真核表达质粒的大量制备

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疫苗质粒生产

疫苗质粒生产全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：疫苗质粒生产是指利用重组DNA技术，在大肠杆菌或其他宿主中制备疫苗的DNA质粒。

疫苗质粒生产是一种先进的生物技术，能够快速、高效地生产大量的疫苗质粒，为疫苗生产提供了新的途径和手段。

疫苗质粒生产的过程一般包括质粒构建、转染宿主细胞、培养和获得目标产物等环节。

需要通过重组DNA技术构建含有目标基因的质粒。

质粒是一种小环状DNA分子，带有特定的基因序列，可以在细胞内复制和表达目标基因。

构建好质粒后，接下来是将质粒转染到宿主细胞中，一般使用大肠杆菌等宿主细胞。

转染后，宿主细胞会在培养条件下复制质粒，并表达目标基因。

通过培养和提取目标产物，得到纯化的疫苗质粒。

疫苗质粒生产的关键技术包括质粒构建技术、转染技术和培养技术等。

质粒构建技术是疫苗质粒生产的基础，需要熟练掌握克隆技术、转座子技术等重组DNA技术。

转染技术是将质粒导入宿主细胞的关键步骤，可以通过化学法、电穿孔法、基因枪等方法实现。

培养技术是保证宿主细胞正常生长和表达目标基因的关键，需要控制培养条件、培养基组成等因素，确保高效表达目标产物。

疫苗质粒生产具有许多优势，如生产周期短、生产成本低、规模化生产等。

相比传统的疫苗生产方法，疫苗质粒生产更为灵活，可以根据需要随时调整目标基因的表达水平和质粒结构，有利于疫苗的研发和生产。

疫苗质粒生产还可以避免使用活病毒或细菌，降低了潜在的安全风险，适合生产高安全性的疫苗。

疫苗质粒生产在预防和控制传染病方面具有重要意义。

疫苗是预防传染病的主要手段，而疫苗质粒生产可以快速生产出大量的疫苗，为疾病防控提供了有效的工具。

疫苗质粒生产可以应用于各种疫苗的生产，包括流感疫苗、乙肝疫苗、HPV疫苗等。

通过疫苗质粒生产，可以提高疫苗的产量和质量，为全球疾病防控做出贡献。

疫苗质粒生产是一种先进的疫苗生产技术，具有高效、安全、灵活等优势。

随着生物技术的不断发展，疫苗质粒生产将在未来发挥越来越重要的作用，为全球公共卫生事业做出更大的贡献。

真核表达质粒的大量制备

大量制备质粒所用到的溶液及成分如下：溶液Ⅰ：Glucose (50mM), Tris (25mM), EDTA (10mM), PH=8.0；溶液Ⅱ：SDS (2%), NaOH (0.4M), 用时新鲜配制，1：1混匀；溶液Ⅲ：醋酸钾（3M），冰乙酸（11.5%）。

TE(pH8.0): Tris (10mM), EDTA (1mM)氯化锂（Licl）：5M13% PEG8000 containing 1.6M Nacl, 过滤除菌，常温放置异丙醇无水乙醇RNaseTris饱和酚或水饱和酚氯仿异戊醇HEPES真核表达质粒的大量制备（碱裂解法）（1）将所需质粒分别转染大肠杆菌感受太细胞DH5α，并涂在具有相应抗生素（AMP）的平板上，37℃培养箱倒置培养14h；（2）从上述平板上挑取单克隆分别接种到含有抗生素（AMP）的3ml LB液体培养基中，37℃、220rpm培养12h；（3）然后将其扩培到200ml含有抗生素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养14h；（4）将上述菌液倒入500ml的离心瓶中，在4℃、4000rpm离心10min；（5）去除培养基，加入10ml的溶液Ⅰ重悬沉淀，并转移到50ml的离心管中；（6）加入10ml新鲜配制的溶液Ⅱ，缓慢颠倒几次使其混匀，并在冰上放置5min ；（7）加入预冷的溶液Ⅲ，缓慢颠倒几次使其混匀，并在冰上放置10min ；（8）在4℃、13000rpm离心30min；异丙醇沉淀质粒（9~11）：（9）取上清，不要吸取下面的沉淀，并加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后，在-20℃冰箱放置45min左右；（10）在4℃、13000rpm离心30min，并倒掉上清；（11）用5ml预冷的70%的乙醇洗一次，在4℃、13000rpm离心15min，弃乙醇并在超净工作台内吹干，大约15min；LiCl沉淀RNA和蛋白质（12~14）：（12）用5ml在60℃烘箱预热的无菌水充分溶解沉淀，并放在冰上冷却；（13）加入等体积预冷5M的LiCl，混匀后并在-20℃冰箱放置10min；（14）在4℃、13000rpm离心10min，注意沉淀的是RNA和蛋白质；用异丙醇再次沉淀质粒（15~17）：（15）取上清，并加入等体积的异丙醇，在-20℃冰箱放置45min；（16）在4℃、13000rpm离心10min，沉淀为质粒；（17）弃上清，并用预冷的70%乙醇洗一次，在4℃、13000rpm离心10min，弃乙醇并在超净工作台内吹干；聚乙二醇（PEG）纯化并沉淀质粒（18~21）：（18）用500µl含有RNase(50µg/ml)的TE溶解沉淀，一定要使其充分溶解；（19）加入等体积的13%的PEG8000，并混匀，在冰上放置10min；（20）在4℃、13000rpm离心10min，沉淀为质粒；（21）弃上清，用70%的乙醇洗一次，4℃、13000rpm离心10min，超净工作台内吹干；用酚、氯仿抽提质粒，去除Rnase（22~23）：（22）用400µl TE 溶解沉淀，加入等体积的酚：氯仿：异丙醇为25：24：1；（23）混匀后，在4℃、13000rpm离心10min，将上清含有质粒转移到新的离心管中，尽量不要吸到下面的有机相；用无水乙醇沉淀质粒（24~27）：（24）加入1/10体积的1M NH4Ac或溶液Ⅲ和2倍体积的无水乙醇，在-20冰箱放置30分钟或过夜；（25）在4℃、13000rpm离心10min，沉淀为质粒；（26）弃上清，并用预冷的70%的乙醇洗一次，在4℃、13000rpm离心10min，弃乙醇并在超净工作台内吹干；（27）在超净工作台内用400µl 无菌的TE溶解质粒；大量制备质粒的纯度和浓度的检测（28~30）：（28）取1µl大量制备的质粒，并稀释10倍，取5µl用紫外检测仪检测其浓度；（29）剩余的5µl进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度。

质粒大提--自制试剂配制和操作步骤总结

质粒大提--自制试剂配制和操作步骤总结质粒提取试剂配制和操作步骤试剂配制(小量)1. 1M（M代表摩尔浓度即mol∕L）NaOH (400ml ): 分子量为40，秤取16gNaOH, 溶于400ml DDW中。

2. 2M Tris-HCl (500ml): 分子量为121.14, 秤取121.14g Tris,放入干净的500ml烧杯中，加400 ml DDW，置于搅拌器上搅拌溶解，用HCl调节pH值为8.0（首先直接加12M的浓盐酸约20ml，接近8.0时再用1M HCl 调节）, 定容至500ml，4℃保存。

3. 10%SDS (200ml): 称量20gSDS,放入干净的烧杯中，加100 ml DDW，定容到200ml，室温保存。

（SDS具有较强的刺激性，称量时一定带好口罩，动作轻柔）。

4. Buffer P1 (500ml): 用50ml离心管量取10ml 0.5M的EDTA，然后量取12.5ml 2M 的Tris-HCl，放入干净的烧杯中，加入300ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解，用HCl调节pH值为8.0（大约加12M的浓盐酸1ml ），定容至500ml，4℃保存。

5.Buffer P2（100ml）: 20ml 1M NaOH和10ml 10%SDS放入200ml的玻璃瓶中，然后加入70ml DDW，混匀，室温放置过夜，使其自溶，最后室温保存。

(注：不需要定容，严格按步骤操作)。

6. Buffer P3 (500ml) ：秤取147.21g乙酸钾，溶于300ml DDW中，置于搅拌器上搅拌溶解，用冰醋酸调节pH值为5.5，（约加80–100ml冰醋酸）, 定容至500ml，4℃保存。

7. Buffer QBT（500ml）：分别称取NaCl 21.915g, MoPS 5.23g, 放于干净的500ml烧杯中，加入300ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解，用1M NaOH调节pH值为7.0（约加10–15ml NaOH）,然后加入75ml 异丙醇，定容至500ml，4℃保存。

使质粒数量增加的方法

使质粒数量增加的方法质粒是一种重要的生物学实验工具，是许多基因工程研究中必不可少的技术手段。

在很多生物学研究中，需要大量的质粒来实现基因重组、基因转染、转录调控等实验目的。

那么，如何使质粒数量增加呢？下面将介绍几种常用的方法。

一、原核生物的质粒放大法原核生物常见的质粒放大方法是静态培养，通过静态培养，一般情况下，质粒的放大倍数可以达到10^6 ~ 10^9倍。

该方法适用于质粒小、具有自复制功能的质粒。

具体步骤如下：1.选用含有质粒的培养基，人工制成不同营养成分和pH值的富含异陈酸和氧气等营养环境，用于接种原核生物。

2.选好实验室装备，洗净消毒培养漏斗，准备好培养皿和塑料瓶等。

3.消毒操作台和手术工具，并在需要放大的菌株上划线。

4.将细菌菌落取出，用于静态培养，常常使用培养皿方法，加入含有质粒的培养基中。

5.培养皿使用条件为：室温下置放，保证足够湿度，不然会导致菌落枯萎。

6.一般情况下，静态培养3-4天左右，即可实现质粒的大量产出。

二、质粒DNA的提取和扩增在实验室中，我们也可以通过直接提取和扩增质粒DNA的方法实现质粒数量的增加。

这是利用PCR技术进行的，需要提取的质粒数量较大，容易污染，因此需要进行细致的操作控制。

具体步骤如下：1.首先，筛选含有所需质粒的菌株。

2.使用工具将菌株培养在富含甲基红的液体培养基。

3.将菌株培养至对数生长期，同时可以添加胡萝卜素等增殖因子。

4.使用氯仿/异丙醇进行质粒提取，将提取的质粒抛掉，保留接口部分的DNA。

5.使用PCR扩增技术将接口部分的DNA扩大，可以估计一份质粒在每个菌中的复制数。

三、质粒的质粒DNA片段重组质粒DNA片段重组是利用分子生物学技术实现的质粒扩增方法，也是一种实验室中常见的质粒扩增方法。

这种方法适用于较小的质粒，产量比较大。

具体步骤如下：1.使用PCR技术进行质粒DNA片段的扩增。

2.剪切PCR片段并克隆质粒。

3.扩大克隆的质粒，并进行质粒复制。

大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP基因DNA疫苗的构建及其免疫效果

大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP基因DNA疫苗的构建及其免疫效果曾宪辉;曾令兵;周勇;范玉顶;陈倩;刘文枝;张雪萍;张琳琳【摘要】Based on major capsid protein (MCP) gene sequences of Chinese giant salamander iridovirus (GSIV) in GenBank, specific primers were designed, and the full-length MCP sequence (1392 bp) was amplified by PCR. Then, MCP was cloned into the eukaryotic expression vectorpcDNA3.1 (+) to construct the recombinant expression vector pcDNA-MCP. Giant salamander (Andrias davidianus) muscle (GS-M) cells were transfected with the recombinant ex-pression vector, pcDNA-MCP. At 48 h and 72 h post-transfection, MCP protein expressions in GS-M cells werede-tected by indirect immunofluorescence assay. The results showed that the protein expression level at 72 h post-transfection was significantly higher than that at 48 h post-transfection;western blot assay also confirmed the spe-cific expression of MCP in GS-M cells at 72 h post-transfection. The eukaryotic plasmid pcDNA-MCP was used as a DNA vaccine to immunize Chinese giant salamanders by injection in dorsal muscle at a dose of 20 µg/ind;then, pe-ripheral blood from Chinese giant salamanders in both tested and control groups was collected on day 1, day 3, day 7, day 14, day 21, day 28, and day 35 post-immunization for hemocyte count, classification, and serum-neutralizing anti-body titration. The red and white blood cell counts showed significant increase in numbers of erythrocytes and leuko-cytes in the peripheral blood ofimmunized Chinese giant salamanders on day 5 and day 7 post-immunization (P<0.01). Additionally, the differential leukocyte counts of neutrophils and monocytes were (26.33±1.04)%and (15.83±0.76)%, respectively, at day 5 and day 7 post-immunization, and both significantly changed compared with the control group (P<0.01). The percentage of lym phocytes was (68.33±1.53)%at day 28 (P<0.01). The serum neutralization assay dem-onstrated that the antibody titer peaked on day 28 post-immunization [1︰(370.01±31.55)]. PCR results revealed that pcDNA-MCP was distributed in the muscle, liver, spleen, and kidney from day 1 to day 28 post-vaccination. RT-PCR results revealed that MCP was expressed in all of the above tissues at day 7 and day 28 post-vaccination.A challenge test was conducted at day 28 post-immunization and produced a relative survival of 73.3%. This study provides a fun-damental basis for the application of the pcDNA-MCP plasmid as a potential DNA vaccine to prevent and control GSIV infection in Chinese giant salamanders in the future.%根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus, GSIV)主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因序列设计特异性引物,经 PCR 扩增得到 MCP 基因编码框1392 bp 全长序列,将其定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒并命名为pcDNA-MCP。

真核表达质粒的构建与表达

真核表达质粒的构建与表达1. 真核表达质粒的构建真核表达质粒是一种含有真核基因的质粒，它可以用于在真核细胞中表达外源基因。

真核表达质粒的构建主要包括以下步骤：（1）选择表达载体：首先，需要选择一种合适的表达载体，例如质粒、质杆菌、噬菌体等，以及一种合适的表达系统，例如T7系统、T3系统、SP6系统等。

（2）构建表达质粒：其次，通过合成或克隆技术将外源基因插入到表达载体中，构建表达质粒。

（3）筛选表达质粒：最后，通过PCR、Southern blotting等技术筛选出含有外源基因的表达质粒。

2. 真核表达质粒的表达真核表达质粒的表达是一种细胞内的转录和翻译过程，它可以将外源基因插入真核细胞中，从而实现基因的表达。

表达质粒的表达通常由以下几个步骤组成：首先，将外源基因与表达质粒的启动子序列结合，以形成表达质粒；其次，将表达质粒转染到真核细胞中，以便在细胞中表达外源基因；最后，真核细胞将表达质粒中的基因转录成mRNA，然后翻译成蛋白质，从而实现基因的表达。

此外，表达质粒的表达过程还可以通过调节启动子序列的表达水平来调控基因的表达。

真核表达质粒的稳定性是指质粒在不同的环境条件下，表达量不受外界环境变化的影响，能够保持恒定的表达量。

稳定性的提高可以改善表达质粒的性能，并且能够更好地满足实验要求。

为了提高真核表达质粒的稳定性，一般采用以下几种方法：一是优化质粒的结构特征。

质粒结构特征包括质粒的大小、碱基组成、表达载体的类型等。

优化质粒的结构特征可以有效提高质粒的稳定性，从而改善质粒的性能。

二是改变质粒的表达系统。

质粒的表达系统包括表达调控因子、载体、表达调控序列等。

改变表达系统可以改变质粒的表达量，从而提高质粒的稳定性。

三是改变质粒的表达条件。

质粒的表达条件包括培养基、温度、pH值、溶液浓度等。

改变质粒的表达条件可以改变表达量，从而提高质粒的稳定性。

四是改变质粒的表达调控序列。

表达调控序列是控制质粒表达的关键因素，改变表达调控序列可以改变质粒的表达量，从而提高质粒的稳定性。

pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒的构建及其活性测定

pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒的构建及其活性测定詹玉林;白靖平;库热西·玉努斯;黄国虹【摘要】目的:构建pIRES2-绿色荧光蛋白(EGFP)-骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)真核表达质粒,并检测其表达活性.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人骨肉瘤组织中扩增出人骨形态发生蛋白2 (hBMP-2)的基因片段,构建成pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒,经酶切、测序检测其构建的正确性,通过转染3T3细胞后分别采用RT-PCR、免疫组化及Western免疫印迹(Western blotting, WB)法检测其转录、表达活性.结果:构建的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒经酶切、测序、RT-PCR、免疫组化、EGFP表达鉴定、WB等检验表明质粒构建成功并具有转录活性.结论:本实验成功构建了具有表达活性的hBMP-2真核表达质粒,为进一步研究用BMP-2基因转染的方法来促进实验动物骨折的愈合奠定了基础.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2008(031)005【总页数】4页(P524-527)【关键词】人类;pIRES2-EGFP;骨形成蛋白2;基因【作者】詹玉林;白靖平;库热西·玉努斯;黄国虹【作者单位】新疆医科大学第一附属医院骨科,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学附属肿瘤医院,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学基础医学院分子生物学教研室,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学基础医学院分子生物学教研室,新疆,乌鲁木齐,830011【正文语种】中文【中图分类】R34骨形成蛋白2(Bone morphogenic proteins 2, BMP-2)被认为是骨形成蛋白(BMPs)家族中诱导成骨作用最强且能单独诱导成骨的细胞因子。

pIRES2绿色荧光蛋白(EGFP)是来源于心肌炎病毒的载体，经改建后，在其中加入了可表达增强绿色荧光蛋白的基因，是一种高效、简便的真核表达载体。

构建质粒详细步骤

构建质粒详细步骤在基因工程中，构建质粒是一项基础且关键的任务，以下是构建质粒的详细步骤。

1.目的基因获取首先，需要获取目的基因。

目的基因可以通过引物设计和克隆载体构建的方法获得。

引物设计是根据目标基因的序列，通过软件辅助设计出一对特异性引物。

克隆载体构建则是根据目标基因的特点，选择或构建一个适合的克隆载体，以便于目的基因的获取和后续操作。

2.载体质粒选择在获取目的基因之后，需要选择一个合适的载体质粒。

载体质粒的选择应考虑以下几个因素：质粒来源（如细菌、酵母等）、质粒大小（合适的大小能够确保插入的目的基因稳定存在并且可复制）、质粒序列（序列应清晰、稳定，以确保质粒的准确性）。

3.酶切质粒和目的基因获取到的质粒和目的基因需要进行酶切处理。

这一步骤主要是为了将目的基因插入到质粒中。

通常使用限制性内切酶对质粒和目的基因进行酶切，并且需要控制酶切时间和温度，以确保酶切效果良好且不会对DNA造成损伤。

4.T4DNA连接酶连接酶切后的质粒和目的基因需要通过T4DNA连接酶进行连接。

T4DNA连接酶能够将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来。

在这个过程中，需要控制DNA的浓度、缓冲液的选择、反应温度以及是否过夜连接等条件，以确保连接的有效性和正确性。

5.转化受体细胞连接完成的质粒需要转化入受体细胞中。

常见的受体细胞包括细菌、酵母、昆虫等。

转化过程需要考虑受体细胞的类型、数量、转化效率和筛选策略等因素。

例如，对于细菌转化，需要选择感受态细胞作为受体细胞，并控制转化温度和时间以确保转化效率。

6.克隆筛选及鉴定转化后的受体细胞需要进行克隆筛选和鉴定，以找出含有正确插入目的基因的克隆。

筛选和鉴定可以通过菌液制备、抗体制备、筛选策略和鉴定方法等步骤实现。

例如，可以通过菌落PCR或抗药性筛选策略筛选出阳性克隆，并采用DNA测序等技术对阳性克隆进行鉴定。

7.质粒大量制备最后，需要对筛选出的阳性克隆进行大量制备质粒的操作。

这一步骤通常采用碱裂解法或热法等常规方法制备质粒。

表达质粒的构建方法

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。

而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr （试一试）。

（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

质粒表达方向

质粒表达方向质粒表达方向质粒表达是一种常用的分子生物学技术，可以用来大量生产蛋白质、制备DNA文库等。

在质粒表达中，质粒DNA需要被转录成mRNA，然后再被翻译成蛋白质。

因此，质粒表达方向的选择对于蛋白质表达的效率和质量有着重要的影响。

质粒表达方向有两种：正向和反向。

正向表达是指质粒DNA的5'端与启动子相连，3'端与终止子相连，这种表达方式与真核生物的基因表达方式相同。

反向表达则是质粒DNA的3'端与启动子相连，5'端与终止子相连，这种表达方式与细菌的基因表达方式相同。

在选择质粒表达方向时，需要考虑以下几个因素：1.启动子的位置：启动子是转录的起点，如果启动子位于质粒DNA的5'端，则应选择正向表达；如果启动子位于质粒DNA的3'端，则应选择反向表达。

2.终止子的位置：终止子是转录的终点，如果终止子位于质粒DNA的5'端，则应选择反向表达；如果终止子位于质粒DNA的3'端，则应选择正向表达。

3.宿主细胞的基因组：不同的宿主细胞基因组中，基因的排列方式不同，因此需要根据宿主细胞的基因组选择合适的表达方向。

4.表达的蛋白质：有些蛋白质的表达需要特定的表达方向，因此需要根据表达的蛋白质选择合适的表达方向。

总的来说，选择质粒表达方向需要综合考虑以上因素，以达到最佳的表达效果。

在实际操作中，可以通过PCR扩增质粒DNA并在5'端或3'端引入适当的限制性内切酶切位点，以便在克隆时选择合适的表达方向。

总结起来，质粒表达方向的选择对于蛋白质表达的效率和质量有着重要的影响，需要根据启动子和终止子的位置、宿主细胞的基因组以及表达的蛋白质等因素进行综合考虑。

在实际操作中，可以通过PCR扩增质粒DNA并在5'端或3'端引入适当的限制性内切酶切位点，以便在克隆时选择合适的表达方向。

质粒的大量制备

（二）质粒DNA 的大量制备:1：在200 mL 的LB 培养基中加入200μL 的相应的抗生素，然后接种适量含有目的质粒的菌液，于37 ℃摇床中，以200 rpm 的转速振荡培养12-14 h。

2：在50 mL收集管中放入吸附柱，并将2.5 mL 的平衡液BL 加在吸附柱上，以8000 rmp 4℃离心2 min，弃废液，再将吸附柱重新放入收集管。

3：在离心管中加入过夜培养的菌液，以8000 rmp 4℃离心5 min，弃上清，并去除残留在管壁上的液体。

4：在上述离心管中加入8 mL 的溶液P1，在振荡器上充分震荡以彻底使菌体裂解。

5：再向上述离心管中加入8 mL 的溶液P2，然后温和的上下摇动液体7~9 次，在室温条件下静置5 分钟。

6：再向上述离心管中加入8 mL 的溶液P4，然后温和的上下摇动混合液7~9 次，待其充分混匀使混合溶液成白色絮状沉淀，在室温条件下静置10 min，然后以8000 rmp 4℃离心10 分钟，然后将上清转移至过滤器CS1 中，在新的50 mL 离心管中收集滤液。

7：向滤液加入其0.3 倍体积的异丙醇，翻转摇匀后将其转移至吸附柱中。

在室温条件下静置5 分钟。

8：在室温条件下以8000 rmp 4℃离心2 分钟，弃废液，再将吸附柱放入收集管中。

9：在吸附柱中加入10 mL 的漂洗液PW，以8000 rmp 4℃离心2 min，将收集管中的废液倒掉倒，然后将吸附柱再次放入收集管中。

10：将第9 步的操作重复一遍11：在吸附柱中加入3 mL 的无水乙醇，以8000 rmp 在室温条件下离心2 分钟，倒掉废液。

12：再次将吸附柱重新放入收集管中，以8000 rmp 离心5 分钟，为了彻底的去除从残留在吸附柱中的漂洗液PW。

13：然后将吸附柱重新放入一个干净的50 mL 离心管中，在吸附柱的膜中间滴入1~2 mL 的洗脱缓冲液TB，在室温条件下静置10min，以8000 rmp 离心 2 分钟，然后将50mL 离心管中的液体转移至新的1.5 mL 的EP 管中，置于-20 保存备用。

大量制备质粒DNA(传统碱裂解法、PEG8000纯化)

大量制备质粒DNA（传统碱裂解法、PEG8000纯化）适用于从100-250ul菌液中制备100-200ug高拷贝质粒1．涂板、挑取单克隆菌落，加入LB选择性培养基中（高拷贝质粒用100-250ml,低拷贝用500ml），37℃振摇12-16小时。

2．收获菌液（用35ml离心管）：4℃ 5,000rpm 离心10min，弃上清，再次离心2min，吸除残留的培养液：（注意：这步可将离心沉淀后的菌斑-204℃冻存12-24小时，留待以后操作。

）3．以10ml溶液I重悬细菌。

4．加入溶液II 10ml,轻轻旋转、颠倒４－６次（不可过重，以免机械剪切基因组ＤＮＡ），室温放置５min（不可超过５min，避免过度消化）。

5．加入冰预冷的溶液III 10ml，迅速颠倒4-6次混匀，冰上放置20min，以促进沉淀形成。

6．4℃ 1，3000rpm（2，000g以上）离心30min，离心前应再次混合样品。

（也可用过滤纸过滤。

收集上清。

）7．上清入新管，以与上一步相同的条件离心15min，充分去除沉淀。

（如过滤此步可省）。

8．上清入新管，加入60%体积的异丙醇（约18ml ,室温，已避免增加盐沉淀），混匀，室温放置10min，4℃ 1，5000rpm离心30min（离心前应于管底作好标记），小心，缓慢地倒出上清，切勿将管底的DNA沉淀一并弃去。

9．清洗：70%乙醇20ml清洗沉淀物，4℃ 1，5000rpm离心10min小心，缓慢地倒出上清，充分凉干，溶于1XTE溶液3ml 中。

10. 加入等体积 3ml预冷的5M LiCL溶液,充分混匀, 4℃ 10,000rpm离心10min。

11. 上清入新管，加入等体积的异丙醇（6ml）沉淀，室温条件下以10,000rpm离心10min，弃上清，以70%乙醇10ml清洗沉淀物，4℃ 1，5000rpm离心10min，凉干，溶于1XTE 溶液500ul 中。

(也可分成两管，每管500ul，做成两管抽提。

质粒大量提取及纯化

扬州大学本科生毕业论文论文题目：质粒大量提取及纯化学生姓名：张晨所在学院：动物科学学院专业班级：动科06 指导老师：宋成义教授完成日期：2010年6月质粒大量提取及纯化动物科学张晨指导老师宋成义摘要：为了探讨氯霉素对重组质粒DNA提取产量的影响，本试验在含重组质粒pT2/HB-CMV-EGFP的大肠杆菌DH5α培养到对数生长期时添加氯霉素继续培养12小时，收集细菌用碱裂解法粗提质粒DNA，并用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。

结果表明，氯霉素可有效的促进松弛型重组质粒DNA拷贝数的增加，从而达到提高质粒DNA产量的目的。

为了优化质粒DNA纯化过程中溶液A的用量，本试验将同一份粗提质粒DNA平分成三组，分别加入不同量的溶液A。

纯化后测定各组DNA浓度和纯度，结果表明，溶液A用量（ml）:质粒DNA量(mg)为1:2时，纯化效果最好。

关键词：质粒提取；氯霉素；纯化Extraction and purification of Large-scale plasmid DNAZHANG ChenAbstract:To study the effect of chloramphenicol on plasmid DNA preparation, in this experiment the chloramphenicol was added to the recombinant E. coli culture at the logarithmic growth phase，and then the plasmid DNA was extracted by using the traditional alkaline method. Concentration and purity of the plasmid DNA was detected and the results showed that chloramphenicol could effectively increase the copy number of relaxed plasmid and increase the output of the plasmid DNA. In order to optimize the amount of solution A which was used to purify plasmid DNA, different amount of solution A was added to the coarse extraction of plasmid. Then the concentration and purity of the puritied plasmid DNA was determined.The results showed that the purification effect was the best when the proportion of solution A(ml) andcoarse plasmid DNA(mg) was by 1-2.Key Words:extract of plasmid DNA;chloramphenicol;purification;质粒是存在于细菌染色体外的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小型环状双链DNA分子,其分子量一般在0.2～10kD范围内[1]。

真核细胞dna的制备与定量

真核细胞dna的制备与定量概述制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。

在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

一般真核细胞基因组DNA 有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。

这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似。

但都应考虑以下两个原则：(标本检测，你提供标本，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268)（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费送)（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

一、试剂准备Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。

2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。

3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4．20% SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇Q往圣科技3452125268提供免费基因慢病毒包装二、操作步骤(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)（一）材料处理(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒加慢病毒包装)1．新鲜或冰冻组织处理：⑴ 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。

大量制备质粒DNA方法

SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备用碱和SDS处理可以从大规模（500ml）的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化：材料：缓冲液和溶液：碱裂解液I：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）10mmol/L EDTA （pH8.0）（溶液I一次可配制100ml，在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭菌15min，保存于4摄氏度。

）碱裂解液II：0.2 N NaOH （从10N贮存液中现用稀释）1% （m/V）SDS（溶液II要现用现配，室温下使用）碱裂解液III：5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml双蒸水（去离子水）28.5ml所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。

保存于4摄氏度，用时置于冰浴中。

）另需：乙醇异丙醇STETE（pH8.0）溶菌酶（10mg/ml）现在开始实验：细胞的制备：1. 挑取转化细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培养基中。

注：a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。

b. 试管不宜盖的太紧c. 应在剧烈振摇下温育2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600约为0.6）。

3. 在含500mlLB、YT或Terrific培养液（预热到37摄氏度）及适当抗生素的烧瓶（2L）中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将此培养液在37摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约2.5小时。

注：最后菌液的OD600值应为0.4。

由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为0.4。

4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。

注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。

5. 于37摄氏度，以300r/min剧烈振荡再培养12~16h。

质粒大量提取、纯化方法及相关溶剂的详细配方

PEG8000沉淀法大量制备和纯化质粒1质粒提取纯化步骤1.1 质粒提取步骤1) 在超净工作台上，将甘油管保种的质粒菌自然解冻后接种到含200 mL 液体LB（含100 μg/mL Kan）培养基的三角瓶中；2) 置于恒温摇床中，37℃、180 rpm条件下振荡培养16个小时；3) 用50 mL离心管在12,000 rpm、2 min条件下离心菌液，弃上清；4）重复步骤3，将200 mL菌体合并到2个50 mL离心管中；5) 菌泥重悬于3.6 mL 溶液I，加入400 μL新配的溶菌酶（10 mg/mL），涡旋震荡混匀，室温放置15-20 min，中间晃动2-3次；6) 加入8 mL现配的溶液II，盖紧管盖后轻柔颠倒10次混匀至溶液呈透明粘稠状；7) 加入4 mL预冷的溶液III，盖紧管盖后颠倒10次混匀至白色絮状沉淀呈均匀分散状；8) 12,000 rpm离心10 min，用尼龙滤膜过滤将上清液转移至新的50 mL离心管中；9) 加入0.6倍体积的异丙醇（9.6 mL），充分混匀后室温放置30 min；10) 12,000 rpm离心5 min，弃上清，加入5 mL 70%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm 离心2 min；11) 弃乙醇，晾干后加400 μL TE（pH 8.0）溶解核酸，转入10 mL离心管中，再加200 μL TE洗管，合并后共600 μL于4℃保存。

（如果提取量较多，合并后TE应少于2.5 mL）1.2 大提质粒的纯化1) 在上述保存的每管中加等体积（600 μL）预冷的5 M LiCl，充分混匀后冰浴10 min，12,000 rpm离心10 min；2) 取上清加等体积（1.2 mL）异丙醇，充分混匀后放置20 min，12,000 rpm 离心10 min，弃上清；3) 70%乙醇洗涤，12,000 rpm离心2 min弃上清，晾干后加700 μL TE 溶解于1.5 mL离心管中，加10 μL RNaseA（10 mg/mL），37 ℃消化30 min；4) 加入0.5体积（350 μL）的含30 mM MgCl2的40% PEG8000，倒置混匀数次可观察到蛋清色絮状沉淀，静置20 min，12,000 rpm离心20 min，弃上清；5) 70%乙醇洗涤，12000 rpm离心2 min弃上清，晾干后加700 μL TE 溶解于1.5 mL离心管中；6) 加等体积（酚350 μL，氯仿/异戊醇350 μL）的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀5 min，12,000 rpm离心10 min，取上清再次用酚/氯仿/异戊醇抽提一次；7) 取上清，加入等体积（650 μL）氯仿/异戊醇（24：1）混匀5 min，12,000rpm离心10 min；8) 取上清600 μL于2 mL离心管中，加约1/10体积（60 μL）NaAc（3 M，pH 5.2），加2倍体积（1.2 mL）无水乙醇混匀，室温放置20 min。

真核表达质粒pSG5Oct4的构建及瞬时表达研究（可编辑）

真核表达质粒pSG5Oct4的构建及瞬时表达研究论文作者:雷建园指导教师:畅继武教授天津医科大学研究生院二。

一一年五月学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。

除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外,论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,与我一同工作的例志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

学位论文作者签名:重童因同期:口年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定, 即:学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。

同意学校向国家有关部门或机构送交论文,并编入有关数据库。

保密口,在??年解密后适用本授权书。

本论文属于不保密圈。

请在相对应的方框内打“√学位论文作者签名:重逮园日期:如年月日导师签名:日期:年月日大津医科人学硕十学位论文中文摘要目的人胚胎干细胞 ,具有无限增殖、自我更新及多向分化的潜能,这也使得细胞成为了基础研究和临床应用的种子细胞。

干细胞广泛应用的前提是明确其自我更新和定向分化的调控机制,细胞多能性作用的维持与其内部一些重要的转录因子的共表达及某些外源性信号分子的作用密不可分。

尤其自年以来,诱导多功能干细胞 ,所揭起的生命科学与医学界干细胞研究的又一个热潮,更是证明了、、等多个转录因子的核心调控作用。

其中,是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的最为重要的转录因子之一,的作用体现在维持种系的持续性及各组织器官分化的精密调节上,同时它也是体外建立的关键基因,但目前对于的具体作用机制并未完全明确。

胎儿骨髓间充质干细胞 ,是胎儿骨髓中一种具有高度可塑性的细胞,较成人骨髓问充质干细胞发育上更原始,具备良好的增殖能力,及其向三个胚层起源细胞分化的“类胚胎干细胞”的生物学特征。

质粒大量提取及纯化

1质粒提取1）菌体活化及扩大培养。

取10µl的-80℃保存的菌液加入到10ml含抗生素的LB培养基中，摇菌培养（或直接划线挑取单菌落）。

吸取250µl活化菌液加入250ml的含抗生素的LB培养基中，摇菌过夜（约11h）。

2）取250ml过夜培养菌液，室温10000rpm（～11500g），离心3min，收集菌体。

倒掉上清液，将离心管倒置于干净的吸水纸上。

3）加入10ml溶液I（已加入RNase A），振荡离心管使菌体重悬。

4）加入10ml溶液II，立即温和上下翻转6-8次，充分混匀，室温放置5min。

温和混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。

此时菌液应变得清亮粘稠，如未变的清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应较少菌体量。

5）加入10ml溶液III，立即温和上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色絮状沉淀。

室温放置10min，10000rpm，离心10min，使白色沉淀离心至管底。

将全部溶液倒入过滤器CS1中，将滤液收集至一干净的50ml离心管中。

6）向滤液中加入0.35倍体积的异丙醇和0.5倍异丙醇体积的5M的NaCl溶液，上下颠倒充分混匀。

置于-80℃中，放置4-5h，使其析出更多质粒。

若此处无沉淀产生为正常现象；可直接加入0.4倍体积的异丙醇，不加NaCl溶液；-80℃放置时间越长，质粒析出越多，一般应保证4-5h，使能够看到白色混浊。

7）10000rpm(~11500×g)，4℃，离心30min，轻轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。

8）向管中加入6ml的70%酒精溶液，充分清洗沉淀。

10000rpm(~11500×g)，4℃，离心10min，轻轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。

清洗两次。

9）将离心管放置于超净台中吹干，加入1ml的ddH2O溶解沉淀。

2质粒纯化1）向DNA溶液中加水至500µL。

2）加入500µL“三混”溶液，混匀，13000rpm，离心5min，转移上清液。

质粒的制备方法

质粒的制备方法嘿，朋友们！今天咱来聊聊质粒的制备方法。

这玩意儿可重要啦，就好比是一个小小的魔法盒子，里面装着好多神奇的东西呢！要制备质粒，首先得有含有质粒的细胞。

这就像是要从一堆宝藏中找到那个藏着宝贝的箱子。

那怎么找到这个箱子呢？这就得靠一些专门的手段啦。

比如说，可以通过培养细菌来获得大量含有质粒的细胞。

你想想，这就好像是种了一大片果树，等着果子成熟了去采摘。

然后呢，把这些细胞收集起来，这就好比把果子都摘下来放到篮子里。

接下来就是关键步骤啦！要把质粒从细胞里面分离出来。

这就有点像把果子的核从果肉里分离出来一样。

这可不是一件容易的事儿哦，得小心翼翼地操作，不然很容易把质粒给弄坏了。

常用的方法有碱裂解法，这就像是给细胞来一场特别的“洗礼”，让质粒从细胞的怀抱中挣脱出来。

在这个过程中，各种试剂就像是一群小精灵，帮助我们完成这个艰巨的任务。

还有一些其他的方法，比如煮沸法呀。

这就好像是把细胞放到热水里煮一煮，让质粒自己跑出来。

听起来是不是很神奇？等把质粒分离出来后，还得对它进行纯化。

这就好比把刚挖出来的金子进行提纯，去掉那些杂质，让质粒变得更加纯净。

这一步也很重要哦，不然带着杂质的质粒可没法发挥它的大作用。

纯化后的质粒，就可以用来做各种各样的实验啦！可以把它导入到其他细胞里，看看会发生什么奇妙的变化；也可以用它来构建新的基因工程载体，就像是用积木搭出一个全新的城堡。

哎呀，说了这么多，大家是不是对质粒的制备方法有了更清楚的认识啦？其实这就和我们做很多事情一样，需要耐心、细心，还需要一些技巧和方法。

只有这样，才能成功地把那个小小的质粒制备出来，让它为我们的科学研究和实践应用发挥大作用呀！所以呀，大家可别小瞧了这看似简单的制备过程哦，这里面的学问可大着呢！。

细菌质粒提取原理及步骤

质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。

2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。

（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。

现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。

此时，不必造反性地扩增质粒DNA。

然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。

氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。

这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。

多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。

（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。

选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。

尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。

1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。

将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。

这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。