青石斑鱼MHCclassI基因的克隆与分析

合集下载

(细胞生物学专业优秀论文)斑马鱼新基因KLP的克隆、分析及功能研究

结果１、异种同源基因的血清学筛选及鉴定以人脐静脉内皮细胞免疫获得的抗血清为筛选血清，采用ＳＥＲＥＸ方法筛选斑马鱼心脏ｅＤＮＡ文库。

噬菌斑内的重组蛋白转移到硝酸纤维素膜上经显色反应后背景呈浅紫色，阴性噬菌斑呈较淡的噬菌斑影，阳系的噬菌斑呈紫红色：筛选过程重复２—３次以排除假阳性结果。

通过斑马鱼心脏ｅＤＮＡ文库的两轮筛选获得了２２个阳性克隆，然后通过内部剪切使噬菌体转变呈噬粒以鉴定。

琼脂糖凝胶电泳结果显示，插入片断大小大部分集中于１０００ｂｐ左右。

图１左图箭头所指为ＳＥＲＥＸ阳性克隆，右图为ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ噬菌粒经ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ双酶切表２基因号人同源基因名称阳性频率功能注释ＤＬｌ６３２９Ｈｓ．３５０９６４ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒａｎｄＢＴＢｄｏｍａｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ４Ｄｒ３５ｃｒ７２Ｈｓ．２２７６０２２ｒｅｇｕｌａｔｅｏｆｎｕｃｌｅｒ删＾—ｂｉｎｄｇｉｎｇｐｅｒ－姝Ｎ＾ｍｏｔｉｆｐｒｏｔｅｉｎ１６未知基因（６个克隆。

２个基因）图２阳性克隆基因的功能分类３、新基因全长的克隆获得完整的ＯＲＦ是基因功能研究的第一步。

我们选择了一个基因作为重点研究对象：斑马鱼ＫＬＰ（ＫａｉＳＯＬｉｋｅ）基因，我们采用的电子克隆策略。

直接测序得到的斑马鱼ｅｓｔ序列长６４７ｂｐ，我们采用了基于基因组序列的直接预测策略。

通过与斑马鱼基因组序列的对比，可知该基于位于１２染色体的ＮＷ－－６３３３８０（共２３２５３７ｂｐ）的４６１６１－－４７０７９ｂｐ处。

选取该序列前后各３ｋｂ序列，运用ＧＥＮＥＳＣＡＮ和ＴＷＩＮＳＣＡＮ测序其中可能包含的基因，包含已知ＥＳＴ序列的预测结果即为可能的基因，长４７２５ｂｐ，编码１５７４个氨基酸。

再与Ｄｒ．１６３２９中的ＥＳＴ序列对比，通过与Ｃ０９２３１４７的序列拼接获得一长５１７１ｂｐ的基因序列，５’端延长３９５ｂｐ，编码区不变。

起始密码子周围序列为ｃｃｈａｔｇＡ，符合ｋｏｚａｋ规则，－－５７位存在终止密码予ＴＧＡ，据此可以确定已得到该基因完整的编码区。

赤点石斑鱼MHC IA基因的克隆与表达多态性分析

赤点石斑鱼MHC IA基因的克隆与表达多态性分析沈铭辉;郑乐云;杜佳莹;王军【摘要】The major histocompatibility complex molecules (MHC I and MHC II) are fundamental components of imumune response to foreign protein antigens,and occur extensively in all vertebrate organisms. For the first time,4 complete cDNA sequences of MHC class IA chain, one of the important non-specific immune genes, were obtained from Epinephelus akaara by RACE technique. The whole sequences had 1 680 bp, which consist of: a 3' UTR, promoters, a peptide-binding region (a1), an immunoglobulin-like region (a2) ,a transmembrane region,a cytoplasmic region and 5'UTR,and the size of their coding region is 1 074-1 080 bp, which encode a 155 amino acid protein and has a molecular weight about 30. 25 ku. The tested gene has classic MHC 3D molecular structure,and exhibits abundant polymorphisms in the peptide-binding region. Using realtime PCR and SSCP technique, the MHC IA gene was observed to be expressed in all the 12 tissues studied in this paper,and high levels of expression and polymorphism were observed in immune organs such as head-kidney,spleen and thymus,while in organs such as gills and muscles that are more likely to be frequently exposed to bacterial antigens, the expression and polymorphism levels were lower. Furthermore, a phylogenetic tree was also constructed based on Neighbour-joining methods with IGC region of MHC IIB gene. The satisfactory result also meaned that the amino acid sequence of the IGC region of MHC IA shouldbe potentially informative for phylogenetic studies in fishes.%采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)非特异性免疫因子MHC IA基因的4个cDNA全序列,序列全长为1680 bp,含有3'UTR、启动子、多肽结合区(α1)、IGC区(α2)、跨膜区、胞质区和5'UTR区,编码区大小为1074～1080 bp,共编码357～359个氨基酸,推测蛋白质分子质量约41.66 ku.氨基酸序列分析发现赤点石斑鱼MHCIA分子具有经典MHC蛋白分子的空间结构,在多肽结合区则存在极其丰富的变异.利用Real time PCR和SSCP技术研究了赤点石斑鱼MHC IA 的组织表达特异性和表达多态性,发现其在头肾、心、肝等12个组织器官中均能有效表达,在头肾,脾,胸腺等免疫组织表达量不仅高,表达多态性也异常丰富,而在与外界环境接触较多的鳃、肌肉、肠等组织表达较弱.此外,根据MHC ⅡB分子中相对保守的IGC区氨基酸序列构建了脊椎动物的系统进化树,也表明了该分子的IGC区氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好标记.【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(052)001【总页数】6页(P103-108)【关键词】赤点石斑鱼;MHC IA基因;多态性【作者】沈铭辉;郑乐云;杜佳莹;王军【作者单位】厦门大学海洋与地球学院,福建厦门 361005;福建省水产研究所,福建厦门 361013;厦门大学海洋与地球学院,福建厦门 361005;厦门大学海洋与地球学院,福建厦门 361005【正文语种】中文【中图分类】S965.334主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）由紧密连锁的高度多态基因位点所组成，广泛存在于脊椎动物体内，与免疫密切相关并编码免疫球蛋白样受体，其产物是免疫系统中极为复杂且最具多态性的一类细胞表面转膜蛋白，统称为MHC分子［1－2］.MHC由3类分子组成，其中 MHC I类分布在所有有核细胞表面，负责内源性抗原（如肿瘤抗原和病毒抗原）的加工和呈递.自Hashimoto等［3］首次获得鲤鱼MHC基因序列以来，目前已对斑马鱼、牙鲆等多种鱼类的MHC基因进行了结构与功能探讨，为研究MHC基因家族在鱼类天然免疫体系中的作用提供了重要参考.赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）是我国名贵的经济鱼类，但目前其野生资源已遭极大破坏，被世界自然保护联盟（IUCN）列为濒危物种.通过人工繁育养殖减轻捕捞压力，对保护和恢复其资源具有重要意义.但是赤点石斑鱼养殖一直存在着育苗死亡率过高、病害严重等问题，尤其石斑鱼神经坏死病毒（NNV）是赤点石斑鱼的主要病原，对赤点石斑鱼的养殖破坏极大［4］.目前对石斑鱼免疫相关基因的研究已有一些报道［5］，但尚未见对内源性抗原（病毒抗原）起主要递呈作用的MHC I类基因的相关研究.本研究以赤点石斑鱼为研究对象，通过RACE技术克隆获得了MHC IA基因的cDNA全序列，并且对其组织表达特异性和多态性进行检测，以期为进一步研究赤点石斑鱼非特异性免疫体系抵御病毒侵染的分子机制提供基础资料.1 材料与方法1.1 材料来源及处理赤点石斑鱼采集于厦门渔市场，体质量200～400 g.鲜活样品暂养7d后，将其组织（心、肌肉、肝、头肾、鳍、脑、胃、肠、鳃及性腺）取出，放入1.5mLEppendorf离心管中，置入液氮中保存备用.1.2 引物设计通过NCBI上部分鲈形目鱼类MHC IA的DNA序列（StizostedionvitreumAY057459；Sparus aurata DQ211540；Scophthalmus maximusDQ848959；Aulonocara hansbaenschi AF038552）设计 1 对引物MHC－IPF、MHC－IPR，进行 MHC IA cDNA部分序列扩增和测序.根据已获得的MHC I cDNA中间序列，分别设计用于扩增3′端和5′端的巢式锚定引物 MHCIF47、MHCIF167和 MHCIR241、MHCIR31，根据获得的MHC IA cDNA 序列设计用于 Real time PCR反应的特异性引物SSCP IF和SSCP IR（表1）.表1 赤点石斑鱼MHC IA基因克隆引物序列Tab.1 Primers for E.akaara MHC IA genes cloning注：引物中出现的部分简并引物代码表示：N＝A／C／G／T，V＝A／C／G.?1.3 cDNA的克隆参照文献［9］.利用简并引物 MHC－IPF、MHCIPR扩增MHC IA中间序列；利用RA分别同 MHCIF47和MHCIF167配对，进行3′RACE的扩增；利用MHCIR241、MHCIR31，RA 和 Oligo dT－RA 为引物，以含有同聚化尾polyA的cDNA为模板进行5′RACE扩增.1.4 Real time PCR检测以SSCPIF与SSCPIR为特异引物，对赤点石斑鱼的12个不同器官组织（脑、肠、脾、胃、血、胸腺、性腺、头肾、心、鳃、肝脏与肌肉）中MHC IA基因的表达进行检测.Real time PCR反应条件为：94 ℃ 2min，（94℃15s，53℃20s，72℃30s）×40循环，反应过程中进行实时监控.每个样品进行3次重复试验.1.5 单链构象多态性（SSCP）分析通过所设计的特异引物（SSCPIF与SSCPIR）扩增MHC IA基因PBR区.以赤点石斑鱼肌肉、胸腺、脾等12个组织的cDNA 为模板，进行 Real time－PCR，反应条件为：95 ℃ 5min，（94 ℃ 30s，53 ℃1m，72℃1m）×30循环，72℃7min.1.6 序列拼接及cDNA全序列分析用Sequencher4.1.4软件进行序列拼接，得到赤点石斑鱼MHC IA基因的cDNA 全序列.用Genetyx 4.1软件统计序列总长、各碱基百分比、GC含量等信息.用DNAStar确定其开放阅读框，并采用Garnier法推测其蛋白质二级结构.采用Swiss－model软件［6］进行空间结构预测.采用singalIP3.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／）寻找信号肽、糖基化位点与跨膜结构，通过http：／／／Structure／cdd／wrpsb.cgi搜索IGC结构域.运用ClustalX进行多序列比对分析，并以 MEGA4.0软件中的邻接法（neighbor－joining，NJ）构建多物种的系统发生树，通过自举分析（bootstrap）作1 000次置信度检测.2 结果2.1 MHC IA cDNA全长的克隆和序列分析经RACE扩增及序列拼接后共得到1 680bp左右的赤点石斑鱼4个MHC IA全长cDNA序列，根据Klein等的命名规则，这4条序列分别命名为：Epak－UBA＊0101、Epak－UBA＊0201、Epak－UBA＊0301和Epak－UBA ＊ 0401 （genebank accession number：EU221232～EU221235）.赤点石斑鱼 MHC IA cDNA的编码区全长1 074～1 080bp，编码358～359个氨基酸.5′UTR区长度为99～112bp和3′UTR区长度为494～501bp，在所得的4个MHC IA cDNA序列中，存在缺失位点6个，变异位点114个，占总核苷酸数的10.6%，其中有75个位点存在两碱基替换，11个位点为三碱基替换；简约信息位点28个，占总核苷酸数的2.6%.其编码的氨基酸，存在2个缺失位点和62个变异位点，占氨基酸总长的17.3%，碱基替换主要发生在MHC IA多肽结合区（图1）.2.2 MHC IA基因的氨基酸序列分析和蛋白质结构预测以Epak－UBA＊0101为例，赤点石斑鱼 MHC IA cDNA开放阅读框编码365个氨基酸，其分子质量为41.66ku，等电点为6.01，负电核残基（Asp＋ Glu）和正电核残基（Arg＋Lys）分别为48和40个.该氨基酸序列前20位为信号肽区、21～203位为多肽结合区（peptide－binding region）、第206～299个氨基酸是免疫球蛋白样区（immunoglobulin－like region，IGC区）、308～330位为跨膜区（transmembrane region），之后为胞质区（cytoplasmic region）.MHC IA 的3个经典结构域分别定位在α1（77～107），α2（155～195）与α3（314～325）位置上（图1）.对 MHC IA蛋白链的氨基酸序列分析表明，MHC IA在多肽结合区上的第103位含有1个N－糖基化位点；5个O－糖基化位点分别位于多肽结合区的第21位、IGC区的第214，260，266位和跨膜区的第309位；5个丝氨酸磷化位点位于多肽结合区的第44，197位和IGC区的第212，215，218位；5个苏氨酸磷酸化位点位于多肽结合区上的第58，83，92，125位和IGC区的第300位；5个酪氨酸磷酸化位点位于多肽结合区上的第78，131，136，190位和IGC区上的第276位.赤点石斑鱼MHC IA具有5个半胱氨酸，分别在多肽结合区的119和183，IGC区的219，278和胞质区的338位，其中119和183，219和278分别形成两个二硫键.表2 MHC IA基因cDNA组成Tab.2 The cDNA composing of MHC IA gene? 图1 4种MHC IA基因编码区的氨基酸序列Fig.1 The encoding region amino sequence of the MHC IA from four different clones采用DNA Star软件对赤点石斑鱼MHC IA蛋白分子的二级结构进行预测，结果表明：MHC IA属于alpha＋beta型蛋白，其中α螺旋占38.4%，β片层占37%，Turn（转角）占15.9%，Coil（无规则卷曲）占9.32%.而SWISS－MODEL软件对其空间结构预测的结果表明，其三维结构与人类的相似.2.3 MHC IA基因的组织表达多态性分析通过特异性引物（SSCPIF和SSCPIR），对源于赤点石斑鱼12个组织的cDNA进行MHC IA表达丰度和多态性的检测，表明：MHC IA基因在12个组织中均有表达（图2、图3）.但不同组织体现出表达强弱及多态性差异，其中，表达量最大的组织为肝脏、肠、胸腺及头肾，最弱的组织为肌肉、血液和胃，而表达多态性最丰富的组织为胸腺和头肾，多态性最差的组织为肌肉.通过对PAGE胶上的不同条带的回收和测序，一共获得22种MHC IA核苷酸单倍型序列（Genebank accession number：EU078421～EU078442），分别编码22种不同的 MHC IA氨基酸序列，该多态序列区主要存在于MHC IA第二外显子区.图2 Real time PCR检测赤点石斑鱼不同器官组织的MHC IA表达丰度Fig.2 Tissues distribution of MHC IA fromE.akaara transcripts measured by Real time PCR2.4 赤点石斑鱼MHC IA基因的系统进化分析从NCBI下载其他脊椎动物MHC IA同源氨基酸序列，为避免由于回复突变、趋同突变、平行突变等进化“噪音”所导致的错误的系统发育信息，仅取其中的保守区域IGC区氨基酸序列与赤点石斑鱼的同源序列进行比对，并基于NJ构建系统进化树，如图4所示，NJ树的拓扑结构主要表现为：1）所有硬骨鱼类构成进化树的一个主要分支，软骨鱼类与其他脊椎动物构成另一个姐妹支；2）源于同一物种不同座位的氨基酸序列均先聚合为一支再与其他物种聚合.3 讨论3.1 赤点石斑鱼MHC IA基因结构与功能比较所得的4个MHC IA cDNA序列，其变异位点共有114个，占总核苷酸数的10.6%，在其编码的359个氨基酸中，有62个变异位点，占总氨基酸位点数量的17.3%.这些变异氨基酸位点主要集中在MHC IA蛋白的多肽结合区（α1区和α2区），这种多肽结合区氨基酸序列的多态性即为I类抗原多态性的分子基础，多态性越丰富，其抵御外界病原的能力就越强.而MHC IA蛋白的IGC区、跨膜区及胞浆区均相对保守.赤点石斑鱼MHC IA蛋白肽结合区的多态性和其他功能区的保守性是与其作为抗原递呈功能相适应的，其序列结构特征表明了MHC IA基因进化一方面受到轻链（β2m），TCR和CD8＋等其他免疫递呈因子的约束，又同时具备了与外界各种抗原结合的能力.MHC I复合物由重链（α链）和β2m组成.其主要分布在专门性抗原递呈细胞（APCs）和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）表面，通过结合内源性病原以激活T细胞受体行使免疫反应.因此，MHC IA的蛋白空间结构将极大地影响其行使免疫递呈功能的有效性.经典的 MHC IA 蛋白链由α1、α2和α33个结构域组成，α3结构域靠近细胞膜，位于分子的底部，而α1和α2结构域则远离细胞膜，位于分子的顶部，它们共同组成了抗原结合部位和T细胞受体（TCR）识别部位［7］.我们对赤点石斑鱼MHC IA蛋白二级结构和三级结构的预测发现，该蛋白同样具有α1（77～107）、α2（155～195）和α3（314～325）3个经典结构域，其中α1和α2分别由1个螺旋和4个反向平行的β折叠组成，形成一个深沟状凹槽，α3主要由β折叠组成.在与人类及鼠类的同源位置［9］，赤点石斑鱼MHC IA同样存在4个保守的半胱氨酸，组成两个二硫键，其中一个二硫键在α2结构域内，另一个二硫键在α3结构域.可以推测这两个二硫键对于稳定MHC IA的空间结构起重要作用.赤点石斑鱼MHC IA空间结构的保守性同样意味着其抗原递呈机制与人、鼠等高等脊椎动物一致.因此，我们的工作不仅为开发赤点石斑鱼的分子疫苗奠定了基础，也为研究赤点石斑鱼免疫系统的免疫应激机制提供了手段.3.2 赤点石斑鱼MHC IA基因的组织表达特性图3 SSCP方法检测赤点石斑鱼MHC IA基因在12个正常组织中的表达Fig.3 Expression of MHC IA fromE.akaarain twelve normal tissues by SSCP图4 基于MHC IA基因IGC区氨基酸序列构建脊椎动物系统进化树（NJ树）Fig.4 Phylogenetic tree based on MHC IA amino acid sequences fromE.wakaaraand other vertebrates（NJ）鱼类MHC IA基因表达具有组织特异性.Han－sen等［14］克隆了虹鳟全长MHC I重链，并检测到MHC I类基因在心、肠、肾、胸腺、脾组织中具有较强表达，而在脑、肝组织中表达较弱.在本研究中，我们对来源于脑、心、脾、肝、头肾、肠、肌肉、血细胞、胸腺、性腺、鳃、胃等12各组织的MHC IA基因进行表达特异性分析，结果表明，赤点石斑鱼的各组织均能有效表达MHC IA蛋白，但其表达强弱和表达多态性均存在明显差异，胸腺和头肾无论在表达强度或多态性方面都体现出较强优势，可以推测其应当是赤点石斑鱼行使递呈内源性病毒抗原，引导机体进行非特异性免疫最重要的组织器官.MHC IA多肽结合区域的多样性可以作为指标，用来评估石斑鱼对病毒的抵抗力.3.3 MHC IA基因在鱼类系统研究中的应用研究资料表明，作为一个较为古老的基因家族，MHC分子大约在4～5亿年前就在低等脊椎动物中出现，并且当时就开始出现分化［15］.因此 MHC可以作为一个良好的分子进化指标在高分类阶元范围内研究物种间的进化关系及基因本身的进化历程.但由于MHC IA分子各区段的进化速率差异很大，部分区段如多肽结合区的序列进化速率过快，累积了大量的突变，从而湮没了大部分真实的进化信息，不利于用来进行进化分析.因此我们选择了最为保守的IGC区段的氨基酸序列来构建脊椎动物的进化树.通过NJ法构建的进化树所示，其拓扑结果清楚地表明了所有的脊椎动物分为两个主要分支，所有硬骨鱼类集中在一个分支，而其他高等脊椎动物在另一个分支，该结果不仅说明了硬骨鱼类进化的单源性，也证实了MHC IA分子在原始脊椎动物分化前即已存在.【相关文献】［1］王重庆.分子免疫学基础［M］.北京：北京大学出版社，1997：139－140.［2］Paul W E.Fundamental immunology［M］.4th ed.Philadelphia：Lippincott－Raven Publishers，1999：297－298.［3］Hashimoto K，Nakanishi T，Korosawa K.Isolation of carp genes encoding major histocompatibility complex antigens［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：6863－6867.［4］陈信忠，苏亚玲，龚艳清.闽南地区养殖石斑鱼病毒性神经坏死病初步研究［J］.福建水产，2003，9：11－14.［5］丁少雄，张之文，杜佳莹，等.赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）MHC IIB基因的克隆与表达多态性分析［J］.海洋学报，2009，31（2）：129－138.［6］Schwede T，Kopp J，Guex N，et al.SWISS－MODEL：an automated protein homology－modeling server［J］.Nucleic Acids Research，2003，31（13）：3381－3385. ［7］Bjorkman P J，Samraoui B，Samraoui B.Structure of the human class I histocompatibility antigen，HLA－A2［J］.Nature，1987，329：506－512.［8］LeBouteiller P，Lenfant F.HLA－G gene：the more classical among the non－classical［J］.M S－Medecine Sciences，1997，13（12）：1436－1444.［9］West A P Jr，Bjorkman P J.Crystal structure and immunoglobulin G binding properties of the human major histocompatibility complex－related Fc receptor［J］.Biochemistry，2000，39（32）：9698－9708.［10］Hansen J D，Strassburger P，Du Pasquier L.Conservation of an alpha2domain within the teleostean world，MHC class I from the rainbowl trout on corhynchus mykiss ［J］.Dev Comp Immunol，1996，20：417－425.［11］Lie O，Grimholt U.The major histocompatibility complex of fish：genetics structure and function of the MHC of teleost sepcies［M］∥The major histocompatibility complex of domestic animal species.Boca Raton，Florida，USA：CRC press，1996：17－33.。

两种杂交石斑鱼子一代及其亲本的线粒体COⅠ基因遗传变异分析

两种杂交石斑鱼子一代及其亲本的线粒体COⅠ基因遗传变异分析周翰林;杨森;高川;张磊;张海发;李水生;张勇;蒙子宁;刘晓春;林浩然【摘要】对两种杂交石斑鱼子一代（青龙斑和虎龙斑）及其亲本（斜带石斑鱼、棕点石斑鱼和鞍带石斑鱼）的线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）基因序列进行了测序分析。

在15个样本中，同源序列片段（1551bp）中共检测到9个单倍型和249个核苷酸多态位点。

序列差异分析和遗传距离比较结果显示，核苷酸序列同源性在88．1％-100％之间，无明显遗传分化。

虎龙斑的2个COⅠ基因单倍型与母本棕点石斑鱼单倍型的同源性为99％和100％，而与父本鞍带石斑鱼的同源性均为88．1％。

青龙斑的2个单倍型与母本斜带石斑鱼的3个单倍型的同源性在99．7％-100％之间，而与父本鞍带石斑鱼的同源性分别为89．3％和89．4％，结果表明两种杂交子一代在线粒体DNACOⅠ基因上严格遵循母性遗传规律。

%In order to identify the phylogenetic relationship among two grouper hybrids （ Qinglong grouper and Hulong grouper） and their parents （ Epinephelus coioides 9, Epinephelus coioides ♀ and E. lanceolatus ♂）, their mitochondrial cytochrome oxidase subunit I （CO I ）gene fragments were amplified by PCR, and the 1551 base-pair nucleotide sequences of CO I were examined. The results show that all 15 sequences are grouped into 9 haplotypes and 249 nucleotide polymorphic loci in CO I gene fragments. Sequence divergences and genetic distance analysis showed all the groupers shared 88.1% to 100% similarities in nucleotide sequence, indicating there is no significant genetic difference among these groupers. The two CO I haplotypes of Hulong grouper showed 99% and100% similarities with the haplotype of the female parent E. fuscoguttatus, respectively, but only 88.1% similarity with the male parent E. lanceolatus. The two CO I haplotypes in Qinglong grouper had similarities of 99.7% to 100% with the three haplotypes of the female parent E. coioides, and only of 89.3% and 89.4% with the male parent E. lanceolatus. The results indicated that the two grouper hybrids were inherited from their maternal parent in mitochondrial CO I genes.【期刊名称】《热带生物学报》【年(卷),期】2012(003)001【总页数】10页(P1-10)【关键词】斜带石斑鱼;鞍带石斑鱼;棕点石斑鱼;杂交子代;COⅠ;遗传变异【作者】周翰林;杨森;高川;张磊;张海发;李水生;张勇;蒙子宁;刘晓春;林浩然【作者单位】中山大学生命科学学院,广东广州510275;中山大学生命科学学院,广东广州510275;中山大学生命科学学院,广东广州510275;广东省大亚湾水产试验中心,广东惠州516081;广东省大亚湾水产试验中心,广东惠州516081;中山大学生命科学学院,广东广州510275;中山大学生命科学学院,广东广州510275;中山大学生命科学学院,广东广州510275;中山大学生命科学学院,广东广州510275;中山大学生命科学学院,广东广州510275／海南大学海洋学院,海南海口570228【正文语种】中文【中图分类】Q321斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)、鞍带石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)和棕点石斑鱼(Epinephelusfuscoguttatus)都隶属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephelus)，在我国主要分布于台湾海峡及南海海域［1－5］。

海水养殖石斑鱼的线粒体基因组测序与分析

海水养殖石斑鱼的线粒体基因组测序与分析石斑鱼（Epinephelus coioides）作为一种重要的经济鱼类，在海水养殖业中具有广泛的应用前景。

了解石斑鱼的遗传特征对于改良品种、提高养殖效益以及保护自然资源都具有重要意义。

线粒体基因组是研究鱼类遗传变异和进化关系的重要工具。

本文将重点介绍海水养殖石斑鱼的线粒体基因组测序与分析，为石斑鱼遗传研究提供参考。

线粒体基因组是细胞中的一个独立进化的遗传系统，具有高度保守性和多样性。

它由几个蛋白编码基因、转运RNA基因和核酸RNA基因组成。

线粒体基因组的测序与分析可以提供关于个体间的亲缘关系、物种起源和进化关系的重要信息。

在进行石斑鱼线粒体基因组测序前，需要提取石斑鱼的线粒体DNA样品。

可以选择鳃、肌肉、鳍、眼球等组织进行提取。

提取的DNA样品可以通过PCR扩增获得所需长度的线粒体基因组。

然后，使用高通量测序技术对扩增的线粒体基因组进行测序。

线粒体基因组数据的测序分析包括序列的拼接、基因注释、遗传多样性和进化分析等。

首先，将测序得到的片段序列拼接成完整的线粒体基因组。

接下来，使用基因注释软件对拼接序列进行注释，识别编码基因和非编码区域。

然后，可以计算线粒体基因组的总碱基对数、GC含量等测序相关信息，评估测序质量。

此外，还可以进行基因组间的比较分析，研究不同个体之间的遗传差异和多样性。

通过构建系统进化树，可以探究石斑鱼的亲缘关系和物种起源。

石斑鱼线粒体基因组测序与分析可以揭示石斑鱼的遗传特征、进化关系以及与其他物种的亲缘关系。

基于线粒体基因组的研究结果，可以为石斑鱼的遗传育种提供依据。

通过遗传多样性分析，可以评估不同种源个体的遗传差异，为养殖策略的优化提供参考。

此外，通过比较不同物种的线粒体基因组，可以进一步揭示鱼类的进化历程和系统分类学。

尽管线粒体基因组测序和分析在石斑鱼遗传研究中发挥着巨大的作用，但还有一些需要注意的问题。

首先，测序时需要选择适当的测序策略和测序深度，以确保获得具有高质量的线粒体基因组数据。

青石斑幼鱼致病病原哈维氏弧菌的分离鉴定及致病性分析

因（ｔｏｘＳ、ｔｏｘＲ）、锌金属蛋白酶（ｐａｐ６）、群体效应调节基因
（ｌｕｘＲ）、几丁质酶基因（ｃｈｉＡ）。ＰＣＲ扩增采用２５ μＬ反应体
系，扩增程序：９４ ℃ ，３ｍｉｎ，９４ ℃ ，３０ｓ、５８ ℃ ，３０ｓ、７２ ℃ ，
１ｍｉｎ，３５个循环，７２ ℃ 延伸７ｍｉｎ。根据ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０
ｔｅｎｔｆｏｒｍｅｄａｎｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃｃｌｕｍｐｉｎｔｈｅｃｅｎｔｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｉｎｓｋｉｎｔｉｓｓｕｅｓ；ｃｅｌｌｕｌａｒｓｗｅｌｌｉｎｇｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇａｎｄａｎｇｉｏｔｅｌｅｃ⁃
ｔａｓｉｓｉｎｇｉｌｌｌａｍｅｌｌａｅ；ｂｌｕｎｔｅｄ，ｆｕｓｅｄｏｒｓｈｅｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｖｉｌｌｉａｎｄｌｏｏｓｅｎｅｄｍｕｃｏｕｓｌａｙｅｒａｎｄｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｓｉｎｉｎｔｅｓｔｉｎｅ；ｃｅｌｌｕｌａｒｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ
、拟态弧菌（Ｖ．ｍｉｍｉｃｕｓ）
［２］
ｖｅｙｉ）［３］、溶藻弧菌（Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）［４］等。近年来，关于哈维
（ｖｉｂｒｉｏｈａｒｖｅｙｉ）是一种海洋革兰氏阴性发光微生物，生活在
河口和海洋栖息地，需要氯化钠
［５］
。该细菌是养殖水生鱼类
的一种重要病原体，可以感染多种水生鱼类。患病鱼体的常
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′—３′）
Ｆ：ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ
Ｒ：ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ
Ｆ：ＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＧＴＡＣＴＡＧ

建鲤MHC classⅠ基因全长cDNA的克隆与序列分析

ＦｌｌｎｔＤＮＡｌｎｎｎｅｕｎｉｇｏｊｒｈｓｏｏａｉｉｔｕｌｅｇｈｃｃｏｉｇａｄｓｑｅｃｎｆｍａｏｉｃｍｐｔｌｙｔｂｉｃｍｐｅ（ｏｌｘＭＨＣ）ｃａｓＩｅｅｆｏＣｐｉｕａｐｏｖｒ／ｎｌｓｇｎｒｍｙｒｎｓｃｒｉａ．ｊａ
Ａｓａｔｂｔｃ：Ｍａｒｉｏ０ｐｔ．ｔｃｍｌ（Ｃ）ｉｏｅｆｒｃｌｍｎｃｒｉｅｔｒｅ．ＴｅｕｌｅｇＤＡｒｊｓｃｍａｉ１ｙｏｐｅＭＨｏｈｔｂｉｘｓｎｕｉｍｕｅａｔｓｎｖｒｂａｓｈｌｌｔｅＮｏｃａｉｆｏｅｔｆ —ｎｈ
ＺＨＯＵＫｉＺａ，ＨＡＮＧＣｈｎｅｇ，ＷＡＮＧＪａ — ｉＬｎＺｉｎ＇ｅｇｆｎｉｎｘｎ，ＩＢｉｇ，ＨＵＪａ
（．ｏｌｅｏｉｅｉ，ＮｎｎｇｉｌｒｌｎｅｉＷｘ，Ｊａｇｕ２４８；１ＣｌｇｅｆＦｓｒｓａｊｇＡｒｕｔａＵｉｒｔ，ｕｉｉｎｓ１０１ｈｅｉｃｕｖｓ）２ＫｙＯｅａｏａｒｆｒｅｅｃｒｄｇａｄＡｕｃｌｒＢｏｇｒｈａｅＦｓｅ，．ｅｐｎＬｂｒｔｙｏｎｔｅｉｎｑａｕｔｅｉｏｙｏＦｅｗｔｉｓｏＧｉＢｅｎｕｌｆｓｒｈＭｉｉｒｇｉｌｒ，ＦｅｈａｅＦｓｅｉｅａｃｅｔ，ＣｉｓＡａｅｙｎｔｏＡｒｕｔｅｒｗｔｉｒｓｓｒＣｎｅｓｙｆｃｕｓｒｈｅＲｅｈｒｈｎｅｃｄｍｅｆｉｒＳｉｃｏＦｓｅｃｎｅ，Ｗｕｉｉｎｓ２４８）ｈｙｅｓｘ，］ａｇｕ１０１

青石斑鱼细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COXⅠ）基因的克隆鉴定及表达分析

用MEGA3.1软件作系统发生树评估不同动物COXⅠ 个氨基酸（图 2）。COXⅠ预测分子量为 57.0 kD，理论
之间的进化关系。
pI 值为 6.48。
1.2.2 RT-PCR 检测COXⅠ基因在青石斑鱼各组织中的差异表达研究利用 Trizol Reagent 试剂盒，抽提对照组和实验组青石斑鱼（各 5尾）的肝脏、心脏、
468
中国水产科学
第16卷
青石斑鱼（Epinephelus awoara）属鲈形目（Perciformes），科（Serranidae），石斑鱼亚科（Epinephelinae），石斑鱼属（Epinephelus）的海洋珊瑚礁鱼类，在中国南方广泛养殖。近年来由于养殖密度过大、养殖环境污染等原因，石斑鱼的疾病时有发生，广东、福建、浙江、海南等省都有养殖石斑鱼大规模死亡的报告，造成了巨大的经济损失 [7]。目前对青石斑鱼的免疫和疾病机制的研究尚少，也缺乏对其各项生理活动的整体研究。在本实验室已构建了以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺筛选出的一个 587 bp的 EST 序列，运用 RACE-PCR 方法，克隆鉴定了细胞色素 C 氧化酶亚基Ⅰ（COXⅠ）基因，分析了其蛋白质肽链的结构特性，并将该基因序列与其他物种的同源基因序列进行了比对分析，通过构建分子系统发育树探讨了这几个物种的分子进化关系，并进行了细胞色素 C 氧化酶亚基Ⅰ基因在正常和副溶血弧菌灭活疫苗刺激下青石斑鱼不同组织中的表达分析，为更进一步研究青石斑鱼线粒体基因组提供了参考，也从免疫抗病方面对监测和抵抗鱼类病害进行了基础理论研究。
细胞色素 C 氧化酶是由多个亚基组成的复杂酶

草鱼MHC classⅠ等位基因克隆及其多态性分析

草鱼MHC classⅠ等位基因克隆及其多态性分析夏春;徐广贤;林常有;胡团军;阎若潜;高福【期刊名称】《自然科学进展》【年(卷),期】2004(014)001【摘要】为了阐明草鱼MHC class Ⅰ等位基因的结构与多态性,进一步研究其与疾病的关系,从草鱼cDNA文库中克隆了MHC class Ⅰ基因(Ctid-MHC Ⅰ);并通过对12个个体Ctid-MHC Ⅰ的克隆,分析了其等位基因的多态性与三级结构.结果显示Ctid-MHC Ⅰ等位基因在α1与α2区域变异幅度大,可分为6类(Ctid-MHC Ⅰ-UA～-UF),9型(A～I);但是其三级结构和抗原多肽结合的关键性氨基酸十分保守.结果阐明了草鱼MHC class Ⅰ分子在8个区域(A-H)置换率高,存在插入或缺失以及长度变异,使等位基因呈现高度多态性.动物MHC class Ⅰ分子系统树也提示了我国大陆架上鱼类、两栖类、鸟类、哺乳动物和人的遗传距离与分枝年代.【总页数】8页(P51-58)【作者】夏春;徐广贤;林常有;胡团军;阎若潜;高福【作者单位】中国农业大学动物医学院,北京,100094;农业部预防兽医学重点实验室,北京,100094;中国农业大学动物医学院,北京,100094;中国农业大学动物医学院,北京,100094;中国农业大学动物医学院,北京,100094;中国农业大学动物医学院,北京,100094;Department of Clinical Medicines,Oxford University,UK【正文语种】中文【中图分类】S96;Q78【相关文献】1.草鱼MHC class Ⅰ基因多态性及其与鱼体抗柱形病能力关系分析 [J], 杨玲;孟庆磊;张龙岗;张志山;安丽;董学飒;刘羽清;付佩胜2.中国云南地区恒河猴群MHC-DRB部分等位基因的调查 [J], 和占龙;禹文海;杨凤梅;赵远;鲁帅尧;王俊斌;陈丽雄;乞素冬;李艳艳3.三种猫科动物MHC Class Ⅱ DRB等位基因序列变异性分析 [J], 王倩;吴孝兵;晏鹏4.五龙鹅MHC ClassⅠ基因克隆及同源建模研究 [J], 贾晓晖;张旭晖;王宝维;王雷;李桢;张名爱;吴晓平;刘光磊;杨志刚;龙芳羽5.长江草鱼群体MHC Class II B的多态性和进化分析 [J], 张燕;姚延丹;段辛斌;陈大庆;曾令兵;汪登强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

虎MHC ClassⅠ基因的克隆及测序

ｇ３４）ｈｅｈ（ｏｏｏｙ９．％）ｅｐｒａｈｍｏｇ７３）ｉｔａｄ（ｏｏｇ６４）ｏ（ｏ）９．％，ｃｅｔｈｍｌｇ１８ｒａ，ｌａｄｅｔ（ｏｌｙ８．％，ｇｎａｈｍｌ８．％，ｄｇｈ— ｏｏｎａｐｏｙ
野生动物ＣｉｓＪｒａｏＷｌｉ２１，１（）！！ｈｅｕｌｆｉｌｅ００３３：二ｎｅｏｎｄｆ
虎ＭＨｌｓＩ基因的克隆及测序ＣＣａｓ
李慧一马跃徐艳春
（东北林业大学野生动物资源学院，国家林业局野生动植物保护重点开放实验室，国家林业局野生动植物检测中心，哈尔滨，１０４）５００摘要：根据猫的主要组织相容性复合体Ｉ类分子ｃＮＤＡ序列设计ＰＲ引物，从基因组上成功扩增并克隆了ＭＨＣＣＣａｓｌｓＩ基因片段，命名为ＴＡ—ＡＬ。该片段全长２８０ｂ，包含Ｍｌｓ分子基因约８％的长度，包括Ｅｏ２ｐＨＣＣａｓ１５ｘｎ１部
ＬｉＨｕｙＭａＹｕＸｕＹａｈｎｉｉｅｎｃｕ
（ｏｅｅｏｚＣｌｇｌｆＫｙＬｂｒｔｒｏｅａｏａｙｆｏＲｓｕｃ，ＮｒｅｓＦｒｔｎｖｒｔ，ｅｏｒｓｏｔａｔｏｅｒＵｉｓｙｅｈｓｙｅｉＣｎｅａｏＳａｅＦｍｔｄｎｔｔｎｏＣｉ，ｏｓｖｔｎｏｔｔｏｓＡｍｉｓａｉｈｎｒｉｆｙｒｉｒｏｆａ
ｌｎｔｆｎｒｎ１，ｅｏｅｇｈｏｉｔｏｘｎ２，ｉｔｎ２，ｅｏｎｒｏｘｎ３，ｉｔｎ３，ｅｏｉｔｏｎｒｏｘｎ４，ｎｒｎ４，ｅｏｘｎ５，ｉｔｎ５，ｅｏｎｒｏｘｎ６，ｉｔｎ６ａｄａｐｒｆｎｒｎａｔｏｏ

石斑鱼免疫基因的鉴定与功能研究

石斑鱼免疫基因的鉴定与功能研究作为我国重要经济鱼类的代表，石斑鱼在野生种群和养殖群体中均存在着各种疾病的威胁，其中最主要的问题是免疫基因的功能不明确。

为了探究石斑鱼的免疫机制和提高其免疫能力，研究人员们对其免疫基因进行了深入的研究。

一、石斑鱼免疫基因的鉴定随着生物学和生物技术的发展，采用PCR探针等现代分子生物学手段，可以从石斑鱼体内提取免疫基因等特定基因的DNA序列。

所得结果再通过注释、镜像比对和系统进化分析等手段，最终确认出该基因所属的家族及亲缘关系，该方法可以为石斑鱼免疫基因的鉴定提供重要的参考。

此外，还有专门的石斑鱼基因文库，科研人员可以从中快速检索到石斑鱼基因序列的相关信息，方便进一步分析基因的功能和调控机制等。

石斑鱼基因文库为研究石斑鱼免疫基因提供了重要资源和保障。

二、石斑鱼免疫基因的功能研究1. 免疫基因的表达规律分子生物学与免疫学相结合，研究人员通过免疫挑战和qPCR技术等方法，发现在抵抗外源性侵袭时，石斑鱼诸如IL-1β、Toll样受体、抗菌肽等免疫基因的表达量均会上调。

疾病发生与排除的背后是免疫系统对外界侵害所做的反应，因此对免疫基因的表达规律研究具有极高的重要性。

2. 免疫基因与免疫周期的关联石斑鱼体內免疫周期分为固有免疫和适应性免疫阶段，其中不同的免疫基因在不同的免疫周期内发挥着各自独特的功能。

比如说，在固有免疫时期，抗菌肽家族基因在第一时间内参与到对病原体的基础防御反应当中。

应对特异性感染，则适应性免疫花费更长的时间，这时候中性粒细胞和抗体等免疫因子才会被激活和介导。

3. 免疫调节因子的量变和功能变异审查免疫周期不仅仅是对需求自我保护器官保护的分解，更是对动物体制内免疫调控因子的量变和功能变异等多方面的实验研究。

这种基础实验一方面可以深化石斑鱼免疫细胞调控的生物学学科的认知，另一方面可以促进新免疫制备技术的出现，从而对石斑鱼存育建设贡献出一份新的智慧。

结论：石斑鱼免疫基因的鉴定与功能研究为今后更深层次地探究石斑鱼免疫机制提供了丰富的思路和方法。

一新MHCⅠ类等位基因存在于低等脊椎动物虹鳟鱼

一新MHCⅠ类等位基因存在于低等脊椎动物虹鳟鱼的报告，
600字
本报告旨在研究虹鳟鱼MHCⅠ类基因的存在情况，并向读者
介绍如何可以利用它来认识虹鳟鱼的进化过程。

MHCⅠ类基因，又称为“免疫多态性蛋白复合体”，是一类代
表特定物种的重要遗传标记，通常用于衡量物种间的遗传差异。

虹鳟鱼的MHCⅠ类基因的存在主要表现为普遍的高遗传多样性，在种内分类中有明显的差异。

MHCⅠ基因的存在源于基
因多态性和复制，历史上的不同种群的虹鳟鱼也会表现出不同的MHCⅠ基因，因此可以说MHCⅠ基因也可以当作一个可
以追踪虹鳟鱼进化史的遗传标志。

在运用分子生物学实验方面，我们使用PCR技术，尤其是高
通量测序技术，大规模探究虹鳟鱼MHCⅠ类基因的存在情况，探究特定基因等位型的频率及分布情况。

在对数据分析方面，将应用AMOVA（分子变异分析）、Fst（正交歧视度）和FIS （多态索散度）等多态遗传分析方法，探究虹鳟鱼的遗传结构以及物种内各等位基因的分布情况。

据此，我们可以得出结论，虹鳟鱼的MHCⅠ类基因具有普遍
的高遗传多样性，拥有多样的等位基因，因此可以被用作追踪虹鳟鱼进化历史的重要遗传标记。

认识虹鳟鱼MHCⅠ类基因
的存在及其分布，可以使我们更好的认识虹鳟鱼的进化史，为深入研究低等脊椎动物的进化提供有价值的信息。

青石斑鱼生物学特性及其人工繁育技术

催产后约经 30～35h ,雄鱼追逐雌鱼 ,开始产卵受精 ,青石斑鱼为多次产卵型 ,受精卵为浮性卵 ,圆形透明 ,具油球一个 ,产卵行为一般在夜晚 18 时至次日清晨 2 时进行。产卵结束后 ,用 60～ 100 目制成的筛绢网捞取受精卵 ,经选优计数后孵化。
一般在小型水泥池、黑色玻璃缸桶内进行孵化 ,若在面积较大的仔稚鱼培育池中直接孵化 ,最好在培育池中吊挂用 80 目筛绢制成的漏斗型网箱 ,微充气黑暗孵化 , 孵化密度在 8 万～ 12 万/ m3 ,控制水温为 25 ℃,盐度 30 ‰,并吸去底部坏卵。在 24～25 ℃水温下 ,经 25～30h 孵化出膜 , 初孵仔鱼全长 1. 2mm ,移入仔稚鱼培育池进行培育。 2. 3 仔稚鱼培育 2. 3. 1 饵料投喂青石斑鱼的饵料系列为牡蛎等贝类受精卵或担轮幼虫、轮虫、卤虫幼体、桡足类、鱼糜、鱼虾和人工配合饵料等 ,投喂情况如下图所示。
在亲鱼培育中 ,应提供营养丰富的优质饵料和适宜的环境条件。饵料以新鲜优质小杂鱼为主 ,辅以配合饵料制成的湿性团状饵料 ,并添加 1 %～2 %的鱼用多种维生素等营养剂 ,日投饵两次 ,投饵量为亲鱼体重的 3 %～6 % ,并根据摄食
情况随时调整饵料品种和投饵量 ;亲鱼培育池应有遮光设施以保持安静的环境 ,使亲鱼免受惊吓 ; 控制水温在 25 ℃左右 ,盐度在 30 ‰左右 ,酸碱度在 7. 8～8. 2 之间 ,溶解氧在 5mg/ L 以上 ,日换水量为 100 % ,并清底吸污 ,除去残饵 ,保持水质清新 ,使亲鱼食欲旺盛 ,摄食活跃。 2. 2 催产与受精卵孵化当雌鱼腹部明显膨大柔软 ,经镜检 ,卵粒分离饱满呈黄色 ,卵径在 0. 3 ～0. 5mm 之间 ,细胞核向动物极偏移 ,雄鱼婚姻色明显 ,轻压腹部有少许精液流出时 ,亲鱼已达到人工催产的要求。催产剂有鲤鱼脑垂体、绒毛膜促性腺激素、促黄体激素释放激素类似物和 L RH - A + P G 的混合物等 4 种。雌鱼用 P G10 ～ 12mg/ kg 体重或 L RH - A60μg/ kg 。以上剂量一般分两次胸腔注射 ,第一次注射量占总量的 2/ 3 , 两次间的间隔时间在水温 25～26 ℃时为 24h 左右。雄性亲鱼注射剂量是雌鱼的一半 ,均在雌鱼第二次注射的同时进行。注射用水为0. 6 %氯化钠溶液 ,将催产剂溶解或制成悬浊液 ,注射液量为每尾亲鱼一次注射 1～2mL 为度。

石斑鱼白介素增强子结合因子2(ILF2)基因的克隆与表达分析的开题报告

石斑鱼白介素增强子结合因子2（ILF2）基因的克隆
与表达分析的开题报告
石斑鱼是广泛分布在热带和亚热带海域的重要经济鱼类，其免疫系统的研究对于保障石斑鱼的健康和增加产量具有重要意义。

白介素增强子结合因子2（ILF2）是一种转录因子，已经在哺乳动物、禽类等中得到了广泛研究，但在石斑鱼中的研究尚不多见。

本研究旨在从石斑鱼中克隆和表达ILF2基因，并通过相关实验探究其生物学功能和调节作用。

具体研究方案如下：
1. ILF2基因的克隆和序列分析
利用已有的石斑鱼基因组数据库信息，设计一对特异性引物对ILF2基因进行扩增。

将扩增产物进行回收纯化、测序、序列分析，确定其基因组序列和其所编码蛋白质序列。

2. ILF2的表达分析
（1）组织特异性表达
收集石斑鱼不同组织的样本（肝、脾、肌肉、肺、肠等），从中提取总RNA并进行RT-PCR分析，确定ILF2在石斑鱼的组织表达特异性。

（2）免疫应答表达
通过西方印迹法和实时荧光定量PCR分析，确定ILF2基因在石斑鱼免疫应答中的表达情况。

3. ILF2的生物学功能研究
通过构建ILF2的过表达和沉默的体系（如RNAi），分析ILF2的生物学功能以及对石斑鱼免疫系统调控的作用。

通过以上步骤，本研究将为石斑鱼免疫系统的研究提供重要的基础性数据，并为石斑鱼的养殖提供可靠的科学依据。

中国南方沿海13种石斑鱼类的分子系统进化关系分析

中国南方沿海13种石斑鱼类的分子系统进化关系分析陈兴汉;郭梁;李明明;蒙子宁;林浩然【期刊名称】《中山大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(000)004【摘要】石斑鱼类（Groupers）是世界性海洋经济鱼类，也是中国南方沿海省份重要的海水增养殖对象，其种类繁多，由于缺乏明显的种间外部形态区别特征，石斑鱼的分类一直是鱼类系统分类学的一个难题，存在着较多的争议和混淆。

为了从分子水平揭示石斑鱼类的系统进化关系，应用线粒体细胞色素b基因（ Cyt b ）及两个核糖体RNA基因（16S和12S）序列联合构建系统进化树对中国近海石斑鱼亚科3属13种进行种类鉴定及亲缘关系分析，探讨了石斑鱼类的分子系统进化。

结果表明：①线粒体基因序列在石斑鱼类种间存在较大的变异，种内变异极小，是进行石斑鱼类种类鉴定较为适宜的分子标记；②所研究的3属13种石斑鱼类中，石斑鱼属与九棘鲈属的亲缘关系较近，与鳃棘鲈属的较远；③赤点石斑鱼和青石斑鱼、蜂巢石斑鱼与鮭点石斑鱼、斜带石斑鱼与棕斑石斑鱼两两间具有较近的亲缘关系。

%The groupers are commercially important marine species over the world , and they are also the important mariculture species of the coastal provinces in south China .The great variety of the species and the lack of morphological characteristics led to much confusion and dispution in their phylogenetic rela-tionships and species identification .In the present study , we try to reveal the phylogenetic relationships of groupers on molecular level .The partial mitochondrial cytochrome b ( Cyt b ) gene and two ribosomal genes (16S and 12S) were combined and applied to speciesidentification and relationship analysis of 13 Epinepheline species from 3 genera distributed in coastal waters of south China .The results showed that:①The mitochondrial genes are appropriate as molecular markers for Epinepheline species identification because considerably high sequence difference among species and very low within species were found in these 3 genera;② Epinephelus was more closely related to Cephalopholis than to Plectropomus; ③ The genetic relationship was very close between E.akaara and E.awoara, E.merra and E.longispinis, E.coioides and E.corallicola.【总页数】8页(P123-130)【作者】陈兴汉;郭梁;李明明;蒙子宁;林浩然【作者单位】阳江职业技术学院生命科学与技术系，广东阳江529566; 中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东广州510275;中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东广州510275;中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东广州510275;中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东广州510275;中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东广州510275【正文语种】中文【中图分类】Q959.483【相关文献】1.基于16S rDNA部分序列探讨中国近海30种石斑鱼类的分子系统进化关系 [J], 丁少雄;王颖汇;王军;庄轩;苏永全;尤颖哲;李祺福2.基于线粒体Cytb和ITS1部分序列分析鲭科鱼类分子系统进化关系 [J], 邱凡;苏永全;傅蒙娜;王军3.我国沿海裸胸鳝属鱼类DNA条形码及分子系统进化研究 [J], 范蔓桦;杨杰銮;谢瑞琳;马赛亚;李江涛;张凯;梁日深;陈轶之;林蠡4.基于16S rRNA与COI基因40种石斑鱼亚科鱼类分子系统进化关系 [J], 梁日深;陈铭;廖国威;张卓为;张癸新;陈轶之;林蠡5.西太平洋沿海石斑鱼属鱼类DNA条形码及分子系统进化研究 [J], 梁日深;唐丰寿;何浩斌;汪健;李江涛;李清清;陈轶之;林蠡;张凯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

5种常见石斑鱼的线粒体DNA酶切物理图谱

5种常见石斑鱼的线粒体DNA酶切物理图谱杨少闻;刘楚吾【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2006(013)003【摘要】用识别5、6碱基序列的17种限制性内切酶,即BamHⅠ、BglⅠ、BglⅡ、DraⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ、KpnⅠ、MluⅠ、Pst Ⅰ、PvuⅡ、SalⅠ、Sca Ⅰ、Sma Ⅰ、StyⅠ、Xba Ⅰ和XhoⅠ,对南海海域石斑鱼属(Epinephelus Bloch)野生蜂巢石斑鱼(E.merra)、鲑点石斑鱼(E.fario)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和七带石斑鱼(E.septemfasciatus)的线粒体DNA(mtDNA)进行RFLP分析.测算出蜂巢石斑鱼、鲑点石斑鱼、青石斑鱼、赤点石斑鱼和七带石斑鱼的mtDNA分子大小分别为(18.52±0.21)kb、(18.44±0.21)kb、(18.56±0.18)kb、(18.57±0.19)kb和(18.36±0.11)kb.通过单、双酶切分析,分别构建了蜂巢石斑鱼10种酶共20个酶切位点、鲑点石斑鱼9种酶共17个酶切位点、青石斑鱼8种酶共16个酶切位点、赤点石斑鱼7种酶共12个酶切位点和七带石斑鱼7种酶共13个酶切位点的酶切物理图谱.BglⅡ和XhoⅠ两种内切酶的酶切谱带可作为鉴别这5种石斑鱼的RFLP标记.[中国水产科学,2006,13(3):344-351]【总页数】8页(P344-351)【作者】杨少闻;刘楚吾【作者单位】广东海洋大学,水产学院,广东,湛江,524025;广东海洋大学,水产学院,广东,湛江,524025【正文语种】中文【中图分类】Q959.483【相关文献】1.福建两个蛋鸭品种和常见野鸭线粒体DNA(mtDNA)限制性酶切图谱的比较 [J], 陈奕欣;赵扬;吕良炬;赖垣忠2.鲫不同种系线粒体DNA物理图谱的构建 [J], 张辉;吴清江3.两种笛鲷线粒体DNA物理图谱的构建 [J], 王中铎;刘楚吾;郭昱嵩4.玉米CMS线粒体DNA R多型性分析及物理图谱构建 [J], 张翅;张方东;郑用琏5.IBR病毒实验室变异株DNA的酶切分析及物理图谱 [J], 童光志因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

长江草鱼群体MHC ClassⅡB基因的克隆、表达及多态性分析的开题报告

长江草鱼群体MHC ClassⅡB基因的克隆、表达及多态性分析的开题报告一、研究背景MHC（Major Histocompatibility Complex）基因是一组高度多态性的基因，能够编码一种特殊的蛋白质即MHC分子，在免疫系统中发挥非常重要的作用。

MHC分子可以识别并结合外来抗原，将其呈递给T细胞，从而激活免疫系统。

因此，MHC基因的研究对了解稳定遗传和免疫选择在自然种群中的作用具有重要意义。

长江草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国一种重要的经济鱼类，具有广泛的分布和高经济价值。

然而，长江草鱼的免疫机制和遗传多样性方面的研究十分有限。

因此，深入研究长江草鱼MHC基因的多态性和表达规律，对于了解其免疫机制和遗传多样性具有重要意义。

二、研究目的1. 克隆长江草鱼MHC ClassⅡB基因的全长序列。

2. 分析长江草鱼MHC ClassⅡB基因在不同组织中的表达情况。

3. 分析长江草鱼MHC ClassⅡB基因的多态性。

三、研究内容和方法1.克隆长江草鱼MHC ClassⅡB基因的全长序列采用PCR方法克隆长江草鱼MHC ClassⅡB基因的全长序列。

首先设计一对MHC ClassⅡB基因的引物，利用鱼类基因组DNA作为PCR模板，扩增得到目的基因。

将PCR产物克隆到TA克隆载体中，测序确定MHC ClassⅡB基因的全长序列。

2.分析长江草鱼MHC ClassⅡB基因在不同组织中的表达情况以不同组织分别提取总RNA，通过RT-PCR方法分析长江草鱼MHC ClassⅡB基因在不同组织中的表达情况。

利用qPCR技术对MHC ClassⅡB基因表达水平进行定量分析。

3.分析长江草鱼MHC ClassⅡB基因的多态性采用PCR-SSP方法对长江草鱼不同个体MHC ClassⅡB基因进行多态性分析。

利用多组特异性引物和PCR程序，在PCR反应中检测样本中是否存在某种特异性MHC ClassⅡB基因。