兔肺静脉心肌细胞动作电位及TRPC3类通道电流特性

基金项目：厦门市科技局与卫生局联合资助的重大课题（项目编号：A000275）作者单位：厦门大学附属中山医院心脏中心（361000）通讯作者：黄卫斌E-mail:xmhuangbo@ ·基础研究·兔肺静脉心肌细胞动作电位及TRPC3类通道电流特性戴增欢黄卫斌李源刘泰槰【摘要】目的兔心房和肺静脉上的非选择性阳离子通道与TRPC3非常相似，本实验通过对兔肺静脉肌袖心肌细胞（PVC）和心房肌细胞（LAC）动作电位及TRPC3类通道电流特性的研究，进一步探讨TRPC3类通道在早后除极（EAD）中的作用及起源于肺静脉的阵发性房颤的电生理机制。

方法采用全细胞膜片钳技术分别记录PVC和LAC的动作电位及非特异性阳离子流，同时加用胰岛素，观察胰岛素对动作电位及电流的影响。

结果PVC动作电位时程较LAC的明显延长，并可以诱发第二平台反应，加用胰岛素后PVC和LAC动作电位时程均明显缩短。

通过加用GdCl3，我们在PVC和LAC上可记录到非选择性阳离子流，且PVC的电流密度较LAC的小；而如果我们加用胰岛素，PVC和LAC的电流密度均增加，且PVC的电流密度较LAC增加的少。

结论PVC较LAC的动作电位时程（APD）明显延长,表明其具有产生EAD的明显倾向，进而可能导致快速性心律失常的发生，胰岛素可明显的缩短动作电位时程。

PVC的电流密度较LAC的明显减小，PVC和LAC存在的复极离子流的差异构成了两者动作电位差异的基础；胰岛素可使电流密度增加，可初步判定PVC和LAC上存在的TRPC3类通道为TRPC3。

【关键词】兔；肺静脉肌袖心肌细胞；胰岛素；非选择性阳离子流［中图分类号］R540.4+1R541.7［文献标识码］A［文章编号］1005－0272（2011）02－113-04Characteristics of the action potentials and the channel similar to TRPC3in the cardiomyocytes from rabbit pulmonary vein sleeves Dai zenghuan,Huang weibin,Li yuan,Liu taifeng.Heart Center,XiaMen ZhongShan Hospital Affliated to Xiamen University.Xiamen,361000,China.【Abstract】Objective The nonselective cation current in cardiomyocytes from rabbit pulmonary vein sleeves （PVC）and left atrial cardiomyocytes（LAC）are similar to the channels of canonical transient receptor potiential 3（TRPC3）,we study the characteristics of the action potentials and the channel similar to TRPC3in the cardiomyocytes from rabbit PVC and LAC to investigate the role that the channels similar to TRPC3play in early after depolarization（EAD）and the ionic mechanism of the paroxysmal atrial fibrillation originated from the pulmonary vein sleeves.Methods We used the current-clamp technique to record action potential,and voltage-clamp to record ioninc currents in both PVC and LAC,then added insulin to the solution to record the effect of it to the action potentials ionic currents in both PVC and LAC.Results PVC had longer action potential duration than LAC,in addition PVC could be induced the second plateau response easily,after adding insulin the APD of PVC and LAC are both decreased.We can record nonselective caution current in both PVC and LAC by adding GdCl3, besides the current densities in PVC was significantly less than that in LAC；Also we can find after adding insulin the current densities were increased in both PVC and LAC，PVC is less than LAC.Conclusion PVC had longer action potential duration than LAC,suggesting a strong tendency of EAD genesis in PVC,then leading to induce the rapid arrhythmia.The APD can be significantly decreased by adding insulin.The current density in PVC is significantly less than that in LAC.The difference in repolarizing ionic current between PVC and LAC forms a basis of the difference in their action potential configuration;the current densities in PVC and LAC can be increased by insulin telling us that the channel similar to TRPC3existed in the PVC and LAC might be TRPC3.【Key words】rabbit;cardiomyocytes in pulmonary vein muscle sleeves;insulin;nonselective cationcurrent心房颤动是临床最常见的心律失常之一, Haissaguerre等[1]的研究证实起源于肺静脉内的局灶电活动引起了房颤的发生，肺静脉肌袖是阵发性房颤起源最主要的部分，肺静脉肌袖和左房后壁为房颤发生和维持最主要的部分，经导管电学隔离肺静脉或者消融肺静脉局灶可以根治房颤[2，3]，因此肺静脉肌袖的电生理特性的研究有助于临床对房颤的治疗。

此外，2001年，Bode等[4]研究发现非选择性阳离子通道的特异性阻断剂狼蛛毒可在兔心房上抑制因急性牵张引发的房颤,目前研究在多种心肌细胞上已经发现数种非选择性阳离子通道电流，国内丁怀玉等[5]在兔心房和肺静脉肌袖心肌细胞上发现了非选择性阳离子流，且兔心房和肺静脉上的非选择性阳离子通道与TRPC3非常相似。

本研究通过对兔肺静脉肌袖心肌细胞（PVC）和心房肌细胞（LAC）动作电位及TRPC3类通道电流特性的研究，进一步探讨TRPC3类通道在早后除极（EAD）中的作用及起源于肺静脉的阵发性房颤的离子流机制。

材料与方法1.兔心肌细胞的分离健康成年新西兰白兔，购自厦门大学医学院实验动物中心，体重1.5~2.5kg，耳缘静脉注射肝素（肝素浓度500IU/kg）抗凝，并用乌拉坦（750mg/kg）麻醉后开胸取心脏及肺组织，置于通氧的冰台式液中，剪去心包，心脏经修饰后连接在Langendorf心脏灌流装置上，经主动脉根部逆行用无钙台式液灌流（灌流压约70cmH2O，恒温37℃），边灌流边进行修剪，清楚分离出肺静脉，肺静脉肌袖位于左房与肺静脉交界处，此处有明显颜色变化，从左房的棕色变为肺静脉的白色，长度约1~2.5mm，较易辨认。

灌流至液体变清后改灌酶液，酶液反复循环灌流，至心脏膨大，松弛变软后（约7~10min）剪取心房肌细胞及位于左房与肺静脉交界处的肺静脉肌袖，放入上述酶液中37℃条件下温孵，震荡，经充分吹打，在细胞数量与质量达到最佳时收集细胞悬液放入KB液中保存（-4℃）备用。

2.膜片钳全细胞记录选取大小适中，形态完好，边缘整齐，表面无颗粒，横纹清晰，无收缩的细胞在室温下进行试验。

吸数滴细胞保存液加于1ml灌流槽中，置于倒置显微镜（TE2000-U型，日本NIKON）载物台上，细胞静置沉底贴壁8~10min，正常加钙台式液灌流清洗细胞，流速大约1.5ml/min。

微电极分部拉制，充灌电极液后电阻3~5MΩ，采用高阻封接，负压破膜，形成全细胞钳制，脉冲信号由PATCHM ASTER软件控制，经EPC10放大器（HEKA Electronic CO，德国）放大后通过Ag-Agcl电极丝和填充电极内液的玻璃微电极导入细胞，产生的电流信号经EPC-10放大器转换并存储于计算机硬盘中，供测量分析用。

在全细胞电流钳制模式下，用900pA×15ms的刺激脉冲刺激细胞，引出并记录动作电位。

在全细胞电压钳制模式下记录非选择性阳离子流时，维持电位为-40mV，持续50ms，以灭活钠通道，实验电位为-80mV至+70mV，以10mV 阶跃递增，持续时间为450ms，刺激间隔为3s。

3.胰岛素对动作电位及通道电流的影响记录肺静脉肌袖心肌细胞的动作电位和非选择性阳离子流，并与左房心肌细胞进行比较，记录过程中加用0.1mmol/L GdCl3（一种非特异性阳离子通道的阻断剂）及胰岛素（2μmol/L）观察动作电位及电流的变化。

4.溶液与试剂用于分离细胞的无钙台式液（mmol/L）：NaCl 136.9、KCl5.4、NaHCO311.9、MgCl20.53、NaH2PO4 0.33、HEPES5、Glucose10，用95%O2，5%N2饱和，用NaOH将PH调至7.35。