9_3_氨基苯胺基_吖啶与核酸作用的荧光光谱及其分析应用_朱燕舞

　第17卷第4期

2005年8月化学研究与应用

Chem ica l Resea rch and A pp licati on V o.l 17,N o .4A ug .,2005

　收稿日期:2004-09-13;修回日期:2005-02-17联系人简介:朱燕舞(1977-),女,硕士,主要从事有机试剂的合成与分析工作。Em ail :yanw uzhu @sina .co m

文章编号:1004-1656(2005)04-0468-03

9-(3-氨基苯胺基)吖啶与核酸作用的荧光光谱

及其分析应用

朱燕舞

1,2

,周运友

1

(1.安徽师范大学化学与材料科学学院,安徽芜湖　241000;

2.合肥工业大学化学工程学院,安徽合肥　230009)

摘要:报道了荧光试剂9-(3-氨基苯胺基)吖啶(简称:m -APAA )的合成,产品经多次重结晶提纯,用

IR 、1

HNM R 和元素分析确证了结构。研究了该物质与DNA 作用的荧光光谱,随着DNA 的加入观察到418n m (λex =256n m )处的荧光峰猝灭,且其猝灭程度与DNA 的浓度成正比,据此拟定了测定DNA 的分析方法。实验了最佳条件,干扰实验,确定了反应机理。该方法简便、快速、灵敏度高。关键词:荧光试剂;9-(3-氨基苯胺基)吖啶;测定;DNA 中图分类号:0657.39 文献标识码:A

吖啶类化合物具有良好的荧光性能和生物活

性以及理化性能[1～6]

,基于这些特性已用于多种

物质的测定,如测定谷胱甘肽还原酶[7]

、作为DNA

的嵌入试剂[8]、作为光化学裂解DNA 试剂[9]

等。核酸作为重要的遗传物质,它的测定对于研究核酸的生物化学反应,发展核酸的医药制品以及对

疾病的诊断和防治均有重要意义[10]

。荧光法是定量测定核酸的一种常用方法,包括荧光增强和荧光猝灭法,通常较光度法有更高的灵敏度。但是由于DNA 的内源荧光很弱,直接利用其荧光测定受到限制。近年来人们对核酸探针很感兴趣,核酸荧光探针作为核酸标记的工具,具有方便、快速、灵敏度高和安全等特点,受到广泛关注。我们合成了新荧光试剂9-(3-氨基苯胺基)吖啶(m -APAA ),其结构式为:

研究了该物质与DNA 作用的荧光光谱,随着DNA 的加入观察到418n m (λex =256nm )处的荧光峰猝灭,且其猝灭程度与DNA 的浓度成正比,据此拟定了测定DNA 的分析方法,实验了最佳条

件,干扰实验。该方法简便、快速、灵敏度高。

1　9-(3-氨基苯胺基)吖啶的合成及分析鉴定

N -苯基邻氨基苯甲酸和9-氯吖啶按文献[11]

合成。取9-氯吖啶1g (4.68mmo l ),加入40mL 无水乙醇搅拌溶解后加入间苯二胺0.5g (4.68mmo l ),氮气保护下室温搅拌反应22h 后,过滤出红褐色固体,用少量乙醇多次洗涤,干燥。用甲醇∶水=5∶1(v /v )作溶剂重结晶三次,得到橘黄色针状晶体0.7g (产率53%),熔点:220℃-222℃。I R (KB r 压片):υ(c m -1)3424,3303(-NH 2),3085(=C -H ),1682,1585,1552,1519(苯环骨架振动),865,756,691(间位取代

苯)。1

HNMR (DM SO -d 6)∶δ(ppm )5.48(s ,2H ,Ph -NH 2),6.46-7.15(m ,4H ,苯基上的质子),7.38-8.26(m ,8H ,吖啶环上的质子)。元素分析(%):C 19H 15N 3,实测值(计算值):C 80.20(79.95),H 4.96(5.31),N 14.01(14.73)。

由以上分析鉴定结果可以确证所合成的化合物与目标物相符。

2　实验部分

2.1　仪器与试剂

F -4500型荧光分光光度计(日本日立公司),p H s -2C 型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。

m -APAA 溶液浓度:1.0×10-4

m ol /L ;DNA 储备溶液:将一定量的鱼精脱氧核糖核酸(fs -DNA ,S ig m a 化学试剂公司)和小牛胸腺DNA (ct -DNA ,S ig m a 化学试剂公司)直接溶于适量水中,并保存于0℃-4℃冰箱中,操作液浓度为100m g /L ;三羟甲基氨基甲烷(Tris )溶液浓度为0.05m o l /L 。其余试剂均为分析纯,实验用水为亚沸蒸馏水。2.2　实验方法

在10m L 容量瓶中加入一定量m -APAA 、1m L Tris -H C l 缓冲溶液、fs -DNA (或ct -DNA )溶液,用水稀释至刻度,以不含fs -DNA (或ct -DNA )的溶液为试剂空白,静置30m in 后,以λex =256nm 光激发,λe m =418nm 处测定荧光强度。

3　结果与讨论

3.1　荧光光谱

按照实验方法分别绘制m -APAA 与ct -DNA 及空白溶液的荧光光谱图,结果如图1。λex =256n m ,λe m =418nm 。当加入ct -DNA 后,418nm 处的荧光强度减弱,442nm 处的驼峰也相应减弱,且418nm 的发光强度随着DNA 浓度增加而递减,据此拟定了测定DNA 的方法。实验证明该方法是可行的

。

图1　激发光谱和发射光谱

F ig .1　The fluo rescent excitation and em issi on spectra

1,1’:1.0×10-5m o l /L m -A PAA ;

2,2':1.0×10-5mo l /L m -APAA +10mL /L c t -DNA

3.2　p H 的影响

用HC l 、N a OH 、Tris 溶液调节体系p H 值。实验

了不同pH 下对体系荧光强度影响,结果表明:当体

系中存在DNA 时,在pH <3和pH >10时ΔF 值较

小,pH 值在5.5-10.0之间ΔF 值较大并基本保持不变,表明在强酸和强碱的介质中DNA 的双螺旋结构发生改变,而将结合的m -APAA 从DNA 的双螺旋结构中释放出来,使体系中游离的m -AP AA 的浓度增加,从而使ΔF 值较小。本实验对于fs -DNA 选用Tris -HC l pH =6.40缓冲溶液;对于ct -DNA 选用Tris -HC l pH =7.00缓冲溶液。3.3　m -APAA 浓度变化对体系的影响

试验了m -APAA 浓度变化对体系的影响,结果表明1.0m L 1.0×10-4

m o l /L m -APAA 时体系的F 0/F 较大。3.4　时间对体系的影响

考察了将溶液静置10-60m in 时对体系荧光强度的影响。结果表明m -APAA 的荧光强度随时间的延长先增强接着又逐渐减弱。当存在DNA 时,荧光强度逐步减弱,表明在25-60m i n F 0/F 最强且基本稳定。本实验选用静置30m i n 时测定为佳。3.5　K I 荧光猝灭

I -离子为一动态猝灭剂。通过考察其对小分子荧光的猝灭作用可以判断小分子与DNA 的作用方式。与纯水介质相比,根据文献[12]

可知,当小分

子与DNA 属于嵌入作用时,I -的猝灭作用减弱,又由文献

[13]

可知,当小分子与DNA 属于沟槽作用时,

I -的猝灭作用增强。由图2可看出,与纯水介质相比,在DNA 存在下,I -

对m -AP AA 的荧光猝灭略

有增强。但是根据文献[5]

吖啶刚性平面环一般与DNA 作用方式为嵌入式,所以推知m -APAA 的9-位取代基可能与DNA 的小沟槽结合。

图2　K I 荧光猝灭实验

F i g .2　F l uorescence quenching o fm -APAA (1.0×10-5m o l /L )by K I in the absence o f ct -DNA (■)and i n t he pre sence of ct -DNA ( )

(K I concentration /mo.l L -1)

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