正交设计法优选银杏叶黄酮类化合物提取工艺的研究

根据银杏叶主要化学成分性质、预试验的结果及生产实 际，确定银杏叶的提取溶剂为 70%乙醇。 对影响醇提取工艺 的主要因素（A 代表固液比、B 代表提取温度、C 代表浸取剂 pH 值）按三因素三水平进行 L9（34）正交试验 ，以提取液中总 黄酮含量为评价指标，实验结果采用直观分析法和方差分析 法综合评价。 各因素水平安排见表 1，正交试验结果见表 2， 方差分析见表 3。
6
1
1
Ⅰ
77.13 125.6 147.8 147.87
147.87
Ⅱ 165.04 145.87 144.27 132.54
132.54
Ⅲ 181.77 152.47 131.87 143.53
143.53
R
104.64 26.87 15.93 15.33
15.33
表 3 方差分析表
Tab.3 Variance analysis
称 取 干 燥 并 粉 碎 的 银 杏 叶 10.0 g， 置 于 回 流 冷 凝 装 置 中，每次加入 70%乙醇 100 ml，70℃浸取 4 次，每次 3 h，滤取 浸提液后分别测定总黄酮含量，第 1、2、3、4 次结果分别为 53.36、25.80、9.40、6.52 mg/g。 从以上实验结果可知，前 3 次总 黄酮含量总和占 4 次总量的 93.14%，据此，提取次数可确定 为 3 次。 2 结果 2.1 实验结果
方差来源 离差平方和 自由度 方差
A
2 106.39
2
1 053.19
F值 50.60
B
130.71
2
65.35
3.14
C
46.66
2
23.33
1.12
D
41.62
2
F0.05(2,2)=19
20.81
-
P值 <0.05 >0.05 >0.05
[作者简介] 陈登丰，副主任中药师，主要从事中药制剂及医院药学。
溶液 1 ml，混匀，放置 6 min，加 10%硝酸铝溶液 1 ml，摇 匀 ， 放 置 6 min ， 加 10% 氢 氧 化 钠 试 液 10 ml ， 再 加 水 定 容 至 25 ml，摇匀，放置 15 min。 1.2.4 测 定 波 长 的 确 定 取 对 照 品 溶 液 2.5 ml 置 25 ml 量 瓶 中 ， 加 水 至 6.0 ml ， 加 5% 亚 硝 酸 钠 溶 液 1 ml ， 混 匀 ， 放 置 6 min，加 10%硝 酸 铝 溶 液 1 ml，摇 匀 ，放 置 6 min，加 10%氢 氧化钠试液 10 ml，再加水定 容 至 25 ml，摇 匀 ，放 置 15 min， 以相应试剂为空白对照，按照紫外-可见分光光度法（中国药 典 2010 版 一 部 附 录ⅤA），于 400～600 nm 波长 范 围 内 扫 描, 结果在 510 nm 处有最大吸收。 1.2.5 标准 曲 线 的 制 备 精 密 量 取 芦 丁 对 照 品 溶 液 0.2、0.5、 1.0、1.5、2.0 ml 分别置 25 ml 量瓶中，各加水至 6.0 ml，加 5% 亚 硝 酸 钠 溶 液 1 ml， 混 匀 ， 放 置 6 min， 加 10% 硝酸铝溶液 1 ml，摇匀，放置 6 min，加 10%氢氧化钠试液 10 ml，再加水至刻 度，摇匀，放置 15 min，以相应试剂为空白对照 ，按照紫外-可 见分光光度法（中国药典 2010 版一部附录ⅤA），在 510 nm 波 长处 测 吸 光 度 ，以 吸 光 度 （A）为 纵 坐 标 ，溶 液 浓 度 （C ） 为 横 坐 标 ， 绘 制 标 准 曲 线 。 得 回 归 方 程 ：A=36.14C+0.0023 ，r= 0.999 9，提示 ，芦 丁 浓 度 与 吸 收 度 在 0.002 4～0.042 0 mg/ml 范围内符合比尔定律，有良好的线性关系。 1.3 方法学考察
银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶，其主要化学成分为 黄酮类和萜内酯类化合物。 银杏黄酮类化合物可以扩张血 管，增加冠状动脉及脑血管流量，降低血黏度，改善微循环， 是治疗心脑血管疾病的有效药物。 萜内酯是血小板活化因子 （PAF）受体特异性 拮 抗 剂[1]。 银 杏 叶 中 黄 酮 类 化合 物 的 提 取 率直接决定银杏叶的药用价值，因而银杏叶的提取工艺已成 为国内外的研究热点[2-6]。 本文以银杏总黄酮的提取率为指标 对银杏叶提取物的提取和精制工艺进行研究，根据实际生产 条件，采用 70%乙醇为提取剂，对影 响 浸 取 的 主 要 因 素 进行 了研究，旨在提高银杏总黄酮的提取率及产品的质量。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂
表 2 正交试验结果
Tab.2 Results of orthogonal tests
编号
A
B
1
1∶5
40
C D（空白） 总黄酮含量(mg/g）
4
1
1
2
1∶5
55
6
2
2
3
1∶5
70
8
3
3
4
1∶10
40
6
3
3
5
1∶10
55
8
1
1
6
1∶10
70
4
2
2
7
1∶15
40
8
2
2
8
1∶15
55
4
3
3
9
1∶15
70
制剂与技术
2010 年 6 月第 17 卷第 16 期
正交设计法优选银杏叶黄酮类化合物 提取工艺的研究
陈登丰 1，李烈辉 2，罗茂玉 3 （1.福建省南平市人民医院，福建南平 353000；2.福建省寿宁县医院，福建寿宁
3.福建医科大学附属龙岩第一医院，福建龙岩 364000）
355500；
[摘要] 目的：采用正交设计法对银杏叶黄酮类化合物提取工艺参数进行优化。 方法：通过以分光光度法测定黄酮含
[文献标识码] C
[文章编号] 1674-4721（2010）06（a）-134-02
Optimization of the extration of technology of the flavonoids from leaves of Ginkgo biloba by orthogonal design
称取干燥并粉碎的银杏叶 10.0 g，置于回流冷凝装置中， 加入一定量的 70%乙醇，在一定温度和 pH 条件下浸取 3 h， 滤取浸提液后适当浓缩并用 70%乙 醇 定 容 至 100 ml，摇 匀 。 精 密 量 取 10 ml，置 100 ml 量 瓶 中 ，加 水 定 容 至 100 ml，摇 匀。 精密量取 3 ml，置 25 ml 量瓶中，照标准曲线制备项下的 方法，自“加水至 6.0 ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上 读出供试品溶液中含芦丁的重量，计算，即得。 本品按干燥品 计算，含总黄酮以芦丁计。 1.5 提取次数确定
紫外 分 光 光 度 计 ：UV-2540（岛 津 ）紫 外 分 光 光 度 计 ；芦 丁（化学对 照 品 ）批 号 ：080-9303，中 国 药 品 生 物制 品 检 定 所 提供；乙醇、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠等试剂均为 AR 级。 1.2 实验方法 1.2.1 银杏总黄酮含量测定 参照文献[7]，采用分光光度法。 1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取经 105℃干燥至恒重的芦 丁 对 照 品 10.5 mg，置 50 ml 量 瓶 中 ，加 70%乙 醇 适 量 ，置 水 浴箱上微热使其溶解，放置冷却，加 70%乙 醇 定 容 至 50 ml， 摇匀，即得（每毫升中含无水芦丁 0.21 mg）。 1.2.3 空白对照溶液的制备 取 20 ml 量瓶 ，加 5%亚 硝 酸钠
稳定性试验：取样品溶液，每隔 0.5 h 测定紫外吸收度， 6 次测定芦丁吸收度的 RSD 为 0.17%，表明样品溶液在 3 h 内
134 中国当代医药 CHINA MODERN MEDICINE
2010 年 6 月第 17 卷第 16 期
制剂与技术
基本稳定。 精密度试验：取同一样品溶液，反复测定 5 次， RSD 为 0，表明仪器精密度良好。 重现性试验：分别取同一批 号的 样 品 4 ml，共 6 份 ，照 测 定 方 法 操 作 ，结 果 平 均 含 芦 丁 39.68 mg/g，RSD 为 2.36%。加 样 回 收 率 试 验 ：取 25 ml 量 瓶 7 只，1～6 号中分别精 密 加 入 对 照 品 溶 液 0.5 ml，2～7 号 中分 别加样品液 4 ml，1~7 号中均加 5%亚硝酸钠溶液 1 ml， 混匀， 放 置 6 min，加 10% 硝 酸 铝 溶 液 1 ml， 摇 匀 ， 放 置 6 min， 加 10%氢氧化钠试液 10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置 15 min， 以相应试 剂 为 空 白 对 照 ，在 510 nm 波 长 处 测 吸 光 度 ，n=5， 结果平均回收率为 100.27%（RSD=1.22%）。 1.4 测定方法
表 1 因素水平表
Tab.1 Levels of factors
水平
A
B（℃）
C
1
1:5
40
8
2
1:10
55
6
3
1:15
70
4
从表 2 直观分析可知，以总黄酮含量为指标，极差（R）最 大的为 A 因素，对总黄酮含量影响排序是 ：A>B>C；同时表 3 方差分析显示，A 因素对总黄酮含量具有显著性影响。 由各 因素水平的高低选取最佳提取工艺 条 件 是 A3B3C1，即 固 液 比 1∶15、提 取 温 度 70℃、浸 取 剂 pH 值 为 8。 浸 取 剂 pH 值 对 浸 取率影响最小，但从实验结果明显可知，pH 值为 8 时浸取率 较高，结合黄酮类化合物结构分析，大多数黄酮及其苷具有 酚羟基，为弱酸性化合物，因此它们在碱性溶剂中溶解度增