植物细胞的遗传转化文稿演示
合集下载
植物遗传转化大实验
植物遗传转化大实验一、实验目的与原理简介农杆菌介导的遗传转化系统是外源DNA进入植物细胞的最成功和应用最广泛的方法，农杆菌可浸染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至裸子植物。
转化植物细胞的农杆菌主要有两类，即根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。
已有研究表明，影响农杆菌介导植物基因转化的因素很多，农杆菌菌株、植物基因型和外植体、培养方法、不同的选择标记等因素都影响农杆菌介导的遗传转化。
目前报道已有许多植物通过农杆菌的遗传转化获得了转基因植株或毛状根。
二、发根农杆菌介导的遗传转化步骤1．无菌组织的培养取组培苗幼嫩叶片，在超净工作台中切成0.5x0.5cm的方块，并在叶片上刻痕，接种于愈伤诱导培养基中，暗培养3周后作为受体。
在农杆菌浸染前，将愈伤组织在无菌条件下切割成小块在愈伤诱导培养基上分别预培养，增加受体细胞的活性进而提高转化率。
2．农杆菌的培养在转化平板上挑取c58c1单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。
在50ml农杆菌培养基（含相应抗生素）中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃振荡培养过夜；室温下4000rpm, 10min，弃上清夜，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600=0.5左右。
3．共培养剪取无菌苗的叶片和茎段，放入发根农杆菌MS悬液中浸泡5min，倒出悬液，用无菌吸水纸吸干表面余菌，转到共培养培养基MS上，光照培养2天。
4．毛状根的诱导和培养将共培养的外植体转入到1/2 MS + Cef 500mg/L培养基上光照培养。
随时检测外植体的染菌情况，如出现细菌生长过多，须马上转移到新筛选培养基中培养。
20天左右即可长出毛状根，剪取毛状根，接种于1/2 MS + Cb 250mg/L培养基上暗培养数周，选择生长快、分枝好的毛状根转入脱菌筛选培养基中继代筛选。
8 园艺植物遗传转化PPT课件
8
农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了
共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
9
农杆菌和基因枪转化的特点比较
2，基因枪法转化的特点： 不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞
作为靶材料。 操作简便。 常常是多拷贝转化和整合，因而易造成转基
21
第二节 转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.3，两种形式的共同特点： 1）外植体材料来源广泛； 2）适用的植物物种范围广； 3）再生植株群体变异大。
22
第二节 转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
2，不经过愈伤组织的受体系统 也称直接分化受体系统，指直接对外植体
3，外植体的类型和生理状态 只有处在细胞分裂的S期（DNA合成
期）的细胞才具有被转化的能力，这个 时期称为“转化的敏感期”。
能够进行活跃分裂的细胞组织，例如， 分生组织，形成层组织，愈伤组织等， 都是合适的转化受体组织。
31
第二节 转化的受体系统
四、影响系统转化效率的因素
4，外植体的预培养 目的是调整受体的状态，促进细胞分裂，提高
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.2，两种形式的不同点
1）在用农杆菌进行转化时，前一种形式的 带菌培养的时间比较长，需要采用添加抗生素 的培养基在抑制农杆菌增殖的情况下诱导愈伤 组织的形成和增殖愈伤组织。
2）前一种形式的扩繁量较大，来自同一转 化事件的个体数目相对较多，转化体为嵌合体 的情况相对较少。
2，较高的遗传稳定性 通过遗传转化导入外源基因的目的是在保持
农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了
共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
9
农杆菌和基因枪转化的特点比较
2，基因枪法转化的特点： 不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞
作为靶材料。 操作简便。 常常是多拷贝转化和整合，因而易造成转基
21
第二节 转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.3，两种形式的共同特点： 1）外植体材料来源广泛； 2）适用的植物物种范围广； 3）再生植株群体变异大。
22
第二节 转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
2，不经过愈伤组织的受体系统 也称直接分化受体系统，指直接对外植体
3，外植体的类型和生理状态 只有处在细胞分裂的S期（DNA合成
期）的细胞才具有被转化的能力，这个 时期称为“转化的敏感期”。
能够进行活跃分裂的细胞组织，例如， 分生组织，形成层组织，愈伤组织等， 都是合适的转化受体组织。
31
第二节 转化的受体系统
四、影响系统转化效率的因素
4，外植体的预培养 目的是调整受体的状态，促进细胞分裂，提高
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.2，两种形式的不同点
1）在用农杆菌进行转化时，前一种形式的 带菌培养的时间比较长，需要采用添加抗生素 的培养基在抑制农杆菌增殖的情况下诱导愈伤 组织的形成和增殖愈伤组织。
2）前一种形式的扩繁量较大，来自同一转 化事件的个体数目相对较多，转化体为嵌合体 的情况相对较少。
2，较高的遗传稳定性 通过遗传转化导入外源基因的目的是在保持
植物组织培养：第十三章 植物遗传转化
• 在农杆菌侵染外植体前进行预培 养可以减轻伤害胁迫，调整细胞状 态。
• 接种时所用菌液浓度和侵染时间 是影响转基因植株再生的关键因素 之一。
• 共培养：接种菌体后的外植体培养 在诱导愈伤组织或不定芽固体培养基 上，在外植体细胞分裂、生长的同时， 农杆菌在外植体切口面也增殖生长， 两者共同培养的过程称为～。
• Horsch等(1985)首创叶盘法，用根 癌农杆菌感染烟草叶片外植体，获得 了转基因烟草。
（一）生物学特性与转 化原理
1.生物学特性
• 根癌农杆菌将Ti质粒的DNA片 段、发根农杆菌将Ri质粒的DNA 片段导入植物细胞的基因组中，导 致植物发生冠瘿瘤和毛状根。
• 根据携带不同Ti质粒的根癌农杆 菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿碱类 型，将根癌农杆菌分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆碱型三种根癌农杆 菌。
一、农杆菌介导法
• Ackermann(1977)，Wullems等 (1981)，De Greve等(1982)和Spano 等(1982)首先在烟草和马铃薯中由Ri质 粒和Ti质粒转化的细胞再生出植株。
• Zambryski等(1983)和De Block等 (1984)以及Horsch等(1985)分别报道 了用切去癌基因的根癌农杆菌和发根 农杆菌进行遗传转化，获得了形态正 常的转基因植物。
第十三章 植物遗传转化
• 植物遗传转化（plant genetic transformation）：是指将外源基因 转移到植物体内并稳定地整合表达与 遗传的过程。
• 农杆菌介导法、基因枪法、植株原 位真空渗入法、电击法、聚已二醇法、 花粉管通道法、显微注射法、激光微 束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、 脂质体法
（5） Vir区基因的活化
• 大多数双子叶植物受伤后，植物 细胞会分泌某些酚类化合物，这些 酚类化合物可诱导Vir区基因活化， 使农杆菌转化成为可能。
• 接种时所用菌液浓度和侵染时间 是影响转基因植株再生的关键因素 之一。
• 共培养：接种菌体后的外植体培养 在诱导愈伤组织或不定芽固体培养基 上，在外植体细胞分裂、生长的同时， 农杆菌在外植体切口面也增殖生长， 两者共同培养的过程称为～。
• Horsch等(1985)首创叶盘法，用根 癌农杆菌感染烟草叶片外植体，获得 了转基因烟草。
（一）生物学特性与转 化原理
1.生物学特性
• 根癌农杆菌将Ti质粒的DNA片 段、发根农杆菌将Ri质粒的DNA 片段导入植物细胞的基因组中，导 致植物发生冠瘿瘤和毛状根。
• 根据携带不同Ti质粒的根癌农杆 菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿碱类 型，将根癌农杆菌分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆碱型三种根癌农杆 菌。
一、农杆菌介导法
• Ackermann(1977)，Wullems等 (1981)，De Greve等(1982)和Spano 等(1982)首先在烟草和马铃薯中由Ri质 粒和Ti质粒转化的细胞再生出植株。
• Zambryski等(1983)和De Block等 (1984)以及Horsch等(1985)分别报道 了用切去癌基因的根癌农杆菌和发根 农杆菌进行遗传转化，获得了形态正 常的转基因植物。
第十三章 植物遗传转化
• 植物遗传转化（plant genetic transformation）：是指将外源基因 转移到植物体内并稳定地整合表达与 遗传的过程。
• 农杆菌介导法、基因枪法、植株原 位真空渗入法、电击法、聚已二醇法、 花粉管通道法、显微注射法、激光微 束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、 脂质体法
（5） Vir区基因的活化
• 大多数双子叶植物受伤后，植物 细胞会分泌某些酚类化合物，这些 酚类化合物可诱导Vir区基因活化， 使农杆菌转化成为可能。
十章园艺植物遗传转化1ppt课件
为了抑制农杆菌的过度生长而产生污染，选择、 筛选转化的细胞核植株，在遗传转化中常使用两类 抗生素： 1）选择性抗生素：在遗传转化中用于筛选转化体，如 卡那霉素、潮霉素 2）抑菌性抗生素：在受体材料与农杆菌共培养一定时 间后用于抑制农杆菌的生长 ，防止细菌过度生长而 产生污染。这类抗生素要求对植物细胞无毒害作用 或毒害作用较小，不影响植物细胞的正常生长，如 氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢霉素等
第二节 园艺植物遗传转化方法
一、外源裸露DNA的转化
（一）化学诱导转化法
化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定 的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。
目前用于转化细胞的化学物质有聚乙二醇（PEG）、聚鸟 氨酸、聚乙烯醇等，其中最常用的化学物质是PEG。
第二节 园艺植物遗传转化方法
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
（2）原生质体受体系统
原生质体转化受体系统的优点： a）原生质体无细胞壁，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传 物质 b）通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克 隆，无嵌合性愈伤组织，由其再生的转基因植株无嵌合性 c）原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制 条件下进行准确的转化和嵌合 d）适用于各种转化系统
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
(5)对农杆菌侵染的敏感性
1）农杆菌介导的 遗传转化体系需要受体材料是农杆菌的 天然寄主，否则难以实现遗传转化
2）农杆菌Ti或Ri质粒是植物遗传转化的有效载体系统，但 其宿主范围局限于部分双子叶植物，对大部分单子叶植 物和裸子植物不敏感，不同植物，同一植物的不同组织 细胞对农杆菌的敏感性也有很大差 因而，在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统 对农杆菌的敏感性，只有农杆菌侵染敏感的植物才能作 为受体系统
第二节 园艺植物遗传转化方法
一、外源裸露DNA的转化
（一）化学诱导转化法
化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定 的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。
目前用于转化细胞的化学物质有聚乙二醇（PEG）、聚鸟 氨酸、聚乙烯醇等，其中最常用的化学物质是PEG。
第二节 园艺植物遗传转化方法
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
（2）原生质体受体系统
原生质体转化受体系统的优点： a）原生质体无细胞壁，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传 物质 b）通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克 隆，无嵌合性愈伤组织，由其再生的转基因植株无嵌合性 c）原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制 条件下进行准确的转化和嵌合 d）适用于各种转化系统
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
(5)对农杆菌侵染的敏感性
1）农杆菌介导的 遗传转化体系需要受体材料是农杆菌的 天然寄主，否则难以实现遗传转化
2）农杆菌Ti或Ri质粒是植物遗传转化的有效载体系统，但 其宿主范围局限于部分双子叶植物，对大部分单子叶植 物和裸子植物不敏感，不同植物，同一植物的不同组织 细胞对农杆菌的敏感性也有很大差 因而，在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统 对农杆菌的敏感性，只有农杆菌侵染敏感的植物才能作 为受体系统
《植物转基因技术》PPT课件
其中以T-DNA区和毒性区（vir-region）在 植物转化中最为重要。
T-DNA区：能够转移整合入植物受体基因组， 并能在植物细胞中表达，从而导致 冠瘿瘤发生。
Vir区：由多个毒性基因组成， 其编码蛋白对 T-DNA的转移和整合 必不可少。
1.Ti质粒上的T-DNA：
仅存在于被感染植物细胞的细胞核中，整 合到植物基因组中 ，T-DNA以单拷贝或多拷贝 形式插入植物基因组中,插入的位点也各不相同。
实例 小麦的基因枪转化
3、幼胚的高渗预培养： 4、微弹的制备与基因枪的轰击（无菌）： 5、抗PPT愈伤组织的选择：白色生长快的为
外源质粒转化的愈伤（见图）。 6、抗PPT再生植株的获得：（见图）
实例 小麦的基因枪转化
7、抗PPT转化植株的耐盐性：
含盐0.7％NaCl条件下转化植株表现较强的耐盐性。
转化后的gus的瞬间表达转化后3周产生的抗性愈伤组织抗性愈伤的gus反应再生的转化植株转化植株叶片的gus表达抗性植株后代的抗性检测自1983年人类首次获得转基因植物后已有大量的抗病抗逆及品质改良的转基因植物获得成功在农业生产上已经发挥了重要的作用
《植物转基因技术》PPT 课件
植物转基因技术： 又称基因重组技术或DNA重组，
二）、转化载体系统：
Ti质粒载体系统一般分为两类： 一类叫共整合载体系统； 一类叫双元载体系统。
（一）、共整合载体质粒：
1.pGV3850 系 统 :
这是第一个非致癌的 Ti质粒衍生载体,来自 胭脂碱型质粒 pTiC58Trac, 包 括 25bp末端序列和胭脂 碱合成酶基因,T-DNA 上的其它基因则为 pBR322 序 列 取 代 。
5. 植物叶绿体基因工程
进行叶绿体遗传转化研究，建立了烟草叶绿体遗传 转化体系。并将一些基因转入烟草叶绿体。
T-DNA区：能够转移整合入植物受体基因组， 并能在植物细胞中表达，从而导致 冠瘿瘤发生。
Vir区：由多个毒性基因组成， 其编码蛋白对 T-DNA的转移和整合 必不可少。
1.Ti质粒上的T-DNA：
仅存在于被感染植物细胞的细胞核中，整 合到植物基因组中 ，T-DNA以单拷贝或多拷贝 形式插入植物基因组中,插入的位点也各不相同。
实例 小麦的基因枪转化
3、幼胚的高渗预培养： 4、微弹的制备与基因枪的轰击（无菌）： 5、抗PPT愈伤组织的选择：白色生长快的为
外源质粒转化的愈伤（见图）。 6、抗PPT再生植株的获得：（见图）
实例 小麦的基因枪转化
7、抗PPT转化植株的耐盐性：
含盐0.7％NaCl条件下转化植株表现较强的耐盐性。
转化后的gus的瞬间表达转化后3周产生的抗性愈伤组织抗性愈伤的gus反应再生的转化植株转化植株叶片的gus表达抗性植株后代的抗性检测自1983年人类首次获得转基因植物后已有大量的抗病抗逆及品质改良的转基因植物获得成功在农业生产上已经发挥了重要的作用
《植物转基因技术》PPT 课件
植物转基因技术： 又称基因重组技术或DNA重组，
二）、转化载体系统：
Ti质粒载体系统一般分为两类： 一类叫共整合载体系统； 一类叫双元载体系统。
（一）、共整合载体质粒：
1.pGV3850 系 统 :
这是第一个非致癌的 Ti质粒衍生载体,来自 胭脂碱型质粒 pTiC58Trac, 包 括 25bp末端序列和胭脂 碱合成酶基因,T-DNA 上的其它基因则为 pBR322 序 列 取 代 。
5. 植物叶绿体基因工程
进行叶绿体遗传转化研究，建立了烟草叶绿体遗传 转化体系。并将一些基因转入烟草叶绿体。
植物遗传转化方法和技术PPT课件
第35页/共56页
每外植体芽数 Shoots per explant
7 6 5 4 3 2 1 0
品种 variety
1.0mg/L 1.2mg/L 1.5mg/L 1.7mg/L 2.0mg/L
科 丰 6
科 丰 14
冀 豆 12
吉 林 35
铁 丰 29
无 腥 一 号 冀 黄 13
第36页/共56页
到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、 果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。
第41页/共56页
2、操作步骤：
（1）制备DNA微弹； （2）准备靶外植体材料； （3）DNA微弹轰击； （4）培养轰击后的外植体．
immature embryos
第42页/共56页
high osmotic media prepare calli
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而 是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
第24页/共56页
3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因 型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多 种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
• 现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和 受体细胞等归纳如图4-1。
第5页/共56页
第6页/共56页
一、根癌农杆菌介导法
• 根癌农杆菌介导法的分子机制 • 农杆菌介导法需要具备的条件 • 农杆菌介导法的基本流程
第7页/共56页
（一）根癌农杆菌介导法的分子机制
每外植体芽数 Shoots per explant
7 6 5 4 3 2 1 0
品种 variety
1.0mg/L 1.2mg/L 1.5mg/L 1.7mg/L 2.0mg/L
科 丰 6
科 丰 14
冀 豆 12
吉 林 35
铁 丰 29
无 腥 一 号 冀 黄 13
第36页/共56页
到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、 果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。
第41页/共56页
2、操作步骤：
（1）制备DNA微弹； （2）准备靶外植体材料； （3）DNA微弹轰击； （4）培养轰击后的外植体．
immature embryos
第42页/共56页
high osmotic media prepare calli
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而 是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
第24页/共56页
3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因 型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多 种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
• 现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和 受体细胞等归纳如图4-1。
第5页/共56页
第6页/共56页
一、根癌农杆菌介导法
• 根癌农杆菌介导法的分子机制 • 农杆菌介导法需要具备的条件 • 农杆菌介导法的基本流程
第7页/共56页
（一）根癌农杆菌介导法的分子机制
第十二三章植物细胞的遗传转化详解演示文稿
第49页，共68页。
抗逆-盐害
野生型油菜和转基因（AtNHX1）油菜经 200mM NaCl 处理10 周
第50页，共68页。
抗逆-冻害
冻害前 冻害后
冻害前 冻害后
野生型
转基因
野生型和转AtP5CS基因的烟草经过-2℃ 24h 处理
第51页，共68页。
抗虫
抗虫水稻
第52页，共68页。
• 美国最早研制得到抗虫棉花，我国科学家 将自己发现的蛋白酶抑制剂基因转入棉花 获得抗棉铃虫的棉花株。
菜5种，其中转基因大豆数量最多。2012年，我国进口大豆数量达
到5838万吨，大多为转基因大豆，作为食用油的加工原料。
第66页，共68页。
第十章 转基因植物
转基因植物 基因改良植物 转基因生物制药 转基因安全性
第67页，共68页。
4 转基因植物的安全性问题
• 转基因环境安全性
• 转基因食品安全性
接种后11天 症状（箭头）
第47页，共68页。
抗除草剂
占总转基因植 物种植面积的 77％，其中主 要为抗除草剂 大豆。
转基因
野生型 野生型
野生型
转基因
转基因
用0.1%草苷膦处理大豆叶片
具有除草剂抗性的大豆
第48页，共68页。
抗逆-盐害
野生型 转基因 未处理前
野生型 转基因 处理后
野生型和转基因（AtNHX1 ）番茄用200mM NaCl处理11周
• 1994年能比普通西红柿保鲜时间更长的转 基因西红柿投放市场，
1998年我国获得转基因耐储藏番茄，延长为60天
第57页，共68页。
品质改良-水果
转基因番木瓜
转基因香蕉
植物遗传转化(PPT-70)
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.3 胚性愈伤组织
愈伤组织的转化方法也适用于胚性愈伤组织。胚性愈伤组织的转 化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上获得成功。
芹 菜 胚 性 愈 伤 组 织 用 根 癌 农 杆 菌 C58C1 (pBZ6111) 感 染 后 ， 在 MS+2,4-D 1mg/L十KT0.1mg/L培养基上继代培养。在筛选到的氯霉素 抗性愈伤组织中检测到胭脂碱合成酶活性，表明外源基因已整合到 芹菜细胞基因组中并得到表达。抗性愈伤组织可在无激素的基本培 养基上增殖，但分化出的再生植株畸形(郑世学等，1996)。
பைடு நூலகம்
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.2 悬浮细胞
以悬浮细胞作受体的转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法、 PEG介导法、电激法和显微注射法等。
小麦幼胚悬浮细胞用JQ-700基因枪法转化，得到了GUS基因瞬间表 达的各项最适参数。他们还建立了‘冀谷11号’谷子幼穗的悬浮培 养细胞系及植株再生体系。将胚性悬浮细胞系接种到MS培养基， 20d继代1次，直至出现绿芽点；然后转入无激素的MS0或1/2 MS0 培养基分化植株。以基因枪轰击转化悬浮细胞后，放置48h，检测 GUS短暂表达频率TTF％为20％-40%；在添加200mg/L卡那霉素 的MS培养基上，有5％-10％的愈伤组织具有抗性，且能稳定传代 (董云洲等，1998)。
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation）
植物遗传转化
花椰菜遗传转化方法如图： 发根农杆菌介导 根瘤农杆菌介导
（三）林木遗传转化的技术
目前以掌握了杨树、白桦、桉树、落叶松、核 桃、苹果、沙田柚等树种外源基因转化技术。主要 转化方式是农杆菌介导法。增强植物抗病、耐高温、 耐旱等方面。
（四）药用植物遗传转化的技术
主要采用农杆菌介导法，其他方法成功的例子 极少。
第十七章：植物遗传转化
Section 1: 植物遗传转化的方法
Section 2: 转化植株的检测 Section 3: 几种植株遗传转化的 技术
植物遗传转化 （plan genetic transformation): 应用重组DNA技术、细胞组织培养 技术或种质 系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片 段插入到受体植物基因组中并通过减数分裂获 得新植株的技术。
•
（2）方法：人们将目的基因插入到经过 改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中， 近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物 (尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
（3）转化步骤可简单概括为以下方面：
Section 2: 转化植株的检测
以报告基因检测为例：
报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶
的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被 鉴定的基因。目前主要的报告基因如下：
Section 3: 几种植株遗传转化的技术
（一）大田作物遗传转化的技术
①油菜的遗传转化技术 农杆菌介导转化法：根据不同的基因型选择适的培养基。
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大 多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重 组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/ 分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定 （这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见 第五步） 几种方法进行检验（根据要求选取不同方 法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物 体进行个体生物学水平鉴定。
植物基因转化PPT课件
C、双元载体 • 利用两个载体分别提供T-DAN区域（卸甲的）和毒性功能
第20页/共29页
克隆载体
辅助质粒
共存于同一个农杆菌中，再由 农杆菌完成目的基因向植物基 因组的转移
第21页/共29页
四、其它DNA转化植物的方法
（一）原生质体转化 （二）基因枪 （三）整株植物转化 （四）叶绿体转化
第23页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
3、载体类型
B、共整合载体（Cointegratevectors）
由两个部分组成：
一个缺失了T-DNA上的肿瘤诱导基因的Ti质粒 一个中间载体（intermediate vector）组成 （一种在普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适 的T-DNA片断，而构成的小型质粒 ）。
（二）、致瘤Ti质粒
200 kb
第5页/共29页
根癌农-250kb，以下几个功能区
• 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 • 冠瘿碱代谢区 • Ti 质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移 • 毒性区（Vir）：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体 • DNA复制区（Rep）：参与Ti 质粒DNA复制
第6页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
（三）、 T-DNA 的转化 1、T－DNA的结构 • 是Ti质粒中转移到植物细胞中的部分，内含冠瘿碱合成和植物
激素合成相关的基因 • A. tumefaciens 利用冠瘿碱作为生长的碳源 • 左和右边界
➢T-DNA的左边界和右边界是T-DNA 从Ti 质粒切开的位点 ➢边界包含25 碱基的重复元件 ➢只有右边界是转移所必须的，但在克隆载体中，均含有两个边界
第11页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
第20页/共29页
克隆载体
辅助质粒
共存于同一个农杆菌中，再由 农杆菌完成目的基因向植物基 因组的转移
第21页/共29页
四、其它DNA转化植物的方法
（一）原生质体转化 （二）基因枪 （三）整株植物转化 （四）叶绿体转化
第23页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
3、载体类型
B、共整合载体（Cointegratevectors）
由两个部分组成：
一个缺失了T-DNA上的肿瘤诱导基因的Ti质粒 一个中间载体（intermediate vector）组成 （一种在普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适 的T-DNA片断，而构成的小型质粒 ）。
（二）、致瘤Ti质粒
200 kb
第5页/共29页
根癌农-250kb，以下几个功能区
• 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 • 冠瘿碱代谢区 • Ti 质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移 • 毒性区（Vir）：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体 • DNA复制区（Rep）：参与Ti 质粒DNA复制
第6页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
（三）、 T-DNA 的转化 1、T－DNA的结构 • 是Ti质粒中转移到植物细胞中的部分，内含冠瘿碱合成和植物
激素合成相关的基因 • A. tumefaciens 利用冠瘿碱作为生长的碳源 • 左和右边界
➢T-DNA的左边界和右边界是T-DNA 从Ti 质粒切开的位点 ➢边界包含25 碱基的重复元件 ➢只有右边界是转移所必须的，但在克隆载体中，均含有两个边界
第11页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1 转基因植物
1.1 受体
• 叶盘 • 原生质体 • 悬浮细胞 • 愈伤组织 • 胚状体 • 活体 • 等等
1.2 转基因方法
直接转化法 : 基因枪法 载体介导法：农杆菌介导法
1.2.1 直接转化法 基因枪法
**最早的基因枪（火药式）由美国康乃尔大学Sanford等 1987年设计制造 。
基本原理
抗逆-盐害
野生型油菜和转基因（AtNHX1）油菜经 200mM NaCl 处理10 周
抗逆-冻害
Ti质粒的功能区域
T-DNA的染色体整合机制
消毒
切取
土壤农杆菌 浸泡
叶盘
培养基
愈伤组织 分化幼苗
植物受体
抗生素筛选
分化出苗
生根壮苗
其它方法
植物病毒感染法 花粉管通道法 电穿孔转化法 激光微束穿孔转化法 显微注射法 超声波介导转化法 多聚物介导法 浸渍法 电泳法 碳化硅纤维介导法 真空渗透法 圆球体法 等等
2. 基因改良植物
除草剂 干旱
品质
盐害 冻害
非生物胁迫 生物体
热害
涝害
其他性状
虫害作物品种改良中的应用
抗虫 抗病毒 抗病 抗非生物胁迫 抗除草剂 改良作物品种 改变花的颜色和形状 转基因植株作为生物反应器
抗病大豆
（A）萎黄病（箭头所指）感染
野生型 转基因
抗病烟草
野生型
转基因
（B） 外源基因抵抗TMV对烟草的感染。 接种后11天 症状（箭头）
抗除草剂
占总转基因植 物种植面积的 77％，其中主 要为抗除草剂 大豆。
转基因
野生型 野生型
野生型
转基因
转基因
用0.1%草苷膦处理大豆叶片 具有除草剂抗性的大豆
抗逆-盐害
野生型 转基因 未处理前
野生型 转基因 处理后
野生型和转基因（AtNHX1 ）番茄用200mM NaCl处理11周
第十二章 种质保存
第一节 常温保存 第二节 常低温和低温保存 第三节 超低温保存
第十章 转基因植物
转基因植物 基因改良植物 转基因生物制药 转基因安全性
• 转基因植物是指利用生物或物理、化学等手 段将外源基因导入植物受体系统中，使之在 受体中得以表达，进而获得转基因植株的技 术体系。
基 因 转 化 的 的 基 本 步 骤
• 优点：
① 解决一些无性繁殖作物种质资源的低温、长期保 存问题，可有效避免资源的丢失；
② 节省土地和劳动力，保存方法简单，花费少且能 在保存中脱毒；
③ 在需要时，可快速繁殖，
④ 利于国际国内种质交换。
离体保存方法: 常温保存（25±5 ℃） 低温保存 （0-8 ℃）， 超低温保存（-80 - -196℃）
叶肉特异性表达 维管束特异表达
叶特异性表达
茎特异表达
GFP基因
• GFP绿色荧光蛋 白是从一种生活 在北太平洋寒冷 水域的水母体内 发现的。
依赖于重组子结构特征分析筛选
核酸分子杂交分析
Southern blot 筛选结果
第十章 转基因植物
转基因植物 基因改良植物 转基因生物制药 转基因安全性
1.3 转基因植物的鉴定
遗传表型特征筛选 依赖于重组子结构特征分析筛选 核酸分子杂交分析 免疫化学分析检测 PCR筛选法
3.1 遗传表型特征筛选 常用的报告基因
抗生素抗性基因 显色或发光报告基因 抗除草剂抗性基因
β-葡萄糖酸苷酶基因（gus） 能催化特殊反应，通过荧光、分光光度和组织化学
方法对这些特殊反应产物进行检测。
种质保存的两种方式：
原地保存: 通过建立自然保护区和天然 公园来实现
异地保存: 通过植物园、种质圃、种子 库以及离体保存来实现。
华南植物园
西双版纳国家级自然保护区建立的兰科植物种 质资源保存苗圃
野生稻频临灭绝
• 离体保存：将组织和细胞培养中的外植体或试管 苗贮存在使其抑制生长、缓慢生长或无生长的条 件下，达到长期保存的方法。
将外源DNA通过亚精胺和氯化钙的沉积作用包被在金属颗粒 （金粉、钨粉等）表面，此为微弹，将这种微弹悬液涂于载膜 （尼龙、塑料等）上，以不同的驱动力高速驱动微弹载体，使 携带DNA的微弹穿透植物细胞壁，直接进入受体靶细胞。
1.2.2 载体介导法：农杆菌介导
➢ 几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部 常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰 氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染 所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti（Tumor-inducing）介导的。
冰冻保护剂
• 渗透型抗冻剂：二甲亚砜（DMSO）、乙二 醇、乙酰胺、丙二醇、甘油等
• 作用特点：属低分子中性物质，在溶液中易 结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性 增加而减弱水的结晶过程，达到保护的目的 。
非渗透型抗冻剂
• 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、葡聚糖、聚乙 二醇等，
• 作用特点：可溶于水，但不能进入细胞，可在特 定的温度下降低溶质（电解质）浓度，从而起到 保护作用
培养基条件的改变
• 改变培养基无机盐的浓度: 1/4MS培养菠萝 苗，一年后仍有81％保持活力；
• 增加培养基渗透压：添加甘露醇、蔗糖， 抑制外植体生长。
• 添加植物激素：多效唑PP333 等
培养环境条件的改变
• 降低培养环境的氧含量： • 保存材料上覆盖一层矿物质如石蜡、液态
石油 • 降低环境的氧分压。
种质资源的重要性
• 种质资源是在漫长的历史过程中, 由自然演化和人 工创造而形成的一种重要的自然资源。
• 积累了由于自然和人工引起的极其丰富的遗传变异 ,即蕴藏着各种性状的遗传基因。
• 人类用以选育新品种和发展农业生产的物质基础, • 也是进行生物学研究的重要材料, 是极其宝贵的自
然财富。
• 种质保存(germplasm conservation) ： 利用天 然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有 的遗传物质保持其遗传完整性，有高的活力 ，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。
植物细胞的遗传转化文稿演示
• 种质（germplasm）：是指亲代通过生殖细胞 或体细胞传递给子代的遗传物质。
• 种质资源：具有一定种质或基因的生物类型， 称为（基因资源、基因库、基因银行）。
• 包括品种、类型、近缘种和野生种的植株、种 子、无性繁殖器宫、花粉甚至单个细胞，只要 具有种质并能繁殖的生物体，都能归入种质资 源之内。