酶切注意事项
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酶切体系300ul
酶切体系300ul
（原创版）
目录
1.酶切体系的概念
2.酶切体系的组成
3.酶切体系的应用
4.酶切体系的注意事项
正文
酶切体系是一种用于分子生物学实验的技术，主要通过酶的切割作用，将大分子物质切割成小分子物质，以便于进行后续的实验操作。
酶切体系主要由以下几部分组成：首先是酶，通常使用的是限制性内切酶，它可以识别特定的核苷酸序列，并在这些位点上切割 DNA 分子。
其次是底物，通常是 DNA 分子，可以是纯化的 DNA 片段，也可以是全基因组 DNA。此外，还需要缓冲液，用于维持反应的 pH 和离子浓度。
酶切体系广泛应用于分子生物学实验中，比如基因克隆、基因编辑、基因检测等。通过酶切体系，可以精确地将目标 DNA 片段切割出来，然
后进行后续的实验操作，如连接、转染、扩增等。
在使用酶切体系时，需要注意以下几点：首先，需要选择合适的酶，使其能够识别并切割目标 DNA 片段。其次，需要控制好反应条件，如温度、时间、pH 等，以保证酶的活性和切割效果。
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双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点
1.选择适当的酶切位点：在进行双酶切连接反应之前，需要选择适当
的酶切位点。这些酶切位点应该满足以下几个要求：
-位点不应该在目标DNA序列中出现，以避免酶切产生剪切产物；
-两种酶切位点应该在目标DNA序列中相对靠近，以确保连接的有效性；
-酶切位点的序列应该被两种酶同时识别和切割。
2.协议的优化：双酶切连接反应的协议需要进行优化，以确定最适合
的条件。一些重要的实验条件包括反应缓冲液的成分和浓度、酶的浓度和
反应温度。对于每个反应参数，应该进行范围的优化实验，以确定最佳的
条件。
3.应用正确的酶切酶：双酶切连接反应需要同时使用两种酶来进行切割。这些酶应该是互相兼容的，并且能够在相同的反应缓冲液中活性。此外，酶的纯度和活性也应该得到保证，以确保酶切的效果。
4.反应的时间和温度：双酶切连接反应的时间和温度都需要进行优化。反应时间应该足够长，以确保两种酶都能充分切割目标DNA序列，并且不
会出现过度切割的情况。反应温度也应该适中，通常在酶的推荐温度范围
内选择。
5.质量控制：在完成双酶切连接反应之后，应该进行质量控制以确保
反应的成功。常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳和DNA测序。通过这些方法，可以检测连接产物的大小和纯度，并确认连接的正确性。
6.反应产物的处理：根据实验需要，对双酶切连接反应的产物进行处理。这可能包括：
-凝胶电泳分离：使用琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的连接产物；
-提取纯化：通过凝胶电泳或商业化学试剂盒，从琼脂糖凝胶中提取并纯化连接产物；
-DNA测序：对连接产物进行测序，以确认连接的正确性。
酶切鉴定步骤
酶切鉴定步骤
1. 任务概述
酶切鉴定是一种常用的分子生物学实验技术，用于确定DNA或RNA分子的特定序列。该技术主要依赖于酶切酶的作用，通过将DNA或RNA分子切割成特定的片段，然后使用凝胶电泳等方法来分离和鉴定这些片段。本文将详细介绍酶切鉴定的步骤及相关注意事项。
2. 实验材料和试剂准备
在进行酶切鉴定实验前，需要准备以下材料和试剂： - DNA或RNA样本 - 酶切酶
- 缓冲液 - 脱水酒精 - 乙酸钠 - 等电聚丙烯酰胺凝胶（PAGE） - DNA分子量标
记物 - DNA染料
3. 实验步骤
3.1 样本处理
首先，需要从细胞或组织中提取DNA或RNA样本。提取方法可以根据具体实验目的和样本来源选择合适的方法，如酚/氯仿法、离心柱法等。提取的样本应该纯净且
浓度适中。
3.2 酶切反应
将提取的DNA或RNA样本加入适量的缓冲液中，然后加入所需的酶切酶。酶切酶的选择应根据目标序列的特点来确定，常用的酶切酶有限制性内切酶、反转录酶等。在酶切反应中，需要注意以下几点： - 反应温度和时间：根据酶切酶的要求，选
择适当的温度和反应时间。一般来说，酶切反应温度在37°C到65°C之间，反应时间从数分钟到数小时不等。 - 缓冲液配制：根据酶切酶的要求，准确配制适量
的缓冲液。不同的酶切酶可能需要不同的缓冲液pH值和离子浓度。 - 酶切酶浓度：根据样本的浓度和酶切酶的活性，确定合适的酶切酶浓度。一般来说，酶切酶浓度在10-1000单位/μg DNA或RNA之间。 - 酶切反应控制：在酶切反应中，需要设
置阴性对照和阳性对照。阴性对照是不加酶切酶的样本，用于判断实验中是否存在非特异性切割。阳性对照是已知酶切酶切割位点的样本，用于验证酶切酶的活性。
酶切和回收
另外，公司提供的酶的缓冲液浓度 通常为10 X储存液，因此，反应体系中 应加入总体积的十分之一体积量的缓冲 液对酶切反应是最合适的。
保护碱基
限制性内切酶的酶切位点两侧的保护碱 基是在设计PCR的引物时加入的。 NdeⅠ的保护碱基 5’-CTACTTCTGCATATGGCGAATTCCGGC NotⅠ的保护碱基 5-GATGATGATGGGCGCCGCGATGGTGGA (横线部分为酶切位点）
保护碱基对酶切效率的影响
酶切位点两侧的保护碱基的长短对酶切效率有十分重要的影响。 限制酶 碱基序列 链长 切割%、 NdeⅠ 2h 20 h
CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC
注意事项
电泳所用的胶的浓度为0.7%，胶经冻融 后，孔径较大，利于挤压。 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏， 故尽量放置于暗室，切带时应使用长波 长紫外灯，切胶时间尽量短。 在切胶时，要注意尽量沿目的片段的边 缘切下，使其所带的琼脂糖尽量少。这 样琼脂糖不会影响后面的提纯。
源自文库 星号活力
又称为第二活力，是指改变了酶切反应条件后 特意序列的识别特性降低的一种现象。由于识 别特异性降低，可能对原识别序列相似的序列 也产生切割。如EcoR Ⅰ的典型识别序列为 GAATTC，条件改变后，其识别序列由原来的 六核苷酸降为四核苷酸 AATT。高浓度甘油、 高PH、低离子强度、DMSO、β -巯基乙醇、 MN2+ 等的存在可能导致酶产生星活力。
酶切反应注意事项
酶切反应注意事项
酶切反应
一、建立一个标准的酶切反应
目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。
二、选择正确的酶
不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。
三、酶
内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。
四、 DNA
待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。
酶切反应注意事项
1、DNA纯度
一般而言，纯度高的DNA（即混入的蛋白质、RNA或多糖类物质较少）容易被限制性内切酶消化，基因重组是严重洪的所有酶促反应都有类似共性，因此应尽量提高DNA纯度。若DNA不能被限制性内切核酸酶切割，应对DNA样品进行酚抽提、乙醇沉淀等操作，以提高DNA纯度。下列因素影响DNA纯度：
(1)DNA样品中常常杂有RNA，虽然它的存在不影响酶的反应速度，但RNA可和酶蛋白
发生非特异性结合而减少酶的有效浓度，使酶解不彻底。另外，RNA在凝胶电泳中
呈现的区带会掩盖该区带范围内的DNA片段的呈现，干扰DNA片段的观察。
(2)一般来说，少量蛋白质的污染对DNA酶解的影响不大，但如果杂有核酸酶等蛋白质，
就会干扰酶切反应，并影响酶解产物。有一类蛋白质叫结合蛋白，他能与DNA发生
非特异结合，不仅封闭DNA上的识别序列而影响酶切反应，而且DNA与蛋白质结
合物在凝胶电泳上迁移甚慢，从而改变DNA片段在电泳图谱中的位置，影响DNA
片段的定性分析。
(3)样品中杂有其他DNA，如制备的质粒DNA中含有染色体DNA片段等，它们不影响
酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。
(4)DNA样品中的其他杂志，如Hg2+、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，这些杂
质常常是制备过程中不慎带进的，它们影响酶切速度，甚至改变识别特异性，出现
酶的第二活性。
2、DNA甲基化
限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应（如甲基化酶的甲基化反应），则该DNA不能被限制酶再切割。甲基化酶是大多数大肠杆菌菌株中都存在
酶切原理及步骤
酶切原理及步骤
一、酶切原理
1.酶切反应
酶切反应是指使用酶作为催化剂，对底物进行切割或降解的反应。在酶切反应中，酶的活性中心与底物特异性结合，通过催化作用将底物分解成小分子片段。
2.酶切位点
酶切位点是指酶与底物特异性结合的部位。不同的酶具有不同的酶切位点，通常由特定的氨基酸序列组成。
3.酶切动力学
酶切动力学描述了酶切反应的速度和底物浓度之间的关系。在一定条件下，当底物浓度高于某一阈值时，反应速度将达到最大值。
二、酶切步骤
1.酶液准备
在进行酶切实验前，需要准备适量的酶液。根据实验需求选择合适的酶种类和浓度。通常，酶液需要在冰箱中冷藏保存。
2.样品准备
将待测样品进行预处理，以便与酶液混合后进行反应。样品处理方法因实验而异，常见的处理方法包括细胞破碎、蛋白质提取等。
3.酶切反应设置
将准备好的酶液和样品混合，加入适量的缓冲液（如pH 7.4的Tris-HCl缓冲液），设置反应温度和时间。
4.酶切反应温度和时间设置
根据所选酶的活性要求和实验条件，设置适宜的反应温度和时间。通常，适宜的反应温度为37℃，反应时间因底物种类和浓度而异。
5.反应终止和产物检测
在反应结束后，需要终止反应并检测产物。常用的终止方法包括加入酚/氯仿抽提、加热或加入抑蛋白剂。产物检测方法因实验而异，常见的检测方法包括蛋白质印迹、电泳、光谱分析等。
三、酶切实验设计
1.酶种选择
2.根据实验需求选择合适的酶种类。不同的酶具有不同的特异性，需要根据
目标蛋白质序列选择具有相应酶切位点的酶。同时还需要考虑所选酶的活性、稳定性和安全性。
3.实验条件优化在进行酶切实验前，需要对实验条件进行优化。主要包括底
质粒dna的酶切注意事项
质粒dna的酶切注意事项
在进行质粒DNA的酶切实验时，需要注意以下事项：
1. 选择合适的酶：根据质粒DNA上的目标片段的长度和序列选择适合的限制性内切酶。确保酶的活性和适应温度等符合实验要求。
2. 控制酶切反应条件：酶切反应通常需要在特定的缓冲液中进行，确保缓冲液中的离子浓度、pH、温度等参数符合酶的要求，以保证酶的活性和稳定性。
3. 质粒DNA的纯度和浓度：使用纯度较高且浓度适当的质粒DNA进行酶切实验，以避免其他污染物的干扰或质粒DNA浓度过低的问题。
4. 酶切反应时间和温度：根据酶的特性和实验要求，控制酶切反应的时间和温度。一般情况下，酶切反应需要在适宜的温度下进行一定时间，以保证完全的酶切反应。
5. 酶切后的处理：酶切反应结束后，需进行适当的处理。如加入加热退火酶、磷酸酶等对酶活进行灭活；对反应产物进行凝胶电泳分析；采用柱层析、酚/氯仿提取等方法纯化目标片段等。
6. 实验操作的严谨性：酶切实验需要操作具有较高的严谨性和技巧性，避免因操作失误引入额外的误差。在操作过程中，应保持实验环境的清洁，避免外源性
污染。
7. 安全措施：在进行酶切实验时，应遵守实验室的安全措施，包括佩戴实验手套、开启实验室排风设备等，以保障个人和实验室安全。
酶切注意事项及问题
一、之阳早格格创做
二、修坐一个尺度的酶切反应
暂时大普遍钻研者按照一条准则，即10个单位的内切酶不妨切割1μg分歧根源战杂度的DNA.常常，一个50μl 的反应体系中，1μl的酶正在1X NEBuffer末浓度及相映温度条件下反应1小时即可落解1μg已杂化好的DNA.
如果加进更多的酶，则可相映收缩反当令间；如果缩小酶的用量，对付许多酶去道，相映延少反当令间（不超出16小时）也可真足反应.
二、采用精确的酶
不问可知，采用的酶正在底物DNA上必须起码有一个相映的辨别位面.辨别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更一再天切割底物.假设一个GC含量50%的DNA链，一个辨别4个碱基的酶将仄衡正在每44（256）个碱基中切割一次；而一个辨别6个碱基的酶将仄衡正在每46（4096）碱基切割一次.内切酶的产品不妨是粘端的（3’或者5’超过端），也不妨是仄端的片段.粘端产品不妨与相容的其余内切酶产品连交，而所有的仄端产品皆不妨互贯串交.相闭疑息拜睹目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文.
三、酶内切酶一朝拿出冰箱后应当坐时置于冰上.酶应当是末尾一个被加进到反应体系中（正在加进酶之前所有的其余反应物皆应当已经加好并已预混同）.酶的用量视正在底物上的切割频次而定.比圆，超螺旋战包埋法切割的DNA常常需要超出1U/μg的酶才搞被真足切割.拜睹目录第244战264之"切割量粒DNA"战"包埋法切割DNA".
四、 DNA 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或者过多盐离子的传染，免得搞扰酶的活性.DNA 的甲基化也该当是酶切要思量到的果素.闭于甲基化的真量，拜睹第252页至253页之甲基化相闭真量.
质粒提取及酶切实验的注意事项
质粒提取及酶切实验的注意事项
一、前言
质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的实验技术。在执行实验时，需要遵
守一些注意事项，以确保实验能够成功并得出可靠的结果。本文将重点介绍质粒提取和酶切实验中应注意的事项。
二、质粒提取实验的注意事项
1.使用高质量的DNA提取试剂：DNA提取试剂的质量对提取的DNA质量和
纯度有很大的影响，因此选择高质量的试剂非常重要。
2.应用适当的细胞培养技术：细胞培养技术对于细胞表达和提取相应DNA质
量至关重要，因此选择合适的培养条件非常重要。
3.注意DNA的浓度：在质粒提取过程中，需要注意DNA的浓度，因为浓度过
低或过高都会影响后续的实验结果。
4.遵守标准协议：在进行质粒提取实验时，必须严格遵守标准协议，包括使用
正确的试剂、设备和方法。
5.注意杂质的干扰：在提取质粒的过程中，可能会出现杂质，如蛋白质或RNA。这些杂质可能会干扰后续实验的结果，因此必须尽可能去除。
三、酶切实验的注意事项
1.使用高质量的酶：选择适当的酶是酶切实验成功的关键。不同的酶适用于不
同的DNA序列，因此必须选择合适的酶。
2.注意酶的浓度和反应时间：酶切实验中，酶的浓度和反应时间都对结果有很
大的影响，因此必须严格控制这些参数。
3.遵循标准协议：遵循酶切实验的标准协议非常重要，包括所需的材料、浓度、反应时间严格按照说明书进行。
4.注意反应体系的条件：酶切反应过程需要在适当的缓冲液中进行。必须确保
缓冲液的pH、离子浓度、反应温度等条件是合适的。
5.注意合适的质控实验：在酶切反应中，应该与相应的对照样品一起进行，以
酶切注意事项及问题
一、之杨若古兰创作
二、建立一个尺度的酶切反应
目前大多数研讨者遵守一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg分歧来源和纯度的DNA.通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及响应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA.如果加入更多的酶，则可响应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对很多酶来说，响应耽误反应时间（不超出16小时）也可完好反应.
二、选择精确的酶
不问可知，选择的酶在底物DNA上必须至多有一个响应的识别位点.识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物.假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次.内切酶的产品可所以粘端的（3’或5’突出端），也能够是平端的片段.粘端产品可以与相容的其它内切酶产品连接，而所有的平端产品都可以互相连接.相干信息拜见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文.
三、酶
内切酶一旦拿出冰箱后该当立即置于冰上.酶该当是最初一
个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都该当曾经加好并已预混合）.酶的用量视在底物上的切割频率而定.例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常须要超出1U/μg的酶才干被完好切割.拜见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA".
四、 DNA 待切割的DNA该当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的净化，以避免干扰酶的活性.DNA的甲基化也应当是酶切要考虑到的身分.关于甲基化的内容，拜见第252页至253页之甲基化相干内容.
酶切注意事项及问题
1、建立一个标准的酶切反应
目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。
二、选择正确的酶
不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的
Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。
三、酶
内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而
定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。
四、 DNA
待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第252页至
限制性内切酶酶切注意事项
一、限制性内切酶酶切注意事项
在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：
1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。
2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。
3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应。
4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。
5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。
6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。
7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：
酶切注意事项及问题
一、之马矢奏春创作
三、建立一个标准的酶切反应
目前年夜大都研究者遵循一条规则, 即10个单元的内切酶可以切割1μg分歧来源和纯度的DNA.通常, 一个50μl的反应体系中, 1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA.如果加入更多的酶, 则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量, 对许多酶来说, 相应延长反应时间（不超越16小时）也可完全反应.
二、选择正确的酶
不言而喻, 选择的酶在底物DNA上必需至少有一个相应的识别位点.识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物.假设一个GC含量50%的DNA链, 一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次.内切酶的产物可以是粘真个（3’或5’突出端）, 也可以是平真个片段.粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接, 而所有的平端产物都可以互相连接.相关信息拜会目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt E nds一文.
三、酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上.酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）.酶的用量视在底物上的切割频率而定.例如, 超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超越1U/μg的酶才华被完全切割.拜会目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA".
四、DNA 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染, 以免干扰酶的活性.DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素.关于甲基化的内容, 拜会第252页至253页之甲基化相关内容.
酶切注意事项
酶切注意事项
1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端⾄少保留有若⼲个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。
2、回收PCR产物：回收的PCR产物⽚段=1：10 ，⼀般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g 单位的 DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分⼦量）所得数值即为?g,也可以直接⽤这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66µg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。
3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多⼈建议酶切过夜，其实完全没有必要，⼀般酶切3个⼩时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。酶切体系不宜过⼤，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最⼤量，否则酶切不完全，酶的⽤量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解 1ugDNA。
4、两种酶切的条件不同时，分别进⾏两次酶切，切完⼀个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切⾼温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切⾼盐浓度要求的。
5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因⼦螯合，影响酶切效果，可放⼤酶切体积或重新浓缩质粒。
6、限制酶的选择⾮常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率⾼的限制酶，提前看好各公司的双切酶所⽤公⽤的BUFFER，以及各酶在公⽤BUFFER⾥的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
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酶切
DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。
DNA酶切及凝胶电泳
一.DNA的限制性内切酶酶切分析
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC ↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'
3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。
构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。
在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一
般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。
二. 凝胶电泳
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进
行DNA电泳。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
1、 DNA的分子大小:
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
2、琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb 的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、 DNA分子的构象
当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同
一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
4、电源电压
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。
5、嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
6、离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。
第二节材料、设备及试剂