抗体药物偶联物的制备研究 PPT

2.4.4、反相色谱分析
层析前样品处理：采用BCA法检测抗体与药物偶联后 产物的浓度，将产物用PBS 稀释到 2mg/mL。100^L 2mg/mL IgG 在 PBS 溶液中与 100pL 50mM DTT 在37C ，反应20min，0.22^m的超滤膜过滤，除去样品中杂质 。上样20^L，280nm检测。 采用反相色谱柱 PLRP-S 1000A，8mm，150mmx4.6mm， P/N PL1512-3802 检测，方法：Buffer A: H2O + 0.1% TFA，Buffer B: CH3CN + 0.1% TFA，梯度： 30-45%B 30min，95%B 3 min，30%B 5min。
2.1实验机理
抗体被还原到合适的程度后，进行与药物的偶联 反应，通常在pH 7〜8左右，反应温度0°C下反 应1h。例如如果抗体被还原到4巯基/抗体，通常 加入4-5倍的马来酰亚胺接头的药物反应30min[1] 。其中采用二甲基甲酰胺（DMF)或者二甲基乙酰 胺（DMAC)先将药物溶解，然后与抗体还原后的 产物反应[2，3]。加入过量的小分子硫醇进行猝灭 ，来阻止马来酰亚胺与抗体上的巯基进一步反应 ，药物接头的马来酰亚胺被猝灭后，接下来的步 骤就是要除去多余的药物接头以及有机溶剂， EDTA等添加物。
实验结果与讨论
3.1疏水作用层析硫酸铵浓度的选择
盐浓度的高低直接影响疏水吸附能力的大 小，盐浓度太高疏水性强，不宜洗脱；而盐 浓度太低疏水性弱，不宜吸附。因此要选择 适宜的盐浓度。当样品中分别含有不同盐浓 度0.5、0.8、1.0、1.3、1.50M硫酸铵时，进 行HIC分析，当盐浓度为0.5、0.8、1.0 M时， 样品不能吸附在介质上，基本全部流穿，当 为盐浓度为1.5M，洗脱峰中出现不同的抗体 药物偶联物，因此，选择样品上样时盐浓度 为 1.5M。
由于药物的成分、均一性与药物的安全以及 药物的疗效息息相关，因此对抗体药物偶联 物的组成、非均一性分析越来越被重视[4] 。疏水色谱柱TSKgelButyl -NPR (4.6mm X 3.5 cm)以对蛋白的高速、高分辨率的分离 性能为广大研宄人员提供了帮助。它以表面 键合有丁基的、粒径为2.5—的非多孔型亲 水性树脂作为填充剂。
通过上式计算出不同反应每个抗体分子上平均 偶联上的药物数量。图4-2由 下及上分别是 IgG: DTT： Drug=1:1.5:3、 1:2.5:5、1:3.5:7、1:3:6。通过分析可知， 当IgG： DTT： Drug=1:1.5:3时，偶联到抗体 上的药物很少，基本检测不出，当 IgG： DTT： Drug=1:2:4时，平均每个抗体上 的药物数量为1.65，当IgG： DTT： Drug=1:2.5:5时，平均每个抗体上的药物数量 为2.22，当IgG: DTT： Drug=1:3:6 时，平均每个抗体上的药物数量为3.56，因此， 当IgG： DTT： Drug=1:3:6时， 平均每个抗体上的药物数量符合要求，因此， 采用DTT作为还原剂还原抗体并 偶联上药物的最佳比例为IgG： DTT： Drug=1:3:6
◆采用3K超滤管超滤膜在4000g转速下离心至少5次，以除
去未反应还原剂。同时将整个反应置换成Tris-HCl 8.0 的缓冲体系中。 ◆加入不同比例2mM药物142B1，Drug：IgG比例分别为4、5 、6。比例和体积如表中所示，加入Tris-HCl pH8.0至反 应体系为200pL (表4-3)。采用混匀器混匀后，将反应体 系放置到37C恒温摇床中，180转速下反应1h。 ◆向最终的反应体系中加入半胱氨酸，使其中浓度达到1mM ，猝灭未反应 的药物。反应后的样品采用BCA法检测浓度。
4、实验结论
本章在还原剂还原抗体的最优条件下，进行抗体与药物的 偶联反应，采用疏水作用层析和反相高效液相色谱对偶联药 物后的抗体进行检测，确定了抗体药物偶联物的合适的检测 方法，并且计算得出了平均每个抗体所连接药物数量。所得 结论有以下三点： 通过不同流速，样品中含有不同盐浓度进行疏水层析方法的 优化，确定采用疏水层析分析抗体药物偶联物的分析条件： 流动相为Buffer A: 1.5M (NH4)2SO4，50mM KHPO4，pH 7.0 ，Buffer B: 50mM KHPO4，pH 7.0 加入 20%异丙醇，流速0.4mL/min，样品中盐浓度为1.5M硫酸铵 ，蛋白浓度1mg/mL。上样 50pL，280nm 检测。
2.4.2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
◆SDS-PAGE是依据通过SDS使蛋白质分子带上大量负
电荷中和蛋白质分子本身电荷，消除蛋白质分子本 身的电荷效应。依据蛋白质的分子大小呈现不同条 带。通过凝胶成像系统所得图片蛋白带的宽度以及 颜色的深浅，采用光密度分析可以判断出蛋白带大 约的蛋白量。 ◆采用非还原的SDS-PAGE电泳，浓缩胶为8%的聚丙烯 酰胺凝胶，分离胶为12%的聚丙烯酰胺凝胶。样品缓 冲液中不含巯基乙醇[6] 。取20pL(0.1mg/mL〜 0.5mg/mL)蛋白样品加适量的样品缓冲液在100C下煮 沸5min， 8000g高速离心5min后上样。考马斯亮蓝 染色，染色剂为考马斯亮蓝R-250。
3.2疏水作用层析流速的选择
采用 HIC 进行分离过程中，流速能够影响不 同药物偶联物之间的分离度，流速一般在 0.2〜1mL/min 之 间 变 化 ， 在 流 速 0.2〜 1mL/min 变化时，系统压力逐渐上升，压 力如图4-1所示，当流速超过0.8mL/min时 ，系统压力达到 10MPa ，已经接近 AKTA 层 析系统耐受压力。流速在 0.6mL/min 时， 系统压力在 8MPa，在层析系统和分析柱的 耐受压力范围内，但是，不同药物偶联物 的峰分离度很差，不能将各个产物很好的 分开。当流速为 0.2mL/min 时，分析时间 延长，综合考虑各个因素选择最优流速为 0.4mL/min。
2.2实验方案
◆分别取浓度为26.6mg/mL的IgG 75pL分装至离心管 中，TCEP和DTT用PB7.0缓冲液配置成10mM溶液，然 后稀释至1mM，将药物溶于N, N-二甲基甲酰胺配成 浓度为2 mM的溶液。 ◆还原反应：将还原剂按表中比例加入到IgG溶液中， 补充缓冲液至总体积为150pL，用移液枪吹打混匀， 将反应体系放置到37C恒温摇床中，180转速下反应 2h。SDS-PAGE检测是否被还原。 ◆在反应体系中取出5pL稀释至20pL，加入非还原电 泳上样缓冲液，进行SDS-PAGE，检测还原反应程度 [5] 。
由上至下依次为 IgG, IgG:DTT:Drug=1:1.5:3，IgG ： DTT: Drug=1:2:4，IgG： DTT: Drug=1:2.5:5， IgG： DTT： Drug=1:3:6。
通过分析计算，当 IgG:DTT:Drug=1:1.5:3时，偶 联到抗体上的药物很少，基本 检测不出。当IgG: DTT： Drug=1:2:4时，平均每个抗体 上的药物数量为1.23，当IgG： DTT： Drug=1:2.5:5时，平均 每个抗体上的药物数量为2.12 ，当IgG：DTT： Drug=1:3:6时 ，平均每个抗体上的药物数量 为3.56。这与疏水作用层析数 据基本接近，因此，当IgG： DTT：Drug=1:3:6时，平均每个 抗体上的药物数量符合要求， 因此DTT作为还原剂还原抗体并 偶联上药物的最佳比例为 IgG:DTT：Drug=1:3:6。
药物载量计算以IgG： DTT： Drug=1:3:6为例进行计算
3.4反相色谱分析
反相色谱也是基于抗体载药量的不同来来分离的，载药量越 高的ADC，保留时间越长，与HIC的根本不同是反相色谱是在 还原的条件下分离的，此时抗体的重链轻链是分离的，并没 有共价结合为一体，因此重链轻链是分别洗脱下来的。部分 还原后偶联药物生成的药物偶联物是一个依靠链间的共价键 结合在一起的复杂的混合物，从该混合物中的物种衍生的反 相色谱图很难解释，所以这个方法的样品制备包括DTT处理的 步骤，以减少任何其它分子间的二硫化物。样品完全还原后 ，所有的抗体以单独的链进行洗脱。所有的重链轻链连有不 同数量药物，重链H，轻链L，重链连有1个药物H1，依次类推 ，产物有L0，L1，H0，H1， H2，H3分别计算出来，由工作站 得出每个峰面积，当IgG:DTT:Drug=1:2:4时，每个峰面积如 表4.5所示，由下式可得出每个抗体上连接药物数量。图4.3 中，
2.3实验药品和仪器
实验药品及其规格
2.4.1、蛋白浓度测定
蛋白浓度采用BCA方法测定。具体步骤为：分别在96 孔板的每个孔中加入20pL 不同浓度（0.2mg/mL、 0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL 和 1.0mg/mL)的蛋 白标准品(BSA标准溶液2mg/mL)和待测样品和空白对 照，然后加入200pL工作液（A液:B液=50:1)，将96孔 板放置于37C的恒温培养箱中反应0.5h。将酶标仪的 检测波长设为562nm，在该波长下检测每个孔中蛋白 质的吸光值。然后根据标准蛋白的浓度和测出的吸光 值，绘制蛋白质浓度标准曲线。从标准曲线计算得到 检测样品的浓度。
3.3抗体药物偶联物疏水作用分析
在流速0.4mL/min，样品中盐浓 度为1.5M硫酸铵的条件，采用 AKTAPurifier100层析系统对样 品进行分析。不同载药量的抗 体药物偶联物按照疏水性的强 弱先后被洗脱下来，从而得到 不同的检测峰。抗体还原后的 巯基是成对出现，因此，偶联 的药物数量分别是0，2，4，6 ，8个，分别记为D0，D2，D4， D6， D8。出峰先后顺序为D0， D2，D4，D6，D8，见图4-4。每 个抗体分子的平均药物载量可 以通过构成峰的积分面积和每 个峰的药物载量作为加权因子 来计算，通过工作站分析得出 各个峰面积，见表4-2：
河北科技大学本科论文答辩
抗体药物偶联物的制备研究

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目录
实 验 分 以 下 几 项 进 行 介 绍
1.引言
2.实验部部分
3.实验结果与讨论
4.实验结论
1.1课题背景
本课题是对抗体药物偶联物的制备进行研宄，主要 内容如下： 从众多检测蛋白的方法中挑选出适用于检测抗体还 原后产物的最优方法。采用常用的还原剂对抗体进 行还原，检测抗体不同时间下还原程度，得出最优 还原反应时间以及还原过程的动态变化。 对反应温度，反应pH，还原剂与抗体的还原比例进 行响应面试验设计，优化反应条件，从常用的九种 还原剂中筛选出高效的还原剂，用来连接带有马来 酰亚胺接头的药物，进行抗体药物偶联物制备实验 。
◆考察样品中加入不同硫酸铵含量对分析结果的影 响。加入不同比例2 M硫酸铵缓冲液(2.0 mM Na2HPO4-NaH2PO4磷酸缓冲液中加入2M硫酸铵调 pH 7.0)和PB(20 mM pH 7.0 Na2HPO4-NaH2PO4磷 酸缓冲液），最终浓度硫酸铵分别为0.5、0.8、 1.0、1.3、1.5M。 ◆考察流速为0.2、0.4、0.6、0.8、1mL/min时，系 统压力的变化，分析柱对抗体与药物偶联后生成 产物的情况，室温检测，检测波长为280nm，进样 体积为50pL，浓度1mg/mL，总蛋白进样量为50昭 。
2.Hale Waihona Puke Baidu.3、疏水作用层析
◆层析前样品处理：采用BCA法检测抗体与药物 偶联后产物的浓度，将产物用PBS稀释到 1mg/mL[7] 。采用0.22pm的超滤膜过滤，除去样 品中杂质。 ◆采用分析柱TOSOH TSKgel Butyl-NPR检测抗体 与药物偶联后的各个产物的生成情况，液相系 统为AKTA Explorer 100。 ◆分析条件：流动相为 Buffer A: 1.5M (NH4)2S〇4，50mM KHPO4，pH 7.0，BufferB: 50mM KHPO4，pH 7.0 加入 20% 异丙醇。