料与试剂
材料：水稻）材料：新鲜植物组织（水稻）试剂：Qiagen RNeasy植物试剂盒，植物试剂盒，试剂：植物试剂盒甲醛，甲醛，琼脂糖电泳系统，凝胶成象系统等。统等。
4. 实验方法和步骤
每一步均要求无RNase污染） RNase污染实验步骤（每一步均要求无RNase污染）称取新鲜材料100 mg，液氮速冻； ① 称取新鲜材料100 mg，液氮速冻； ② 在预冷的研钵中并在液氮中将材料研磨成细粉末，转移到2ml或研磨成细粉末，转移到2ml或1.5ml 离心管中；离心管中；待液氮挥发（但不能解冻） ③ 待液氮挥发（但不能解冻）后，加入 μl提取缓冲液RLT，提取缓冲液RLT 450 μl提取缓冲液RLT，混匀后在 56℃下温育1 min； 56℃下温育1～3min；
将裂解液加到离心柱（淡紫色） ④ 将裂解液加到离心柱（淡紫色）上下接一个2ml收集管，最大转速离心收集管，下接一个收集管 2min。裂解液通过柱子时被均质化。小心吸取上清液，小心吸取上清液，转移到另一新离心管；心管；加入0.5倍体积倍体积（ ⑤ 加入倍体积（225 µl）96～100% ）～乙醇，混合均匀。加入乙醇后，乙醇，混合均匀。加入乙醇后，可能会出现沉淀，无影响；会出现沉淀，无影响；
步骤：步骤：
1. 凝胶制备（1.2％）：用1ⅹ凝胶缓冲液配制1.2 凝胶制备（1.2％）：用1ⅹ凝胶缓冲液配制1.2 ％）：凝胶缓冲液配制的凝胶，至少使其凝固30分钟后进行上样； 30分钟后进行上样％的凝胶，至少使其凝固30分钟后进行上样；样品制备：在离心管中， RNA样品与10ⅹ上样样品与10ⅹ 2. 样品制备：在离心管中，将RNA样品与10ⅹ上样缓冲液以9:1比例混匀，迅速在冰上冷浴5分钟， 9:1比例混匀缓冲液以9:1比例混匀，迅速在冰上冷浴5分钟，瞬时离心数秒。RNA上样量为 30µ 上样量为2 瞬时离心数秒。RNA上样量为2-30µg，本次实验 10µ 为10µg；上样前凝胶须预电泳5min 5min， 3. 上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入加样孔， 5V/cm的电压电泳1h～1.5h；的电压电泳1h 样孔，以5V/cm的电压电泳1h～1.5h；待溴酚蓝迁移至凝胶长度的4/5处结束电泳。 4/5处结束电泳 4. 待溴酚蓝迁移至凝胶长度的4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液中染色约30min 30min；凝胶置于溴化乙锭溶液中染色约30min；在紫外灯下观察结果(如果用于Northern 5. 在紫外灯下观察结果(如果用于Northern blot , 在凝胶转膜前应做好移动距离的标记) 在凝胶转膜前应做好移动距离的标记)。

如何测量RNA的纯度和含量

问题：假如你有一份RNA样品，体积为10uL需要测其样品的浓度和纯度，应该如何做？请写出测定的原理和方法。

【原理】使用光密度测定法测量其浓度，RNA在260nm处有一很高的吸收峰，利用这个原理我们测其OD260,再推算出其浓度。

使用DNA/RNA浓度测定仪，测定样品A260和A280值。

根据A260/ A280比值，估测RNA质量。

一般A260/ A280比值在1.8-2.0之间，可以满足实验要求。

在100u I RNA原液中取1 U稀释至250" （DEPC处理的水），测定样品的A260和A280的值，按下列公式计算其浓度：RNA原液浓度二A260稀释倍数X 40（ n g/ Q【仪器】分光光度计（紫外可见光两用）。

【试剂】水、RNA溶液【方法步骤】测定RNA浓度按以下步骤进行操作：⑴在10 □的RNA原液取1 ",放在0.5mIEP管中，加入249" dd H2O,用移液枪反复混匀。

⑵用dd H2O为空白对照，调节A260零点。

⑶倒掉比色杯中的水，加入稀释并混合均匀的RNA样液，测定A260值。

倒掉比色杯中的RNA样液，用dd H20冲洗比色杯，再调节A280零点。

⑷倒掉比色杯中的水，加入稀释并混合均匀的RNA样液，测定A280值。

计算A260/A280比值，比值＞1.8,满足实验要求。

⑸RNA原液浓度=A260稀释倍数x 4(n g/山测定RNA纯度按以下步骤进行操作：(1) 取4ulRNA样品加水到1ml。

(2) 用1ml水做空白。

(3 )把样品杯放在分光光度计比色槽上。

⑷每卩中RNA浓度(ug)将是0D值的10倍，例如稀释后样品在260nm处OD 值为0.2,则原RNA样品浓度为2ug/「l(5) 再测一次280nm处0D值，计算二者的比率，若比率接近2,则说明样品中核酸比较纯。

若比率小于1.6,则说明蛋白或其它吸收此波长的杂质在其中，再用酚/氯仿抽提继以乙醇沉淀以除去杂质。

总RNA提取及其浓度、完整性测定

5.1.1.5.1总RNA提取及其浓度、完整性测定用Real-time RT-PCR方法确定鸡各肠段NaPi-IIb mRNA表达量。

用购自天根生化科技（北京）有限公司（Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.）的Trizol试剂提取十二指肠、空肠和回肠总RNA。

用核酸蛋白检测仪在260nm波长处测定总RNA浓度。

用琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性。

总RNA提取步骤为：（1）预处理将肠粘膜样品从超低温冰箱取出（戴医用手套），迅速打开离心管盖子（否则会在液氮中取出时突然受热膨胀而爆炸），将开盖离心管放入纱布袋，纱布袋置于液氮罐中。

（2）取样至超净工作台后，用液氮预冷研钵（研钵之前经酒精燃烧灭菌处理），并使研钵中留有液氮。

用镊子夹出纱布袋中离心管，迅速置于研钵中，用研杵砸破离心管壁，镊子夹取肠粘膜样品（约50-100mg），迅速放入组织研磨器中（研磨器置于冰上）。

（3）研磨先向玻璃研磨器中加入0.2mL Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mL离心管中；然后向玻璃研磨器内加入0.8mL Trizol溶液清洗，再全部倒入1.5mL离心管中。

颠倒混匀10下，冰上静置5min。

（4）分相向离心管中加0.2mL氯仿。

盖紧样品管盖，用力摇晃试管15s，使其充分混匀，冰上静置5min。

4℃条件下，12000g/min离心15min。

（5）沉淀将上层水相转入新1.5mL EP管中（约400-500uL），加入0.5mL 异丙醇，混匀后冰上放置15min，4℃12000g/min离心10min。

此时离心管底部出现白色胶状沉淀，即RNA。

（6）洗涤小心倒掉上清液，留取沉淀。

加1mL 75%预冷乙醇，用枪头把溶液沿离心管底部对胶状沉淀上下吹打几次。

4℃条件下，7500g/min离心5min。

（7）再溶解小心倒掉上清液，离心5s。

用枪头将离心管内残留乙醇吸出。

放置超净工作台，风机吹干约1-2min。

总rna提取实验报告

总rna提取实验报告总RNA提取实验报告一、引言RNA是一种重要的核酸分子，它在细胞中起着传递和转录遗传信息的重要作用。

总RNA提取是分子生物学研究中常用的实验技术，它能够从细胞中提取出所有的RNA，包括mRNA、tRNA和rRNA等。

本实验旨在通过总RNA提取技术，获取细胞中的RNA样品，为后续的RNA分析提供基础。

二、材料与方法1. 实验材料：- 细胞样品：本实验使用细胞系A作为研究对象。

- 细胞裂解缓冲液：含有细胞裂解酶和蛋白酶抑制剂等。

- 乙酰酸酚/氯仿溶液：用于提取总RNA。

- 无水乙醇：用于沉淀RNA。

- TE缓冲液：用于溶解RNA沉淀物。

- RNase-free水：用于制备实验液。

2. 实验步骤：（1）细胞采集与裂解：将培养好的细胞收集到离心管中，加入适量的细胞裂解缓冲液，轻轻摇晃使细胞均匀裂解。

（2）总RNA提取：将细胞裂解液与乙酸酚/氯仿溶液按比例混合，离心分离上清液和有机相，收集上清液。

（3）沉淀RNA：向上清液中加入等体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀，沉淀RNA。

（4）洗涤：用70%乙醇洗涤RNA沉淀物，去除杂质。

（5）溶解：用RNase-free水溶解RNA沉淀物，得到总RNA样品。

三、结果与讨论通过上述实验步骤，成功地从细胞系A中提取到了总RNA样品。

提取后的总RNA样品呈现出明亮的透明溶液，没有明显的沉淀或杂质。

为了验证提取的总RNA质量和纯度，我们使用了紫外吸收光谱法进行测定。

根据测定结果，我们发现总RNA样品的吸光度比例A260/A280为1.8，符合理想的RNA纯度范围（1.8-2.0）。

这表明我们所提取的总RNA样品中没有明显的蛋白质、核酸污染。

同时，我们还进行了琼脂糖凝胶电泳分析，观察到总RNA 样品在琼脂糖凝胶上呈现出清晰的17S和28S两个带状条带，证明我们提取的总RNA完整且无降解。

总RNA提取实验是RNA研究的基础，成功地提取到高质量的总RNA样品对后续的实验具有重要意义。

总RNA提取、浓度的测定

总RNA提取、浓度的测定一、原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。

RNA质量的高低常常影响cDNA库、RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

Trizol溶液是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。

其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。

Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用。

二、实验试剂及仪器氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、无水乙醇、冷PBS、DEPC水、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、吸管、冷冻离心机4℃预冷，眼科镊，眼科剪（组织用）三、实验步骤组织：1、将器械，组织管，匀浆器钻头提前用DEPC水浸泡过夜。

灭酶EP管编号。

2、将新鲜组织剪切成黄豆大小的块，或冻存于液氮的样品（在离体后应迅速冷冻在液氮中,也可加入保存）置入组织管内，加入500μL Trizol，用匀浆器充分研碎组织。

使用后的匀浆器钻头分别置于2管75%乙醇（DEPC水配制），2管DEPC水中空转后方可进入下一组织浆中。

3、吸出研碎的粉红色匀浆至EP管内，室温静置10-15min。

4、加入200μL氯仿，使用震荡器震荡为乳糜样，12000rpm离心15min。

5、EP管内可见分为水样层，中间层和有机层，吸取上层水样层至新EP管内。

6、加入500μL异丙醇，上下混匀，室温静置10min，12000rpm离心15min。

7、小心吸取上清，留下沉淀，加入75%乙醇（DEPC水配制）500μL，弹起沉淀，12000rpm离心5min，再次吸去上清，加入75%乙醇（DEPC水配制）500μL，12000rpm 离心5min，吸去上清。

滤纸吸干管口余液。

必要时再次离心2-3min，10μL枪头吸取，打开EP管盖晾干。

8、黄豆大小组织提取的RNA可加DEPC水50μL溶解后置于冰上，亦可根据组织块大小加入不同体积DEPC水溶解。

总RNA提取和电泳实验

总RNA的提取和电泳一、实验目的和原理完整的RNA提取和纯化是进行RNA方面的研究工作的前提（Northern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR等）。

在RNA制备过程中，必须注意控制RNA酶的活性，0.1%DEPC或者RNase Away TM试剂可以有效去除RNA酶，在实验过程中的实验器具和实验用水均需经过DEPC水处理。

二、试剂1)TRIzol试剂2)氯仿3)0.1% DEPC水：与5L蒸馏水中加入5 ml DEPC,充分混匀，置37℃过夜，然后高温高压灭菌，分装，4℃保存备用。

4)75%乙醇：需用DEPC处理水配制，75 ml 100%乙醇中加入DEPC水置总体积为100 ml。

5)PBS缓冲液:称量试剂NaCl 8g，KCl 0.2g ，Na2HPO4 1.42 g，KH2PO4 0.27g 至于1L烧杯中，向烧杯中加入800mL的去离子水，充分混匀，滴加HCl将PH调节至7.4，然后定容为1L，高温高压灭菌后，室温保存。

三、实验步骤（Trizol法提取总RNA）1.样品处理：1)单层贴壁细胞直接向直径为3.5cm的培养板中加入1mL TRIzol溶解细胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。

取1mL裂解物移至一个1.5mL离心管中，室温放置5min。

或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀，加入相应量的TRIzol。

2)动物组织对动物组织进行匀浆处理，在装有新鲜动物肝脏组织匀浆中加入相应体积的预冷Trizol，每50-100mg样品加1mlTrizol，充分混匀。

静置10min，12000rpm，4°C 离心15min。

2.加入1/5体积（200μL）的氯仿，剧烈颠倒混匀15-30s，勿剧烈涡旋震荡，室温静置2-3min可见分层，如此重复几次使液体充分分层。

12000 ×g，4℃离心15 min。

离心后，溶液分为有机相和水相，中间有一层蛋白质层，RNA 在上层水相层。

总rna的提取方法

总rna的提取方法
总RNA（total RNA）是指从细胞或组织中提取出来的包含所有类型的RNA的混合物。

下面是一种常见的总RNA提取方法：
1. 细胞/组织样品准备：收集足够数量的细胞或组织样品，并将其保存在适当的缓冲液中（如RIPA缓冲液）。

2. 细胞破碎：将细胞样品经过离心等步骤，去除缓冲液，然后加入细胞破裂缓冲液（常见的破裂缓冲液成分包括TRIzol、RLT缓冲液等），使用搅拌器或超声波进行细胞破碎。

3. RNA提取：加入氯仿或类似的有机物，进行混匀，离心，使得混合液分为上清液（含有DNA和RNA）和有机相（含有脂质和蛋白质）。

4. 上清液沉淀：将上清液转移至新的管中，加入同等体积的异丙醇，轻轻混匀，离心15分钟以使RNA沉淀。

5. RNA洗涤：轻轻倒掉上清液，用70%乙醇洗涤RNA沉淀，再次离心。

6. RNA溶解：将RNA沉淀干燥，加入适当的RNase-free水溶解RNA。

7. RNA质量检测：使用比色法或荧光法测定RNA浓度和纯度（如比例计算
A260/A280）。

这些步骤是总RNA提取的一般流程，具体的操作步骤可能会因实验目的、样品类型和提取试剂盒等因素而有所不同。

同时，为了确保RNA的完整性和减少污染，实验操作中还应遵循严格的无RNase和无DNA污染的条件。

13 【终版】RNA的提取和电泳检测

1 实验背景目的基因的获得RT-PCRNorthern 杂交cDNA 克隆差异显示为什么提取RNA ？第一讲总RNA 的提取和电泳检测1 实验背景蛋白质, DNA, RNA, 糖类, 脂质, 多肽, 小分子物质等目标产物分离纯化杂质生物大分子提取的依据1 实验背景生物分子间差异电荷溶解度生物学性质亲和性物理化学性质分子量形态1 实验背景生物大分子提取流程原料的选择、前处理粗提纯化浓缩和保存样品分析与检测生物大分子提取的一般原则1 实验背景完整性纯度效率一级结构高级结构产量经济一般原则2 实验设计mRNA的特性单链线性分子核蛋白体核糖核酸，不稳定性，易被降解（2,3位有一OH，反应活性高）均一性: rRNA（28S、18S、5.8S、5S，占80%）mRNA（1%～5%）tRNA和小分子RNA （10%～15%)容易被RNA酶（RNase）破坏2 实验设计提取RNA的来源细菌酵母血液动植物组织（小鼠脾细胞）培养细胞同一来源的不同组织（如植物幼嫩叶片、成熟根和茎等）如何从脾细胞中提取总RNA？2 实验设计RNA 提取的基本过程浓缩检测脾细胞获得、培养12345纯化逆转录保存2 实验设计RNA 酶哪里有？外源：环境、器皿、耗材、试剂内源：组织本身含有的RNA酶RNA酶有链内二硫键，所以抗长时间煮沸和温和变性剂，变性后迅速重新折叠；RNA酶不需要二价阳离子激活，所以EDTA没用最好的办法是避免污染2 实验设计如何避免RNA酶的污染？试剂专用，最好使用新开封的，分小份保存，用后丢弃器皿、耗材、取液器专用勤换手套尽量简化操作步骤、缩短提取过程，以减少各种有害因素对RNA的破坏，把杂质的污染等降到最低程度等在操作中避免讲话使用RNA操作专用台2 实验设计如何破坏RNA酶的活性？变性剂：异硫氰酸胍、苯酚（蛋白质变性）、氯仿（除脂）等异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶变性剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。

总 RNA 的电泳检测

总RNA 的电泳检测，原来我使用Lambda DNA/EcoR I （或者Hind III）酶切Marker，现在基本上不再用Marker 了。

指示剂一定是溴酚蓝加二甲苯氰，胶浓度1-1.2%。

加样后，开始电泳(电压的选择的唯一依据是，我后面的时间安排。

)。

溴酚蓝出孔2 -3cm 后终止电泳，紫外观察。

首先能吸引我的一定是非常亮的位置(是否上样过量)，然后观察溴酚蓝到二甲苯氰之间的条带情况(降解情况)，再就是加样孔(杂质残留情况)，最后是23kb 处是否有条带(基因组DNA 残留情况)。

如果同时抽提的样品是多个，而且类似，在具体分析某一个问题样品前，要先综合一下该批次抽提的总的成败。

如果全部有某现象，可能与试剂有关，也可能与样品有关，还可能与操作有关；如果只有部分有该现象，更可能与操作有关，少部分与样品有关(先做的和后做的可能也有区别)。

只有在宏观上有了一个概念，微观分析才有价值，才准确。

微观分析重点要看如下几个位置：1 溴酚蓝偏下一点点。

这个位置提供的是小片段rRNA (5S 等)的信息及降解的辅助指标。

有可能有，也可能没有。

没有不是问题，因为柱子抽提方法及TRIzol 的高盐沉淀方法，都会去除大部分小的RNA 片段。

问题一：特别亮，宽度甚至超过了加样孔的宽度。

特别亮首先提示上样量过大，而过大的上样量是很容易掩盖一些信息的，导致判读错误。

不管能否看见大片段RNA，也不管带型如何，碰到小片段非常亮的情况，最好大大降低上样量重新跑一次，再判读。

2 指示剂溴酚蓝到二甲苯氰之间或者上面一点点。

这个位置提供的是大片段的rRNA (28S/18S 等)完整性的信息。

条带清晰弥散轻微，表示完整性好；否则表示完整性差。

问题一：比例达不到2:1。

条带亮度比例，没有必要太放在心上，因为比例不是非变性电泳的结论；同时，有些物种本身就不具备这样的比例(从DXY 上战友处首次学到)。

关键是条带是否清晰，弥散少。

问题二：有多条带。

总RNA提取实验原理

总RNA提取实验原理、步骤和问题解答Trizol 试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。

它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离, 加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

无论是人、动物、植物还是细菌组织，各种样品最大使用量( 1ml Trizol )，动物组织( 50mg) ，植物组织(100 mg) ，丝状真菌( 100mg) ，动物细胞(5 ×106～1×107) ，酵母(1 ×107) 。

TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。

例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb 和15 kb 之间不连续的高分子量条带， ( mRNA和hnRNA成分) 两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S) 和~2 kb (18S) ，低分子量RNA介于0.1 和0.3 kb 之间(tRNA, 5S) 。

当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8 。

[ 实验用品]【实验耗材】1、移液枪：1ml、200μl 、20μl 、10μl 、2μl 。

酒精擦拭，头部重点，紫外线照射。

2、吸头：1ml、200μl 、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml 吸头的一个，放置20μl 吸头的一个5、EP管：1.5ml 、0.2ml 、100μl6、试剂瓶：2个60ml 的棕色广口试剂瓶。

青霉素小瓶(分装无水乙醇，高压的DEPC水，－20°C保存)。

7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml 、20μl10、盐水瓶：250ml、500ml 各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2 卷16、三角烧瓶：带盖，稍大(融琼脂糖)【实验仪器】天平、振荡器、高速离心机、0.5 ～10ul 、20～200ul 、100～1000ul 加样器。

实验室总RNA的提取

Ⅰ. 实验室总RNA的提取方案准备工作：DEPC水（DEPC:ddH2O = 1:10000）浸泡所要使用的枪头和EP管（1.5mL和0.2mL）过夜，然后经高压灭菌后回收灭过菌的DEPC水［1］以制备1×TAE缓冲液；同时预留部分未浸泡过枪头和EP管且稀释过的DEPC水［2］，同样灭菌后于-20℃保存以备溶解RNA。

1. 取0.1g左右特殊组织样品（动植物组织或培养细胞）放入加有1mL的RNAiso Plus （TaKaRa，Janpan）的EP管，待所取样本全部完成后再进行匀浆，整个过程必须在冰上操作，同时所取样本必须是活着的，以免RNA降解。

2. 将1中组织倒入5mL组织匀浆器（使用前于180℃高温灭菌3-4h方可使用）中，同时加入0.6-1.0mL的RNAiso Plus和0.4-0.6 mL的DEPC水，然后在冰上匀浆至无颗粒或明显组织块。

3. 将上述匀浆液装入新的1.5mL EP管中（一般可装两管），冰上静止5min左右，然后≥12000rpm，4℃离心5min。

4. 取上清液于新的1.5mL EP管中，每管取0.5mL即可（由此可知每个组织共收集1.0mL 上清液），然后加入1/5 RNAiso Plus体积的氯仿，即0.4 mL，加入氯仿后需立即用手剧烈振荡15s以混匀。

5. 充分混匀后（无分相现象），≥12000rpm，4℃离心15min，即会分层：上层清液，中层为白色蛋白质，下层为带鲜红色的有机相。

6. 取0.6mL上清液于新的1.5mL EP管中，并加入等体积的异丙醇，然后充分混匀，冰上静止10min，≥12000rpm，4℃离心10min。

7. 弃上清液，此时可见管底有白色沉淀，切勿将其倾倒，而后沿壁缓慢加入1.0mL经冷处理过75%乙醇（事先稀释好后放于冰上或者4℃冰箱中）清洗沉淀，≥12000rpm，4℃离心5min。

8. 小心弃去乙醇，尽量除尽乙醇，然后室温干燥5min左右，切莫离心或者加热；加入20-50μL 的Rnase-free water（即DEPC水，上标为［2］）溶解，待完全溶解后-80℃保存。

实验四 RNA的提取及其纯度检测

实验四RNA的提取及其纯度检测实验目的：了解Trizol提取总RNA的原理，掌握高质量完整总RNA提取的技术以及电泳变性胶电泳检测和浓度及纯度鉴定方法。

实验原理Trizol是一种酚与异硫氰胍的混合物，非常容易把组织和细胞中的总RNA提取出来。

在加入氯仿离心后，RNA保留在水相中，与DNA和蛋白质分离开来（保留在有机相中）。

吸取水相，加入异丙醇成淀RNA，从而得到完整纯度高的总RNA。

实验内容材料小鼠新鲜肝试剂总RNA提取纯化试剂：Trizol(Invitrogen)；DEPC(Amersham)，无水乙醇，已丙醇；电泳试剂：TAE，上样缓冲液（50%甘油，10 mM EDTA，0.25% 溴酚蓝，0.25%二甲苯青），琼脂糖。

操作步骤总RNA的提取1小鼠肝组织的匀浆裂解断颈处死小鼠，立即解剖取出肝脏，取50-100mg到玻璃匀浆器中，假如1mlTrizol反复匀浆膜碎组织，使细胞完全裂解。

按1 ml Trizol加入0.2 ml氯仿，震荡15秒，室温放置3分钟，12000×g，4℃离心15分钟。

2 RNA的沉淀将离心的上清转移到新的离心管中，按1 ml Trizol加入0.5ml异丙醇，震荡15秒，室温放置10分钟，12000×g，4℃离心10分钟。

3 RNA的洗涤与溶解吸掉上清，加入1 ml 75% 乙醇洗涤沉淀，4℃，7500×g离心5分钟。

吸掉上清，空气干燥RNA沉淀10分钟，加入适量的DEPC处理水（50μl）溶解RNA，立即电泳和紫外浓度和纯度鉴定，剩余-70℃保存备用。

结果在凝胶上可以看到一般可以看到三条带，其中从上样孔开始对应的带的分别是28S,18S和5S，其中18S和28S的条带明显清晰，而5S的带比较弱，28S的带的亮度是18S带亮度的2背左右，说明RNA保持完整。

紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度总RNA用10mM的Tris-HCl(pH8.0)稀释，利用紫外分光光度计测定A260和A280值，根据1OD=40ug定量,并计算A260/A280比值，每一样品重复3次。

2.总RNA的提取和电泳

实验二、总RNA的提取和电泳一、总RNA的提取（Tripure法）（一）试剂和仪器：组织匀浆器，离心管(DEPC处理)Tripure液（异硫氰酸胍，水饱和酚），氯仿，异丙醇，75% 冰冷乙醇（用DEPC处理过的水配制），无RNase水， DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液：按1∶1000体积比将DEPC加入到灭菌双蒸水中，室温放置过夜，然后高压消毒。

（二）样品准备：1．悬浮培养细胞: 300×g, 4℃离心收集1×10 8个细胞;用25 ml预冷的1×PBS漂洗细胞,离心收集;去上清,加1ml Tripure液,裂解。

2．贴壁培养细胞：计算好1×108个细胞所需培养瓶数后，用胰酶消化，离心收集细胞，细胞裂解同上。

3．组织：将50-100 mg新鲜或液氮冰冻组织置于匀浆器中，加入1ml Tripure液，匀浆。

（三）抽提方法：1．取500μl组织匀浆液移至一个1.5ml 离心管中，室温放置5分钟。

2．加入100μl氯仿，颠倒混匀15秒钟，室温放置2-3分钟。

3．4℃，12000g离心15分钟。

4．小心吸取上层水相至一个新的1.5ml 离心管中。

注意不要吸出中间层，该层富含蛋白质。

5．加250μl的异丙醇与样品颠倒混匀，置室温10分钟沉淀RNA。

6．4℃，12000g，离心10分钟沉淀RNA。

7．弃上清，加75%预冷乙醇500μl，漂洗沉淀。

10 7500g，离心5分钟。

弃上清。

11 室温干燥5分钟。

不宜完全干燥，否则沉淀难以溶解。

12 将RNA溶于20μl无RNase水中。

用紫外分光光度计分别测定样品在260nm和280nm的吸光度值估算RNA的收率和纯度，琼脂糖电泳鉴定RNA的质量，-70℃保存备用。

对于长期保存，RNA应重新补充NaAc（pH5.0）至0.25mol/L，再加入2.5倍体积乙醇， -70℃保存。

注意事项：1．所有玻璃器皿洗干净后，应在180℃至少干烤3h以上；所有塑料器皿均应用DEPC处理后，高压灭菌；操作时应勤换手套，禁止讲话。

动物组织细胞总RNA的提取实验原理及步骤

实验十一动物组织细胞总RNA的提取一、实验原理RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。

对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。

获得高纯度和完整的RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。

由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。

再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。

在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase 活性，保护RNA分子不被降解。

因此提取必须在无RNase的环境中进行。

可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。

提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性。

并有助于除去非核酸成分。

本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总RNA并通过电泳进行鉴定。

二、仪器和试剂1.仪器：超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1% DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。

2.试剂：(1)细胞裂解液：异硫氰酸胍 4mol/L柠檬酸钠（pH7.0） 25mmol/L十二烷基肌氨酸钠 0.5%β-巯基乙醇 0.1mol/L称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。

然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存备用。

(2)10×凝胶缓冲液：吗啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0） 200mmol/LNaAc 100mmol/LEDTA(pH 8.0) 10mmol/L过滤除菌后避光保存。

总RNA的提取和检测实验报告

总RNA的提取和检测实验报告
总RNA提取是指从生物体中提取总RNA，以用于转录组学和其他实验。

目前，细胞总RNA提取广泛应用于各个研究领域，其优点是可以为高通量测序提供充足的底物，进而研
究蛋白质翻译等生物学活动。

本文介绍了两种常用于细胞总RNA提取和检测的实验方法：Trizol法和RNeasy法。

第一种方法是Trizol法。

此法主要包括以下几步：（1）细胞或组织悬液中添加Trizol；（2）在室温下进行总RNA的提取；（3）破碎细胞或组织，使总RNA和DNA完全
溶解；（4）将破碎细胞或组织悬液中的其它杂质过滤；（5）提取、稀释总RNA；（6）使用RNA安全染料（如sybr green）在实验室波长循环仪上检测细胞中的总RNA。

优点：（1）可提取多种物种的总RNA；（2）操作简便，快速；（3）效率高，提取效率接近100%。

缺点：（1）部分有机溶剂可影响细胞总RNA检测结果；（2）部分RNA容易损坏。

本实验验证了Trizol及RNeasy法在细胞总RNA纯化中的有效性。

实验结果表明两者
都能有效提取和检测细胞中的总RNA，但RNeasy法操作步骤较复杂，耗时较长和成本较高，因此在时间和费用有限的情况下，Trizol方法更适合用于细胞总RNA提取和检测。

总而言之，上述两种方法都可以有效提取和检测细胞总RNA，但Trizol方法更为简单有效，实施成本较低，更能满足实验需求。

总RNA的提取及纯化

总RNA的提取及纯化(用于小规模提取RNA)提取总RNA (用Invitrogen 的TRIZOL提取液)：1.收集100-200mg组织, 用液氮将组织材料充分研磨成粉末。

2.待液氮挥发干, 立即加入TRIZOL提取液, 每100-200mg 组织中加入1ml的TRIZOL提取液，涡旋使样品充分裂解，室温放置5分钟。

3.加入0.2ml 氯仿 (chloroform) 剧烈振荡混匀15秒钟, 室温放置10分钟。

4.4℃，12000rpm离心10min，转移上清到新的2ml的离心管, 加入0.5ml (或0.5×开始体积)的RNase-free水, 再加入1ml 的异丙醇 (1:1体积)，充分混匀, 室温放置10分钟沉淀。

5.4℃，12000rpm离心10min，去除上清1，沉淀中加入1ml 75%的乙醇洗涤RNA沉淀，4℃，8000rpm离心15min。

6.去上清，小心不要搅动沉淀，RNA空气中晾干约10-15分钟2，加入100 l体积的RNase-free水充分溶解3. (可放于-80ºC长期保存) 。

7.用紫外分光光度计4，5及1%Agrose 电泳胶检测RNA浓度及质量。

（通常产量是1g叶组织可以提取出500μg RNA）纯化总RNA (用Qiagen公司的Rneasy Mini Kit, Cat#74104):8.取RNA 80-90µg RNA，加RNase-free的水将体积调整到100μL9.加入350μL的RLT工作液, 涡旋混匀，加250μL无水乙醇a)，用Tip头充分混匀。

10.将混合的700μL溶液直接加入QIAshredder spin column（粉色的柱子)，室温静放1分钟，2000 rpm离心5分钟。

11.倒掉收集管中的流出液, 在柱中加入500μL RPE Buffer，10000rpm离心1分钟。

12.倒掉收集管中的流出液, 再加入500μL RPE Buffer到柱中, 10000rpm离心1min。

总RNA 的提取电泳检测及浓度和纯度的测定