细菌鉴定PPT课件
合集下载
细菌学检验ppt课件
2、标本的直接检查： ★ 直接显微镜检查：
革兰阴性小杆菌或多形态杆菌，结合临床 症状，可做出初步诊断。
★ 抗原检测
荚膜肿胀试验等
★ 核酸检测
3、分离培养与鉴定 （1) 分离培养
★ ★ ★ ★ 营养要求：高，生长中需要X、V因子。 气体环境：生长时需要5%～10%的CO2环境。 温度：35℃ 培养基：兔血或马血最好
方法：密集划线接种待测菌，再点种金葡菌，培养后观察。
流感嗜血杆菌
流感嗜血杆菌（兔血+X、V因子）
流感粘液型菌落
大菌落为奈瑟菌
小菌落为嗜血杆菌
咽拭子培养（未加万古霉素）
咽拭子培养（加万古霉素）
标本接种后点种金葡菌
卫星现象
琼脂卫星试验（脑心琼脂）
X、V因子需求试验→又称纸片法卫星试验
① 不含血液琼脂平板上密集划线接种待测菌或0.5麦 氏单位菌悬液涂抹接种。 ②将X、V、X+V因子三种纸片贴在接种细菌的平板上 纸片间相距5cm以上，（因为V因子分子量小，扩散 距离远），否则会出现X因子假阳性结果。 ③培养后观察结果 ④ （X+V）因子结果阴性的几种可能原因
一、分类
根据伯杰细菌分类手册，嗜血杆菌属隶属于 巴斯德菌科。本菌属共包括17个菌种，其中与临 床有关的有9种，分别是流感嗜血杆菌、副流感 嗜血杆菌、溶血嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、杜 克雷嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌、嗜沫嗜血杆菌、 副嗜沫嗜血杆菌和迟缓嗜血杆菌。后三者现划归 “凝聚杆菌属”。
二、临床意义
1、致病因子：细菌结构成分、毒素和酶类。
2、在假单胞菌属细菌引起的临床感染中占70%。 3、可引起机体各个系统的感染。 4、眼部感染的铜绿假单胞菌可合成胶原酶，引起角膜 穿孔而失明。
微生物细菌鉴定试验汇总ppt课件
精品ppt
19
硝酸盐还原试验方法
方法：
取一环待检菌接种到硝酸盐琼脂斜 面上，35℃培养18~24小时，然后依次 加入含α-萘氨和对氨基苯磺酸的试剂 各1mL，30s后观察结果。
精品ppt
20
应用：
有助于鉴别肠杆菌科、奈瑟菌属、布 兰汉菌属、假单胞菌属等
精品ppt
21
氧化酶试验
原理：
某些细菌具有细胞色素氧化 酶，能将二甲基对苯二胺或四 甲基对苯二胺试剂氧化成紫红 色醌类化合物
精品ppt
34
6.克氏双糖铁（KIA）复合试验
【方法】：将待检菌接种于克氏双糖铁培养基（底 层穿刺，上层斜面划线），35ºC，24h，观察。
【结果】：发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则上层和 底层均呈黄色且有气泡产生；只发酵葡萄糖而不 发酵乳糖，则底层变黄，上层仍为红色。如底层 变黑，说明该菌产生硫化氢，生成黑色的硫化铁 沉淀。
30
3.甲基红试验
【原理】：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一 步分解为甲酸、乙酸等酸性物质，故培养基pH 在4.5以下， 加入甲基红指示剂后呈红色（阳性）；有些细菌分解葡萄 糖产生的酸进一步化为醇、酮等非酸性物质，使培养基pH 在6.2以上，加入甲基红指示剂后呈黄色（阴性）。
【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种葡萄糖蛋白胨 水培养基中，35ºC18-24h，加入甲基红指示剂2-3滴观察 结果。
应用：
用于鉴定B群链球菌。
精品ppt
11
3）CAMP试验
• 无乳链球菌能产生CAMP因子，它可促进金黄色葡萄 球菌溶血能力，使其产生显著的协同溶血作用。本 法可作为无乳链球菌的初步鉴定试验
标本
涂片：G+C
细菌的分离、培养和鉴定ppt课件
请大家自觉维持实验室的卫生和秩序！
Hale Waihona Puke 病料在接种培养基后，经过一段时间，应检查其 生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有， 则需进一步检查菌落是否纯一。形态特征包括： 大小、形状、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、 波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白 色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度 （不透明、半透明、透明等）和粘度等
细菌的分离、培养与鉴定
王欣欣
一、细菌的分离
1、从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的 方法称为分离。 2、分离的目的在于从被检材料中、或者从 污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。
1)病料采集
病料：疑似细菌性疾病的水产养殖动物 以鱼为例，常见症状：体色发黑，体表溃 烂、充血、粘液增多，鳃、鳍破损，内脏 红肿，腹水，眼球凸出或浑浊，肛门红肿 等等。 活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中 的部位（上述症状） 病料死后→应立即采集，越早越好
生化鉴定管
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养 基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用
ATB Expression：自动化微生物鉴 定和药敏分析系统
分子生物学技术
分子生物学鉴定目前比较流行的主要是核 酸检测技术, 包括基因测序、指纹图谱技术、 基因探针技术、聚合酶链反应( PCR)、GC 含量测定等。
培养基的种类 ① 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物
质；可作为一些特殊培养基的基础成分（普通营养琼脂） ② 加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质
（如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对 营养要求高的微生物（2216E） ③ 选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性 不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生 长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物 的目的。（中国科学院海洋研究所专利：一种定量检测鳗弧 菌的选择性培养基及其制备）【利用鳗弧菌对氨苄青霉素的抗性 】 ④ 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养 基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物， 能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应； 从而达到区分不同的微生物。（TCBS）
Hale Waihona Puke 病料在接种培养基后，经过一段时间，应检查其 生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有， 则需进一步检查菌落是否纯一。形态特征包括： 大小、形状、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、 波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白 色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度 （不透明、半透明、透明等）和粘度等
细菌的分离、培养与鉴定
王欣欣
一、细菌的分离
1、从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的 方法称为分离。 2、分离的目的在于从被检材料中、或者从 污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。
1)病料采集
病料：疑似细菌性疾病的水产养殖动物 以鱼为例，常见症状：体色发黑，体表溃 烂、充血、粘液增多，鳃、鳍破损，内脏 红肿，腹水，眼球凸出或浑浊，肛门红肿 等等。 活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中 的部位（上述症状） 病料死后→应立即采集，越早越好
生化鉴定管
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养 基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用
ATB Expression：自动化微生物鉴 定和药敏分析系统
分子生物学技术
分子生物学鉴定目前比较流行的主要是核 酸检测技术, 包括基因测序、指纹图谱技术、 基因探针技术、聚合酶链反应( PCR)、GC 含量测定等。
培养基的种类 ① 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物
质；可作为一些特殊培养基的基础成分（普通营养琼脂） ② 加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质
（如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对 营养要求高的微生物（2216E） ③ 选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性 不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生 长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物 的目的。（中国科学院海洋研究所专利：一种定量检测鳗弧 菌的选择性培养基及其制备）【利用鳗弧菌对氨苄青霉素的抗性 】 ④ 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养 基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物， 能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应； 从而达到区分不同的微生物。（TCBS）
细菌培养鉴定及抗菌药物敏感试验PPT课件
头孢羟氨苄）
• 环丙沙星：二代喹诺酮类（氧氟沙星、洛美沙星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟沙星即氟 酸）
• 红霉素：大环内酯类 • 呋喃妥因（坦丁）：硝基呋喃类（目前由于更有效的低毒的喹诺酮类应用已受限） • 庆大霉素：氨基糖苷类 • 庆大霉素增效：氨苄西林、青霉素或万古霉素和氨基糖苷类抗生素联合有无协同作用 • 亚胺培南：碳青霉烯类（美洛培南、必安培南、帕尼培南） • 左旋氧氟沙星：第三代喹诺酮类（司帕沙星、妥舒沙星、左氟沙星） • 利奈唑胺：恶唑烷酮类 • 苯唑西林：耐酶青霉素（甲氧西林、萘夫西林、氯唑西林、氟氯西林） • 青霉素： • 哌拉西林/他唑巴坦：脲基组青霉素（美洛西林、阿洛西林哌拉西林）及β-内酰胺酶抑
制剂 • 利福平： • 链霉素增效：氨苄西林、青霉素活万古霉素和氨基糖苷类抗生素联合有无协同作用 • 辛内吉：奎奴普汀-达福普汀 • 复方新诺明：SMZ/TMP磺胺甲恶唑(SMZ)与甲氧苄啶(TMP)的复方制剂 • 四环素：对四环素S可推测多西环素和米诺环素S，但四环素R/I二者也可以S • 万古霉素：糖肽类（替卡拉宁）
• 肠球菌属：氨基糖苷类（除高浓度筛选外）、头孢菌素 类、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（复方新诺明） 耐药
• 鼠疫耶尔森菌：β-内酰胺类抗微生物药 • 鲍曼不动杆菌或无硝不动杆菌：所有氨基青霉素或Ⅰ、
Ⅱ代头孢或氯霉素，这两菌对以上抗生素天然耐药。 • 洋葱伯克霍尔德菌：氨基糖苷类抗生素或亚胺培南，该
• 2 .耐甲氧西林的凝固酶阴性的葡萄球菌（MRSCN）： 耐药机制与MRSA相同，多重耐用性比MRSA更为严 重。
17
3. 超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科（ESBL）：肠杆菌科的 大肠埃希氏菌，肺炎克雷伯菌，产酸克雷伯氏菌， 可以产生质粒介导的β-内酰胺酶，从而对β-内酰胺 类抗生素，特别是第三代头孢和氨曲南等耐药，但 是通常对于含有β-内酰胺酶抑制剂的复合药物如阿 莫西林/克拉维酸，氨苄西林/舒巴坦，头孢哌酮/舒 巴坦等敏感，对于四代头孢可能敏感或耐药，对亚 胺培南敏感，由于这种耐药机制有质粒介导，可以 在不同细菌之间传播，故其检出率逐渐升高。除了 上述几种细菌外在其他肠杆菌科甚至铜绿假单胞菌 中均有发现，目前看来，复方β-内酰胺类药物头孢 哌酮/舒巴坦（舒普深），哌拉西林/他唑巴坦（特 治星）效果较好，而阿莫西林/克拉维酸，氨苄西林 /舒巴坦的耐药性较高。
• 环丙沙星：二代喹诺酮类（氧氟沙星、洛美沙星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟沙星即氟 酸）
• 红霉素：大环内酯类 • 呋喃妥因（坦丁）：硝基呋喃类（目前由于更有效的低毒的喹诺酮类应用已受限） • 庆大霉素：氨基糖苷类 • 庆大霉素增效：氨苄西林、青霉素或万古霉素和氨基糖苷类抗生素联合有无协同作用 • 亚胺培南：碳青霉烯类（美洛培南、必安培南、帕尼培南） • 左旋氧氟沙星：第三代喹诺酮类（司帕沙星、妥舒沙星、左氟沙星） • 利奈唑胺：恶唑烷酮类 • 苯唑西林：耐酶青霉素（甲氧西林、萘夫西林、氯唑西林、氟氯西林） • 青霉素： • 哌拉西林/他唑巴坦：脲基组青霉素（美洛西林、阿洛西林哌拉西林）及β-内酰胺酶抑
制剂 • 利福平： • 链霉素增效：氨苄西林、青霉素活万古霉素和氨基糖苷类抗生素联合有无协同作用 • 辛内吉：奎奴普汀-达福普汀 • 复方新诺明：SMZ/TMP磺胺甲恶唑(SMZ)与甲氧苄啶(TMP)的复方制剂 • 四环素：对四环素S可推测多西环素和米诺环素S，但四环素R/I二者也可以S • 万古霉素：糖肽类（替卡拉宁）
• 肠球菌属：氨基糖苷类（除高浓度筛选外）、头孢菌素 类、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（复方新诺明） 耐药
• 鼠疫耶尔森菌：β-内酰胺类抗微生物药 • 鲍曼不动杆菌或无硝不动杆菌：所有氨基青霉素或Ⅰ、
Ⅱ代头孢或氯霉素，这两菌对以上抗生素天然耐药。 • 洋葱伯克霍尔德菌：氨基糖苷类抗生素或亚胺培南，该
• 2 .耐甲氧西林的凝固酶阴性的葡萄球菌（MRSCN）： 耐药机制与MRSA相同，多重耐用性比MRSA更为严 重。
17
3. 超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科（ESBL）：肠杆菌科的 大肠埃希氏菌，肺炎克雷伯菌，产酸克雷伯氏菌， 可以产生质粒介导的β-内酰胺酶，从而对β-内酰胺 类抗生素，特别是第三代头孢和氨曲南等耐药，但 是通常对于含有β-内酰胺酶抑制剂的复合药物如阿 莫西林/克拉维酸，氨苄西林/舒巴坦，头孢哌酮/舒 巴坦等敏感，对于四代头孢可能敏感或耐药，对亚 胺培南敏感，由于这种耐药机制有质粒介导，可以 在不同细菌之间传播，故其检出率逐渐升高。除了 上述几种细菌外在其他肠杆菌科甚至铜绿假单胞菌 中均有发现，目前看来，复方β-内酰胺类药物头孢 哌酮/舒巴坦（舒普深），哌拉西林/他唑巴坦（特 治星）效果较好，而阿莫西林/克拉维酸，氨苄西林 /舒巴坦的耐药性较高。
细菌鉴定图
革兰阴性杆菌
+
葡萄糖发酵
－
氧化酶
+
－
非发酵菌
弧菌科
肠杆菌科
2.表解法
将各种细菌及其多种特性列成矩阵表格，使相互的区别点十分明 显，便于分析比较。此法对于相互区别比较复杂的细菌，如肠杆 菌科的初步分属。
肠杆菌科初步分属
试验
埃希菌属 沙门菌属 克雷伯菌属 变形杆菌属
靛基质
＋
枸椽酸盐
－
硫化氢
－
葡萄糖酸盐 －
四.临床标本的采集与处理
对感染性疾病进行病原检查和鉴定，须 通过采集病人的标本，经系列实验，才 能获得明确的病原学诊断。标本质量的 好坏直接影响诊断结果的正误，不当的 标本可导致假阴性，假阳性结果的出现， 因此在标本采集，送检，保存等各个环 节都要规范操作，严格控制，是确保实 验结果准确可靠的前提。
苯丙氨酸
－
－／＋ ＋／－ ＋／－
－ －
－／＋ ＋ － ＋ －
＋／－ ＋／－ －／＋
－ ＋
3.数字编码鉴定法
编码是将某一细菌的全部生化反应结果转化成数字， 经查阅检索手册又可将该数字转化成细菌名称．
编码的原则是：鉴定细菌的各种微量生化反应管组成 系列试剂，将生化项目排序并依次进行分组，每组中 的每个试验都有其一个数值代码。试验阳性时结果用 其数值代码表示，试验阴性时结果用0表示，将每组中 各试验结果加起来得一总值，这样按顺序各组总值组 成的数码组合，即为检索编码。查编码手册，该编码 所对应的细菌名称即为鉴定结果。如肠杆菌科细菌生 化编码鉴定：
临床细菌室的任务：
是从临床感染标本中分离出病原菌并进行准确鉴定，同时指 导临床合理使用抗菌药物，为临床感染性疾病的诊断、治疗和流 行病学调查以及院内感染的监控提供可靠的依据.
+
葡萄糖发酵
－
氧化酶
+
－
非发酵菌
弧菌科
肠杆菌科
2.表解法
将各种细菌及其多种特性列成矩阵表格，使相互的区别点十分明 显，便于分析比较。此法对于相互区别比较复杂的细菌，如肠杆 菌科的初步分属。
肠杆菌科初步分属
试验
埃希菌属 沙门菌属 克雷伯菌属 变形杆菌属
靛基质
＋
枸椽酸盐
－
硫化氢
－
葡萄糖酸盐 －
四.临床标本的采集与处理
对感染性疾病进行病原检查和鉴定，须 通过采集病人的标本，经系列实验，才 能获得明确的病原学诊断。标本质量的 好坏直接影响诊断结果的正误，不当的 标本可导致假阴性，假阳性结果的出现， 因此在标本采集，送检，保存等各个环 节都要规范操作，严格控制，是确保实 验结果准确可靠的前提。
苯丙氨酸
－
－／＋ ＋／－ ＋／－
－ －
－／＋ ＋ － ＋ －
＋／－ ＋／－ －／＋
－ ＋
3.数字编码鉴定法
编码是将某一细菌的全部生化反应结果转化成数字， 经查阅检索手册又可将该数字转化成细菌名称．
编码的原则是：鉴定细菌的各种微量生化反应管组成 系列试剂，将生化项目排序并依次进行分组，每组中 的每个试验都有其一个数值代码。试验阳性时结果用 其数值代码表示，试验阴性时结果用0表示，将每组中 各试验结果加起来得一总值，这样按顺序各组总值组 成的数码组合，即为检索编码。查编码手册，该编码 所对应的细菌名称即为鉴定结果。如肠杆菌科细菌生 化编码鉴定：
临床细菌室的任务：
是从临床感染标本中分离出病原菌并进行准确鉴定，同时指 导临床合理使用抗菌药物，为临床感染性疾病的诊断、治疗和流 行病学调查以及院内感染的监控提供可靠的依据.
细菌的培养及鉴定 ppt课件
细菌的培养及鉴定
抗酸染色步骤
1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
细菌的培养及鉴定
抗酸染色步骤
2、染色包括初染、脱色、复染三步。
初染
脱色
复染
冲洗
冲洗
石炭酸复红维持 3-5’ 3%盐酸酒精30 ’’ ~1’
冲洗
干燥 油镜观察
细菌的培养及鉴定
美蓝复染1 ’
抗酸染色结果
抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。
细菌培养及鉴定
细菌的培养及鉴定
标本采集原则
1.及时采集微生物标本作病原学检查 2.在抗菌药物使用前采集标本 3.采样时严格执行无菌操作 4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂 5.采样后立即送检 6.送检标本应注明细菌来的培源养及和鉴定检验目的
咳痰方法
病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群 病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液 无痰可用3％～5％NaCl 5ml雾吸约5min导痰 以清晨第二口痰为佳 标本采集后放置时间不超过2小时
细菌的培养及鉴定
清洁中段尿液
尽量取早晨第一次尿液 嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人 ➢收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水
冲洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 ➢翻转包皮，清洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿
采集标本后立即送检！
细菌的培养及鉴定
常用的培养基种类和用途
细菌的培养及鉴定
革兰染色步骤
涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
细菌的培养及鉴定
固定的目的：
使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘 得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。
抗酸染色步骤
1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
细菌的培养及鉴定
抗酸染色步骤
2、染色包括初染、脱色、复染三步。
初染
脱色
复染
冲洗
冲洗
石炭酸复红维持 3-5’ 3%盐酸酒精30 ’’ ~1’
冲洗
干燥 油镜观察
细菌的培养及鉴定
美蓝复染1 ’
抗酸染色结果
抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。
细菌培养及鉴定
细菌的培养及鉴定
标本采集原则
1.及时采集微生物标本作病原学检查 2.在抗菌药物使用前采集标本 3.采样时严格执行无菌操作 4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂 5.采样后立即送检 6.送检标本应注明细菌来的培源养及和鉴定检验目的
咳痰方法
病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群 病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液 无痰可用3％～5％NaCl 5ml雾吸约5min导痰 以清晨第二口痰为佳 标本采集后放置时间不超过2小时
细菌的培养及鉴定
清洁中段尿液
尽量取早晨第一次尿液 嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人 ➢收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水
冲洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 ➢翻转包皮，清洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿
采集标本后立即送检！
细菌的培养及鉴定
常用的培养基种类和用途
细菌的培养及鉴定
革兰染色步骤
涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
细菌的培养及鉴定
固定的目的：
使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘 得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。
细菌的分型及其检测技术PPT课件
过夜增殖噬菌体。分离纯化单斑
3次，至平板噬斑形态大小一致
纯第化11页/共70页
11
• （三）噬菌体的增殖、保存
1、噬菌体增殖 液体增殖法：定时加入对数期菌体 固体增殖法：同时加大菌体和噬菌体的浓度 2、去除菌体
细菌滤器法和三氯甲烷法
3、噬菌体的保存
冷藏保存：无需防腐剂，分装后7d，不宜超过4w
冷冻干燥：2年
鉴定时不需活分析细菌在体外培养物中的代谢产物如厌氧菌产生的短链脂肪酸色谱图需氧菌的有机酸色谱图等临床标本中检出和鉴定细菌如检测脑脊液中的乳酸对细菌性脑膜炎做出明确诊断等热裂解气相色谱法鉴定细菌将样品干燥高温裂解碎片色谱图鉴定微生物如沙门菌属十种血清型鉴别高分辨气相色谱法分析冷冻条件下细菌的挥发性有机产物鉴定引起冷冻品腐败的微生物液相色谱法基于混合物中各组分对固定相和流动相亲和力的差异分离组分的
24
第24页/共70页
(二)培养基和抗菌药物纸片
1．抗菌药物纸片：商品化，选择直径为，吸水量为20μl的专用药敏纸片，用逐片 加样或浸泡方法使每片含药量达规定要求。含药纸片密封贮存于超低温冰箱。
2．培养基：水解酪蛋白（M-H）培养基是兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养 基，4℃保存。
25
第25页/共70页
16
第16页/共70页
第二节 细菌素分型技术
一、概述
• 细菌素(bacteriocin)
• 是某些细菌产生的蛋白质类抗菌物质，这种物质仅 对与产生菌亲缘关系近的细菌有抗菌作用，而对产 生菌本身不敏感。如大肠菌素、绿脓菌素、蜡样芽 胞杆菌素等。
• 抗生素
• 抗菌素是细菌、真菌等微生物在生长过程中为了生 存竞争需要而产生的化学物质,这种物质可保证其自 身生存,同时还可杀灭或抑制其它微生物。细菌产生 的有多粘菌素、抗菌肽等。
《细菌鉴定》PPT课件
特殊气味等
形态学观察
* 营养需求（血琼脂、巧克力、营养琼脂生长 情况）
* 胆盐耐受（麦康凯生长情况） * 万古霉素耐受（含万古霉素巧克力生长情况） * 液体培养基生长现象（菌膜、上半部生长、
均匀浑浊、下半部生长、沉淀） * 半固体动力现象（清晰、毛刷样、倒伞状）
生化反应
* OF试验 * 各种糖发酵试验、糖氧化试验 * 糖衍生物发酵（α/β-甲基葡萄糖、β-葡萄糖胺、
不同种群的细菌根据培养的难易以及实际操作 时的难度而采用不同的鉴定手段
* 目前技术能培养的细菌采用传统手段
* 难培养细菌采用分子生物学手段（如麻风分支杆菌、 肺炎支原体、肺炎衣原体等）
* 而传统手段难以进一步鉴定的细菌则采用抗原抗体 血清学分类（如军团菌、沙门菌、志贺菌等）、细 胞壁脂肪酸结构和组成分类（如棒状杆菌相关属）、 挥发性代谢产物（如厌氧菌挥发性脂肪酸）指纹分 析
血清学试验（不常用）
* 铜绿假单胞菌生物分型血清 * 脑膜炎奈瑟菌分型血清 * 隐球菌可溶血抗原血清 * 脑膜炎5种可溶性抗原复合乳胶
* b型流感嗜血杆菌乳胶 * 肺炎链球菌乳胶（含83个血清型的多价血清） * A群脑膜炎奈瑟菌乳胶 * B群脑膜炎奈瑟菌/大肠埃希菌K1乳胶 * C群脑膜炎奈瑟菌乳胶
然耐药反证法鉴定
形态学试验
G+菌 BA生长、Choc不生长、MecK不生长，——Gram染色： 分G+co（革兰阳性球菌） ,G+ b（革兰阳性杆菌）
G+co—依靠溶血特征，菌落形态、菌落颜色、菌体形 态区分:
▲葡萄球菌：淡黄色/白色，中等大小，较凸，规则 圆形，β/γ溶血，较湿润，除金黄色葡萄球菌外， 一般不具有临床意义；
血清学试验（不常用）
形态学观察
* 营养需求（血琼脂、巧克力、营养琼脂生长 情况）
* 胆盐耐受（麦康凯生长情况） * 万古霉素耐受（含万古霉素巧克力生长情况） * 液体培养基生长现象（菌膜、上半部生长、
均匀浑浊、下半部生长、沉淀） * 半固体动力现象（清晰、毛刷样、倒伞状）
生化反应
* OF试验 * 各种糖发酵试验、糖氧化试验 * 糖衍生物发酵（α/β-甲基葡萄糖、β-葡萄糖胺、
不同种群的细菌根据培养的难易以及实际操作 时的难度而采用不同的鉴定手段
* 目前技术能培养的细菌采用传统手段
* 难培养细菌采用分子生物学手段（如麻风分支杆菌、 肺炎支原体、肺炎衣原体等）
* 而传统手段难以进一步鉴定的细菌则采用抗原抗体 血清学分类（如军团菌、沙门菌、志贺菌等）、细 胞壁脂肪酸结构和组成分类（如棒状杆菌相关属）、 挥发性代谢产物（如厌氧菌挥发性脂肪酸）指纹分 析
血清学试验（不常用）
* 铜绿假单胞菌生物分型血清 * 脑膜炎奈瑟菌分型血清 * 隐球菌可溶血抗原血清 * 脑膜炎5种可溶性抗原复合乳胶
* b型流感嗜血杆菌乳胶 * 肺炎链球菌乳胶（含83个血清型的多价血清） * A群脑膜炎奈瑟菌乳胶 * B群脑膜炎奈瑟菌/大肠埃希菌K1乳胶 * C群脑膜炎奈瑟菌乳胶
然耐药反证法鉴定
形态学试验
G+菌 BA生长、Choc不生长、MecK不生长，——Gram染色： 分G+co（革兰阳性球菌） ,G+ b（革兰阳性杆菌）
G+co—依靠溶血特征，菌落形态、菌落颜色、菌体形 态区分:
▲葡萄球菌：淡黄色/白色，中等大小，较凸，规则 圆形，β/γ溶血，较湿润，除金黄色葡萄球菌外， 一般不具有临床意义；
血清学试验（不常用）
细菌学检验ppt课件
·
8
二、染色标本
（一）常用染料 1．碱性染料：碱性复红、结晶紫、美蓝等 2．酸性染料：有伊红、刚果红等 3．复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料有
瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青） 等；荧光染料有荧光标记的抗体
11.12.2020
·
9
革兰染色（gram stain） 方法：
（二）常用的染色方法
1、结晶紫初染
1 min
2、卢戈氏碘液媒染 1 min
革兰阳性球菌
3、95％酒精脱色 30sec～1 min
4、稀释石炭酸复红复染 1 min
原理：
G+等电点低，带正电荷的碱性燃 料作色牢固
G+细胞壁肽聚糖层多，G-细胞壁 脂质含量高
G+含有多量核糖核酸镁盐与结晶 紫、碘结合成大分子复合物
革兰阴性杆菌
11.12.2020
·
16
(一)培养基的组成成分
1．营养物质 蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖类、醇类、血液、 无机盐类、鸡蛋和动物血清生长因子
2．凝固物质 琼脂、明胶、卵白
3．抑制剂和指示剂 胆盐、蔷薇酸等，酚红、中性红、溴甲酚紫等
11.12.2020
·
17
（二）培养基种类
1．基础培养基（based medium） 2．营养培养基（nutrient medium） 3．鉴别培养基（differential medium） 4．选择培养基（selective medium） 5．特殊培养基（special medium）
11.12.2020
·
18
1．基础培养基（based medium）
含有大所属细菌生长所需 的基本营养成分，最常用的是 肉浸液，俗称肉汤（broth）， 主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。 用于培养一般细菌
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
卢先雷
1
概论
学习本课件我们主要掌握和了解的内容：
* 什么是细菌系统鉴定？ * 细菌系统鉴定与细菌系统分类学 * 细菌系统鉴定手段（方法学） * 细菌系统鉴定流程与鉴定试验的基本组合 * 鉴定试验的质量控制 * 小结与练习
2
细菌系统鉴定的定义
* 以细菌系统分类学为原则，根据细菌某些 生物学性状的差异，挑选一些具有较高鉴 别作用的试验，经过精简与优化组合，用 以测定未知细菌，得出试验结果，再与已 知细菌数据库进行比较，从而推断未知细 菌在分类体系中位置的方法。
4
细菌系统分类学的经典书籍
* BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology（《伯杰氏系统细菌学手册》） 是研究细菌系统分类学的全球经典书籍
5
6
细菌分类单元
−域
−界
−门
−纲
7
细菌系统分类法
* 传统分类法
* 林奈分类原理：偏重原理
* 数值分类法
* 目前技术能培养的细菌采用传统手段 * 难培养细菌采用分子生物学手段（如麻风分支杆菌、
肺炎支原体、肺炎衣原体等） * 而传统手段难以进一步鉴定的细菌则采用抗原抗体
血清学分类（如军团菌、沙门菌、志贺菌等）、细 胞壁脂肪酸结构和组成分类（如棒状杆菌相关属）、 挥发性代谢产物（如厌氧菌挥发性脂肪酸）指纹分 析 * 其他：如细胞壁蛋白电泳分类、细胞壁多糖分子与 肽聚糖结构分类等
22
酶速率法
* 梅里埃VITEK2 compact
* 可见光色源酶底物如对硝基苯胺（金黄色）作为 呈色基团
* BD Phoenix 100快速卡
* 荧光色源酶底物如荧光香豆素、4-甲基-7-羟基-香 豆素衍生物，可见光色源如对硝基苯胺（金黄色） 作为呈色基团
原理：底物-色源复合物(无色) 待检酶 游离色源 水解底物
* 细菌鉴定是细菌分类学的一种实践应用， 要掌握细菌鉴定，必须掌握系统分类学。
3
细菌系统分类学
* 细菌系统分类学是为研究目前已知细菌在 亲缘关系上远近程度而建立起来的一整套 分类方案。
* 使用该方案我们不仅可以了解一株未知分 离菌在已知分类单元中的最佳匹配位置， 还可以快速而准确的发现新种，并将之归 入对应的位置。
25
26
MALDI-TOF指纹图谱
27
细菌鉴定试验、流程 与鉴定试验的基本组合
* 鉴定试验 * 试验流程 * 试验的选择与组合
28
鉴定试验
* 形态学观察 * 生化反应试验 * 血清学试验 * 分型试验
* 血清学分型 * 噬菌体分型（不常用） * 细菌素分型（不常用）
* 动物试验（普通临床实验室不用）
9
细菌之间亲缘关系表示方法
* 相似系数矩阵图（数值分类法） * 树状拓扑学（综合分类法）
* 系统发育树 * 放射树 * 基础树
* 生物群落图（新的表示方法，尚未一致认 可）
10
相似系数矩阵图
11
树状拓扑学
12
细菌鉴定手段（方法学）
* 细菌鉴定的基本思想方法基于分类学 * 所采用的鉴定试验取自于分类学，根据被
* 可见光色源酶底物——梅里埃V2C * 荧光色源酶底物——BD Phoenix 100快速卡
16
数字编码鉴定法原理
1、形成数据库
17
2、将试验结果转化为反应数值
18
3、分别计算每个分类单元出现所测 定反应谱型的概率
19
4、计算鉴定符合百分率（id%）与模 式频率（T值）
20
5、根据id%、相邻id%比值、T值进行 降序排序
研究对象群体的不同，挑选和优化组合， 选择出适合于临床实验室操作的鉴别能力 强、可行性高的试验用于鉴定 * 根据试验的选择组合与这些试验操作时具 体的指导思想方法、应用流程，以及借助 工具的不同将细菌鉴定方法分成了几个不 同阶段
13
不同种群的细菌根据培养的难易以及实际操作 时的难度而采用不同的鉴定手段
23
酶速率法原理
OD cutoff
α
t
V=Δy/Δx=tanα V＞cutoff = “+” V＜cutoff = “-”
24
MALDI-TOF 基质辅助激光解吸电离飞行时间
* 原理：检测来自完整细菌的蛋白质构成。 先将待测样本与基质混合，均匀涂布在样 品板上，放入MS仪器。基质吸收来自激 光的能量，与样本一起蒸发，与此同时将 样本电离。带电样本通过电场进入飞行时 间检测器，离子依质荷比不同而分离，最 终可以在飞行管的末端检测到每个离子的 丰度。 通过查阅比对内置指纹图谱数据库即可 得出鉴定结果
29
形态学观察
镜下形态学观察：
• 不染色标本
• 染色后镜下形态
– 暗视野动力观察
– Gram染色
– 念珠菌孢子和菌丝的 观察
– 丝状真菌小培养动态 观察
– L型菌落与特殊细菌 菌落解剖结构
– 抗酸染色 – 异染颗粒染色 – 荧光染料染色 – 荧光抗体染色 – 乳酸酚棉兰染色 – 墨汁染色
30
形态学观察
14
细菌鉴定方法学分类
* 传统手段——表型鉴定 * 分子生物学手段——基因型鉴定 * 抗原抗体、细胞壁成分、代谢产物指纹等
手段——分子鉴定
15
细菌表型鉴定方法学
* 表型鉴定方法学分类与历程： * 传统林奈双岐图表法
* 双歧索引法 * 表解法
* 数字编码鉴定法
* 手工查表 * 仪器鉴定
* 酶速率法
* 100~200项生理生化特征相似度（百分率）： 等重原理
* 综合分类法
* 生理生化、遗传物质、化学分子比较等手段 综合应用
8
细菌系统分类学手段
* 表型特征分类 * 形态学分类 * 生物化学代谢途径分类 * 噬菌体生物学分类
* 遗传特征分类 * DNA结构分类 * RNA结构分类
* 分子结构分类 * 抗原抗体血清学分类 * 细胞壁多糖分子与肽聚糖结构分类 * 细胞壁脂肪酸结构和组成分类 * 细胞壁蛋白电泳分类
21
6、结果评价
1、仪器只显示唯一结果，说明结果该鉴定能到到种的水平 2、如果提示两个以上结果，但都是同一个属的细菌。则说明该鉴 定只能达到属的水平 3、如果鉴定id%＜80%，则结果不可靠 4、如果仪器提示结果不可接受，则说明 1）试条/卡选择错误 2）分离菌不适合采用该方法 3）菌不纯，特别是显示出大于两项生化反应结果不符合时。
菌落形态观察：
* 大小（细如针尖、小、中等、大） * 质地（坚硬、干燥、湿润、水滴状） * 光滑程度（粗糙、光滑、粘液型） * 凹凸（扁平、微凸、凸起、中性凹陷） * 颜色（白色、灰色、黄色、绿色、红色、黑色等） * 透明程度（透明、半透明、不透明） * 边缘（整齐、星状、有伪足、枫叶状、树叶状等） * 溶血性（α、β、γ） * 其他、琼脂凹陷、气生菌丝、菌落背面颜色、菌落
1
概论
学习本课件我们主要掌握和了解的内容：
* 什么是细菌系统鉴定？ * 细菌系统鉴定与细菌系统分类学 * 细菌系统鉴定手段（方法学） * 细菌系统鉴定流程与鉴定试验的基本组合 * 鉴定试验的质量控制 * 小结与练习
2
细菌系统鉴定的定义
* 以细菌系统分类学为原则，根据细菌某些 生物学性状的差异，挑选一些具有较高鉴 别作用的试验，经过精简与优化组合，用 以测定未知细菌，得出试验结果，再与已 知细菌数据库进行比较，从而推断未知细 菌在分类体系中位置的方法。
4
细菌系统分类学的经典书籍
* BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology（《伯杰氏系统细菌学手册》） 是研究细菌系统分类学的全球经典书籍
5
6
细菌分类单元
−域
−界
−门
−纲
7
细菌系统分类法
* 传统分类法
* 林奈分类原理：偏重原理
* 数值分类法
* 目前技术能培养的细菌采用传统手段 * 难培养细菌采用分子生物学手段（如麻风分支杆菌、
肺炎支原体、肺炎衣原体等） * 而传统手段难以进一步鉴定的细菌则采用抗原抗体
血清学分类（如军团菌、沙门菌、志贺菌等）、细 胞壁脂肪酸结构和组成分类（如棒状杆菌相关属）、 挥发性代谢产物（如厌氧菌挥发性脂肪酸）指纹分 析 * 其他：如细胞壁蛋白电泳分类、细胞壁多糖分子与 肽聚糖结构分类等
22
酶速率法
* 梅里埃VITEK2 compact
* 可见光色源酶底物如对硝基苯胺（金黄色）作为 呈色基团
* BD Phoenix 100快速卡
* 荧光色源酶底物如荧光香豆素、4-甲基-7-羟基-香 豆素衍生物，可见光色源如对硝基苯胺（金黄色） 作为呈色基团
原理：底物-色源复合物(无色) 待检酶 游离色源 水解底物
* 细菌鉴定是细菌分类学的一种实践应用， 要掌握细菌鉴定，必须掌握系统分类学。
3
细菌系统分类学
* 细菌系统分类学是为研究目前已知细菌在 亲缘关系上远近程度而建立起来的一整套 分类方案。
* 使用该方案我们不仅可以了解一株未知分 离菌在已知分类单元中的最佳匹配位置， 还可以快速而准确的发现新种，并将之归 入对应的位置。
25
26
MALDI-TOF指纹图谱
27
细菌鉴定试验、流程 与鉴定试验的基本组合
* 鉴定试验 * 试验流程 * 试验的选择与组合
28
鉴定试验
* 形态学观察 * 生化反应试验 * 血清学试验 * 分型试验
* 血清学分型 * 噬菌体分型（不常用） * 细菌素分型（不常用）
* 动物试验（普通临床实验室不用）
9
细菌之间亲缘关系表示方法
* 相似系数矩阵图（数值分类法） * 树状拓扑学（综合分类法）
* 系统发育树 * 放射树 * 基础树
* 生物群落图（新的表示方法，尚未一致认 可）
10
相似系数矩阵图
11
树状拓扑学
12
细菌鉴定手段（方法学）
* 细菌鉴定的基本思想方法基于分类学 * 所采用的鉴定试验取自于分类学，根据被
* 可见光色源酶底物——梅里埃V2C * 荧光色源酶底物——BD Phoenix 100快速卡
16
数字编码鉴定法原理
1、形成数据库
17
2、将试验结果转化为反应数值
18
3、分别计算每个分类单元出现所测 定反应谱型的概率
19
4、计算鉴定符合百分率（id%）与模 式频率（T值）
20
5、根据id%、相邻id%比值、T值进行 降序排序
研究对象群体的不同，挑选和优化组合， 选择出适合于临床实验室操作的鉴别能力 强、可行性高的试验用于鉴定 * 根据试验的选择组合与这些试验操作时具 体的指导思想方法、应用流程，以及借助 工具的不同将细菌鉴定方法分成了几个不 同阶段
13
不同种群的细菌根据培养的难易以及实际操作 时的难度而采用不同的鉴定手段
23
酶速率法原理
OD cutoff
α
t
V=Δy/Δx=tanα V＞cutoff = “+” V＜cutoff = “-”
24
MALDI-TOF 基质辅助激光解吸电离飞行时间
* 原理：检测来自完整细菌的蛋白质构成。 先将待测样本与基质混合，均匀涂布在样 品板上，放入MS仪器。基质吸收来自激 光的能量，与样本一起蒸发，与此同时将 样本电离。带电样本通过电场进入飞行时 间检测器，离子依质荷比不同而分离，最 终可以在飞行管的末端检测到每个离子的 丰度。 通过查阅比对内置指纹图谱数据库即可 得出鉴定结果
29
形态学观察
镜下形态学观察：
• 不染色标本
• 染色后镜下形态
– 暗视野动力观察
– Gram染色
– 念珠菌孢子和菌丝的 观察
– 丝状真菌小培养动态 观察
– L型菌落与特殊细菌 菌落解剖结构
– 抗酸染色 – 异染颗粒染色 – 荧光染料染色 – 荧光抗体染色 – 乳酸酚棉兰染色 – 墨汁染色
30
形态学观察
14
细菌鉴定方法学分类
* 传统手段——表型鉴定 * 分子生物学手段——基因型鉴定 * 抗原抗体、细胞壁成分、代谢产物指纹等
手段——分子鉴定
15
细菌表型鉴定方法学
* 表型鉴定方法学分类与历程： * 传统林奈双岐图表法
* 双歧索引法 * 表解法
* 数字编码鉴定法
* 手工查表 * 仪器鉴定
* 酶速率法
* 100~200项生理生化特征相似度（百分率）： 等重原理
* 综合分类法
* 生理生化、遗传物质、化学分子比较等手段 综合应用
8
细菌系统分类学手段
* 表型特征分类 * 形态学分类 * 生物化学代谢途径分类 * 噬菌体生物学分类
* 遗传特征分类 * DNA结构分类 * RNA结构分类
* 分子结构分类 * 抗原抗体血清学分类 * 细胞壁多糖分子与肽聚糖结构分类 * 细胞壁脂肪酸结构和组成分类 * 细胞壁蛋白电泳分类
21
6、结果评价
1、仪器只显示唯一结果，说明结果该鉴定能到到种的水平 2、如果提示两个以上结果，但都是同一个属的细菌。则说明该鉴 定只能达到属的水平 3、如果鉴定id%＜80%，则结果不可靠 4、如果仪器提示结果不可接受，则说明 1）试条/卡选择错误 2）分离菌不适合采用该方法 3）菌不纯，特别是显示出大于两项生化反应结果不符合时。
菌落形态观察：
* 大小（细如针尖、小、中等、大） * 质地（坚硬、干燥、湿润、水滴状） * 光滑程度（粗糙、光滑、粘液型） * 凹凸（扁平、微凸、凸起、中性凹陷） * 颜色（白色、灰色、黄色、绿色、红色、黑色等） * 透明程度（透明、半透明、不透明） * 边缘（整齐、星状、有伪足、枫叶状、树叶状等） * 溶血性（α、β、γ） * 其他、琼脂凹陷、气生菌丝、菌落背面颜色、菌落