原核蛋白表达常见问题解析
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核大肠杆菌蛋白表达
原核大肠杆菌蛋白表达系统是一种常用的表达系统，它基于细菌细胞（通常为大肠杆菌）对外源基因的转录和翻译过程。
在表达载体中，包含有启动子、激活子和选择子等元件，这些元件使得外源基因能够被细菌细胞识别、转录成mRNA，并通过翻译过程合成目标蛋白。
大肠杆菌表达载体的要求如下：
1. 操纵子以及相应的调控序列，因为外源基因产物可能会对大肠杆菌有毒害作用。
2. SD序列，即核糖体识别序列，一般SD序列与起始密码子之间间隔7\~13bp翻译效率最高。
3. 多克隆位点以便目的基因插入到适合位置。
此外，目的基因在大肠杆菌表达体系中要表达的基因即外源基因，包括原核基因和真核基因。
原核基因可以在大肠杆菌中直接表达出来，但是真核基因含有内含子不能直接表达，大肠杆菌不能对mRNA进行剪切，从而形成成熟的mRNA，所以真核基因一般以cDNA的形式在大肠杆菌表达系统中表达。
同时还需要提供大肠杆菌能识别的且能转录翻译真核基因的元件。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。
蛋白质表达与纯化常见问题解答
蛋白质表达与纯化常见问题解答蛋白质表达与纯化是生物科学研究中常见的实验技术，用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用等。
然而，在进行蛋白质表达与纯化实验时，常常会遇到一些问题。
本文将针对蛋白质表达与纯化过程中的常见问题进行解答，帮助读者更好地进行实验和解决实验中可能遇到的困难。
一、蛋白质表达问题解答1. 为什么我的目的蛋白质在大肠杆菌中表达得不好？蛋白质表达的成功与多种因素相关，包括宿主菌的选择、启动子的选择、表达载体的构建等。
首先，确认宿主菌是否合适，某些蛋白质可能需要使用其他细菌或真核细胞进行表达。
其次，选择合适的启动子和表达载体，确保表达水平能够满足需求。
另外，光照条件、温度、培养基的选择等也会对表达效果产生影响。
2. 我应该选择哪种表达载体？选择表达载体应根据实验需求来定。
一般来说，常用的表达载体有质粒和病毒载体。
质粒表达系统适用于小规模表达和纯化，而病毒载体表达系统适用于大规模表达和高效表达。
另外，如果需要对蛋白质进行特定修饰，如标记或融合蛋白表达，可选择相应的表达载体。
3. 如何对表达后的蛋白质进行检测？常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE、Western blot和质谱分析等。
SDS-PAGE能够分析蛋白质的分子量和纯度，Western blot可以检测特定蛋白质的表达水平，质谱则可以确定蛋白质的分子量和结构。
根据实验需求选择合适的方法进行检测。
二、蛋白质纯化问题解答1. 我应该选择哪种纯化方法？选择纯化方法取决于蛋白质的性质和需求。
常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
亲和层析适用于具有特异结合能力的配体，离子交换层析适用于根据蛋白质电荷差异进行分离，凝胶过滤层析适用于根据蛋白质的分子量进行分离。
根据蛋白质的特性选择合适的纯化方法。
2. 如何确定纯化效果？纯化效果可通过测定蛋白质的比活性、比强度和纯度来确定。
比活性和比强度分别指的是单位反应物质的相应活性或强度，纯度则指的是蛋白质在总样品中所占的比例。
原核表达系统蛋白表达问题解析
活性蛋白整体方案原核表达系统蛋白表达问题解析摘要：本文主要对原核蛋白表达纯化体系中的常见问题进行收集整理，并附有解决思路和相应的实际操作。
外源DNA片段成功插到载体里面（PCR鉴定），但无法表达蛋白一般判断目的基因是否表达，首先要进行SDS-PAGE检测。
跑胶的时候一定要设对照：Marker，标准品阳性对照，以及空白载体(诱导)和重组载体(不诱导)2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。
跑SDS-PAGE的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在100ng左右；但是不能跟着做western blot了。
银染的灵敏度在0.1～1ng；或是Sypro Red，灵敏度高还可以继续做Western blot。
在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要先判断载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。
其次要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。
最后，也需要注意基因中是否有稀有密码子，可更换表达菌株。
每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。
不同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。
采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。
例如，使用BL21(DE3)菌株表达不成功可以尝试用Rosetta系列菌株表达，它能够由一种氯霉素抗性的、与pET相容的质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。
所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。
有时不明原因的表达蛋白截短(比预期的分子量要小很多)也可能是由于稀有密码子造成的。
没有发现原则性错误之后，可以从表达条件入手，梯度条件改变表达温度、IPTG浓度，低温、较长时间的表达有利于蛋白稳定、融合表达；低浓度的IPTG可以减少化学物质对细胞的损伤。
原核蛋白表达常见问题解析
原核蛋⽩表达常见问题解析原核蛋⽩表达常见问题解析1、为什么⽬的蛋⽩总是以包涵体的形式出现？在原核蛋⽩表达纯化中⽬的蛋⽩经常发⽣错误的折叠，并聚集成为包涵体。
经过诱导，⽬的蛋⽩通常可达细胞总蛋⽩的50%以上。
虽然有⼀定⽐例的蛋⽩以可溶的单体形式存在，⽽多达95%（甚⾄更多）的蛋⽩则在包涵体中。
实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采⽤特别的培养基等⽅法获得更多的可溶蛋⽩。
2、跨膜蛋⽩为什么很难表达？跨膜蛋⽩的表达成功率相对较低是⼀个实验结果，究其原理，⽬前众说纷纭很多种理论。
以我们浅薄的理解层⾯来看，主要有以下⼏个原因：跨膜蛋⽩⼀般都是强疏⽔性的氨基酸分⼦和亲⽔性的分⼦跳跃式的连接，形成的亲⽔疏⽔的⼀个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞⼀样完成信号肽识别及切除、引导内质⽹、⾼尔基体重新包装及分泌这⼀复杂过程，有些蛋⽩是多次跨膜，对于原核细胞来说⼏乎是不可能完成的任务。
另外，对于疏⽔性的⽚段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏⽔性多肽会抑制翻译过程，甚⾄与原核膜结构融合形成毒性，出于⽣物⾃我保护的本能，所有的细胞器都会停⽌合成蛋⽩的过程。
3、如何选择蛋⽩表达宿主菌？4、我们有哪些原核蛋⽩纯化⽅式？如何选择不同的纯化⽅式？答：我们公司的蛋⽩纯化⽅法⼤致分为亲和纯化、离⼦交换、切胶回收三类。
1、常规情况下，⼀般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进⾏亲和纯化获得融合蛋⽩，⽤亲和纯化的⽅法⼀般可以获得85%以上纯度的蛋⽩，亲和纯化的⽅便快捷。
2、如果需要⽬的蛋⽩不含有任何标签，怎么选择纯化⽅式？。
（1）可表达融合蛋⽩，⽤蛋⽩⼯具酶切割融合蛋⽩，再进⾏纯化除去⼯具酶。
此⽅法能快速得到蛋⽩。
（2）可表达不含标签的蛋⽩，进⾏离⼦、分⼦筛、疏⽔等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋⽩。
原核表达的注意事项
原核表达本贴非原创，特声明。
PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CD 是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，parti CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
蛋白质表达的常见问题及其解决办法
蛋白质表达的常见问题及其解决办法蛋白质表达是生物学研究中的一个关键步骤，它涉及到将基因信息转化为具有功能性蛋白质的过程。
然而，在蛋白质表达的过程中，常常会遇到一些问题，这些问题可能会影响到研究的进展和结果。
本文将介绍蛋白质表达中常见的问题，并提供相应的解决办法。
一、表达系统选择不当在蛋白质表达过程中，选择合适的表达系统是至关重要的。
不同的表达系统在表达效率、折叠状态和产量等方面存在差异。
常见的表达系统包括大肠杆菌（E. coli）、酵母、哺乳动物细胞等。
找到适合自己研究目的的表达系统是解决表达问题的第一步。
解决办法：根据研究的目的和所需蛋白质的特性选择合适的表达系统。
对于简单蛋白质，E. coli系统往往是一个不错的选择。
对于复杂的蛋白质，可以考虑使用酵母或哺乳动物细胞系统。
此外，还可以尝试使用不同的表达载体和宿主菌株，优化表达条件来提高表达效率和产量。
二、蛋白质无法正确折叠蛋白质的折叠状态是其功能的基础，如果无法正确地折叠，可能导致蛋白质无法发挥预期的功能。
在某些情况下，蛋白质可能会出现聚集、形成夹心态或夹杂体等异常折叠状态。
解决办法：针对无法正确折叠的蛋白质，可以考虑使用分子伴侣（chaperone）辅助折叠。
分子伴侣是一类在细胞中参与蛋白质正确折叠的分子，通过与目标蛋白质相互作用，帮助其正确折叠，并防止其异常聚集。
此外，还可以优化表达条件，如温度、培养基成分等，以提供适合蛋白质折叠的环境。
三、蛋白质表达产量较低蛋白质表达的产量是一个关键指标，特别是对于需要大量蛋白质进行后续实验的研究。
然而，很多时候表达产量较低，难以满足研究需求。
解决办法：提高蛋白质表达产量可以从多个方面入手。
首先，可以优化表达载体和宿主菌株的选择，采用高效表达载体和具有高表达能力的宿主菌株。
其次，可以优化表达条件，如诱导条件、培养温度、培养时间等。
此外，还可以使用辅助表达因子，如融合标签或信号肽，来提高表达产量。
四、目标蛋白质的纯化困难在蛋白质表达之后，需要对目标蛋白质进行纯化，以获取高纯度的蛋白质进行后续实验。
原核表达目的蛋白的方法
原核表达目的蛋白的方法原核表达目的蛋白的方法1. 引言原核表达是一种常用的表达蛋白质的方法，其主要基于原核细胞（如大肠杆菌）的天然表达系统。
通过使用不同的表达载体和相关技术，研究人员可以将目的蛋白质在原核细胞中高效表达，并借此进行产量大、成本低的蛋白质生产。
2. 选择合适的表达载体在原核表达中，选择合适的表达载体是非常重要的。
常见的表达载体有质粒和噬菌体。
质粒表达系统依赖于质粒DNA在细胞内的复制和转录作用，噬菌体表达系统则是通过感染细胞引起的溶菌作用来释放表达产物。
根据需求和实验目的，可以选择适当的表达载体。
3. 选择适当的表达宿主常用的原核表达宿主是大肠杆菌，因其具有较强的表达能力和简单的培养条件。
其他一些菌株如酵母、双歧杆菌等也可以用于原核表达。
根据目的蛋白的特性和表达要求，选择合适的表达宿主。
4. 优化基因序列在进行原核表达之前，需要对目的蛋白的基因序列进行优化。
合成较高优化的核酸序列，包括优化翻译起始子和优化密码子使用。
这样可以提高蛋白质的表达水平和折叠状态。
5. 转化目的蛋白质转化是指将目的蛋白质基因导入表达宿主中的过程。
最常用的方法是通过化学转化或电转化将表达载体导入细胞。
还可以利用病毒、质粒导弹等方法进行转化，具体选择方法取决于实验需求和表达系统。
6. 诱导表达转化后，需要选择适当的诱导方法来激活表达载体中的目的蛋白基因。
常用的诱导剂有异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、丝氨酸酶等。
根据表达宿主和表达载体的不同，可选择不同的诱导浓度和诱导时间。
7. 提取和纯化目的蛋白经过表达和诱导后，目的蛋白质可在细胞内或细胞外表达。
具体提取和纯化方法可以根据蛋白质的特性和需求选择，常用的方法包括离心法、柱层析法、亲和层析法等。
8. 评估表达蛋白质的性质和功能通过一系列生化、免疫学、生物学等实验方法，可以对表达蛋白质的性质和功能进行评估。
可以利用SDS-PAGE检测蛋白质的表达水平和相对分子质量。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项发布时间： 2019-06-03 新闻来源：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点) ；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR 方法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
2、PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
原核表达蛋白镍离子亲和纯化-概述说明以及解释
原核表达蛋白镍离子亲和纯化-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述原核表达是一种重要的蛋白质表达方法，它在生物学和生物技术领域被广泛应用。
原核表达系统通常包括大肠杆菌、酵母和其他细菌等微生物，其表达效率高、表达周期短、操作简便，因此备受研究者青睐。
然而，由于细胞内含有大量的内源性蛋白和杂质，常规方法无法有效地纯化目标蛋白。
为了解决这一问题，科学家们开发了各种蛋白纯化方法。
其中，镍离子亲和纯化技术因其高选择性和高效性而备受关注。
镍离子亲和纯化的原理是基于镍离子（Ni2+）与某些蛋白的特定结构域（如组织因子蛋白A标签、组织因子蛋白S标签和组织因子蛋白H标签等）之间的特异性配位作用。
通过构建一定的表达载体，将含有目标蛋白的基因与镍离子亲和柱（如Ni-NTA柱）结合，可以实现目标蛋白在细胞裂解液中的高效富集。
在原核表达蛋白镍离子亲和纯化的方法中，首先需要构建包含目标蛋白编码序列的表达载体，并将其转化到适当的宿主细胞中。
然后，通过诱导表达剂（如异丙基β-D-硫代半乳糖苷）刺激蛋白的大量合成。
接着，使用一系列的细胞破碎方法，如超声波处理或高压细胞破碎仪，将细胞内的目标蛋白释放出来。
最后，通过镍离子亲和柱，将目标蛋白与杂质分离，得到纯化的目标蛋白。
镍离子亲和纯化在原核表达蛋白中具有广阔的应用前景。
通过该方法，可以高效地纯化大量的目标蛋白，为后续的结构解析、功能研究和药物开发提供了可靠的材料基础。
然而，该方法也存在一些局限性和可改进之处，例如对于某些难以表达的蛋白，亲和纯化的效率可能较低；此外，在某些情况下，镍离子柱可能与非特异性结合的蛋白相互作用，导致纯化产物的纯度下降。
综上所述，原核表达蛋白镍离子亲和纯化技术是一种高效、可靠的蛋白纯化方法，具有广泛的应用前景。
随着该技术的不断发展和改进，相信将为蛋白研究领域提供更多更好的工具和方法。
文章结构部分的内容可以如下所示：1.2 文章结构本文将按照以下结构进行论述：第一部分是引言。
原核蛋白表达 问题解析
原核蛋白表达问题解析
原核蛋白表达是一种人工实验技术，用于在原核生物（如细菌）中表达特定的
蛋白质。
它是研究生物学、药物开发和生物工程领域中常用的工具之一。
在原核蛋白表达中，研究者通常通过将目标基因转移到表达载体中来实现蛋白
表达。
表达载体是一种特殊的DNA分子，其中包含目标基因的编码序列和其他必
要的调控元件。
通过将表达载体导入到适合的宿主细胞中，目标基因可以被转录和翻译为蛋白质。
原核蛋白表达有许多优点，其中包括高表达水平、简单和经济等。
原核生物的
生长速度通常很快，所以可以在短时间内大量表达目标蛋白质。
此外，原核蛋白表达体系相对较简单，无需特殊的培养条件或复杂的培养基，这降低了实验的成本和难度。
然而，原核蛋白表达也存在一些挑战和限制。
由于原核生物的细胞环境与真核
生物不同，某些复杂的蛋白质可能无法正确地折叠或修饰。
此外，某些蛋白质可能对原核表达系统的毒性有较高的敏感性，从而降低了表达效率。
为了克服这些问题，研究者通常采用各种策略来优化原核蛋白表达。
例如，他
们可以通过优化转化条件、选择适当的宿主细胞或使用辅助蛋白质来提高表达效率。
此外，关于蛋白质折叠和修饰的研究也可以提供有价值的信息。
在总结一下，原核蛋白表达是一项重要的实验技术，可用于快速高效地表达目
标蛋白质。
尽管存在一些挑战，但通过优化实验条件和相关研究的进行，原核蛋白表达仍然是生物学和生物工程领域中广泛使用的工具之一。
蛋白表达常见问题分析
蛋白表达常见问题分析影响蛋白表达有许多因素，如目的蛋白自身的特点，表达载体、表达菌株的组合，诱导表达的条件，培养基的选择等，都有可能对蛋白的表达产生影响。
针对蛋白表达中的一些常见问题，可尝试用如下方法加以解决。
一、蛋白不表达或表达量很低1．选择正确的表达载体与表达菌株基于T7 启动子的载体（如pET 系列载体）应选用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3) 等菌株不是基于T7 启动子的表达载体（如带有tac 启动子的pGEX、pMal 系列表达载体）应选用BL21 表达菌株。
对细胞有毒性的蛋白，应该选用背景表达低、严紧调控诱导的菌株，如BL21(DE3)pLysS 菌株。
对于带有稀有密码子的蛋白或来源于真核基因的蛋白，应该选用Rosetta(DE3) 等菌株。
2．尝试不同的表达系统与菌株不同的蛋白，对不同载体与菌株的偏好不同，如果某一表达系统无法通过优化诱导表达条件得到明显改善，可以更换其它的菌株或表达载体。
3．表达条件的优化选择不同的培养基。
对于某些蛋白，在培养基中加入适量的葡萄糖（0.1%~0.5%），可以明显提高表达量。
较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间，一般可以加快表达的速度，促进目的蛋白的积累，从而提高表达量。
但是可能会降低可溶蛋白的表达量，形成包涵体。
菌体的生长状态对蛋白表达有很大的影响，可以通过测量菌液的OD 值监测生长状态。
对于大部分蛋白，应在菌液的对数生长期（OD ≈ 0.5）进行诱导。
二、目的蛋白不可溶，形成包涵体首先确认目的蛋白是否有表达。
裂解菌体并离心后，通过对全菌、上清、沉淀的检测，确认目的蛋白是否表达，还是形成了包涵体。
包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。
在无法改变蛋白自身结构的情况下，可以尝试不同的表达系统与菌株，增强其溶解能力，优化出适合特定蛋白的表达系统。
目前认为包涵体的形成是基于蛋白在菌体内积累速度过快，没有正确折叠而聚集沉淀。
原核表达蛋白不表达原因
原核表达蛋白不表达原因
原核表达蛋白不表达原因可能与以下因素有关：
1. 编码序列缺失或不完整
部分原核菌体的基因组存在缺失或未完整编码的基因，因此未能成功
合成蛋白质。
此外，某些原核菌体也可能存在基因突变或缺失，导致
相关蛋白质无法被成功合成。
2. 翻译后修饰不足
蛋白质翻译后需要经过一系列修饰才能成为功能完整的成熟蛋白质。
在一些原核菌体中，可能存在相关修饰酶的缺失或修饰过程受到抑制，导致蛋白质无法成功合成和修饰。
3. 转录和翻译水平低下
某些原核菌体的细胞周期较短，转录和翻译能力较弱。
在这种情况下，它们可能无法在完成生命周期前成功合成足够的蛋白质。
4. 蛋白质抑制作用
有一些蛋白质可以抑制原核菌体的转录和翻译过程，从而阻断蛋白质的合成。
这些蛋白质可能是内源性的，即由细胞自身产生，也可能是外源性的，即来自其他微生物的毒素或环境因素。
5. 环境因素的影响
一些环境因素，例如高温、低温、酸性、碱性和高盐浓度等，可能会对原核菌体中的基因表达产生负面影响，从而导致蛋白质的合成受到限制。
综上，原核表达蛋白不表达的原因可能涉及基因缺失、翻译后修饰不足、转录和翻译水平低下、蛋白质抑制作用以及环境因素的影响等多种因素。
对这些原因的深入研究将有助于提高原核表达系统的表达效率和成功率。
做原核表达的几点教训和体会
做原核表达的几点教训和体会最近在做原核表达，包涵体。
以前也做过，但经验不多。
一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正1. 首先介绍一下背景。
载体是invitrogen公司的pET22b，Amp抗性。
菌株是该公司的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。
2. 第一次失败。
第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。
PCR，酶切都正确。
但没等测序结果出来就开始做了。
失败了。
曾在园子求助。
后来证明是引物错误。
我们实验室合成引物都要先发给purchasing office，然后才由他们与公司交涉。
这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。
教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。
引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。
3. 第二次失败。
后来重新构建，转化，诱导。
第一次诱导时根本就没带。
见附图（图片质量太差了，sorr y，下面几个帖会逐渐好转。
我们都在失败中提高，进步，不是吗）然后开始找闷头原因。
周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18 h！我们都知道，带Amp的E.coli在含Amp的平板上培养超过16 h后，菌周围会长出小菌落，我们叫它卫星菌落。
这是因为细菌在生长的时候，为了抵抗Amp，会分泌B－内酰胺酶，而该酶会降解培养基中的A mp。
对Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。
到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp就会慢慢减少。
一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。
当Amp降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。
所以当培养时间足够长后，培养基中的B－内酰胺酶就会积累到很高的浓度。
转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp（而且我用的浓度是50 ug/ml）。
重组蛋白表达技术的使用中常见问题
重组蛋白表达技术的使用中常见问题蛋白质是生命体内重要的组成部分，它们参与了几乎所有的生物过程。
为了研究和利用蛋白质的功能，科学家们通过重组蛋白表达技术来大量产生目标蛋白。
然而，在使用重组蛋白表达技术的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将详细探讨重组蛋白表达技术使用中的一些常见问题，并提供相应的解决方法。
1. 表达水平低在使用重组蛋白表达技术时，常常会遇到表达水平低的问题。
低表达水平可能由多种原因引起，包括启动子的活性不足、转录过程中的阻塞或降解、翻译后期的限制以及蛋白质的不稳定性等。
解决方法：- 优化启动子选择：选择活性较高的启动子，如T7、CMV或SP6启动子。
- 优化培养条件：优化培养基组分、培养温度、表达宿主菌的载体拷贝数等，以提高蛋白表达水平。
- 优化转化方法：尝试使用电转化、化学转化或峰值冲击转化等方法来提高表达宿主菌的转化效率。
- 优化培养时间：延长培养时间，以便提高目标蛋白的表达水平。
2. 目标蛋白形成包含体在表达过程中，目标蛋白常常形成包含体（inclusion body），即蛋白质以不溶性的聚集体形式存在。
解决方法：- 优化培养条件：调整培养温度、培养基成分，提高溶解蛋白的折叠效率。
- 引入辅助蛋白质：结合引入辅助蛋白质的策略，帮助目标蛋白的正确折叠和溶解。
- 进行亲和纯化：通过抗标签或亲和层析等技术，将包含体中包含的目标蛋白从非特异性蛋白质中进行纯化。
3. 目标蛋白磷酸化或糖基化不足重组蛋白质常常需要进行修饰，包括磷酸化和糖基化等。
然而，有时目标蛋白表达后，修饰的程度不足，影响功能和稳定性。
解决方法：- 优化培养条件：调整培养基中相关原料的浓度，如添加合适的磷酸盐或糖类物质，促进修饰的进行。
- 引入修饰相关基因：将相关调控基因引入到表达宿主菌中，提高修饰相关酶的表达水平。
- 转化进化系统：构建具有修饰相关基因的酵母或细菌转化进化系统，通过长时间的适应培养，提高修饰效率。
4. 目标蛋白的折叠和稳定性问题有些目标蛋白在表达和纯化过程中容易失去活性或不稳定。
蛋白质表达过程中可能发生误差如读码误差突变和修饰等
蛋白质表达过程中可能发生误差如读码误差突变和修饰等蛋白质表达过程中可能发生误差如读码误差、突变和修饰等蛋白质是生命体中十分重要的分子之一，是细胞和组织的基本构建块。
蛋白质表达是指生物体内合成蛋白质的过程。
蛋白质表达的过程中可能发生误差，这些误差包括读码误差、突变和修饰等。
这些误差会影响蛋白质的结构和功能，从而引起各种生物学现象。
一、读码误差蛋白质的合成是由蛋白质合成机器来完成的。
蛋白质合成机器是由核糖体、tRNA、mRNA和各种蛋白质组成的。
在蛋白质表达的过程中，mRNA上的密码子被识别，tRNA上的氨基酸被调控，然后将氨基酸连接到聚合物链上。
在这个过程中存在一定的读码误差。
读码误差是指在翻译过程中，由于密码子的识别错误或tRNA的选择错误，导致将错误的氨基酸插入到聚合物链中。
这种误差可能导致蛋白质质量的下降，进而影响蛋白质的结构和功能。
二、突变突变是指生物体在基因水平上发生变异的过程。
在蛋白质表达的过程中，突变也可能发生。
突变可以改变mRNA上的密码子序列，从而改变氨基酸序列，进而影响蛋白质的结构和功能。
突变有许多原因，比如自然辐射、化学物质、病毒感染等。
在生物进化的过程中，突变是物种多样性的主要原因，但是在蛋白质表达过程中，突变可能导致蛋白质结构和功能的改变，进而影响生物体的功能。
三、修饰修饰是指蛋白质分子在合成后通过化学反应，增加一些特定的化学结构，从而改变其结构和功能。
蛋白质修饰可以分为翻译后修饰和翻译前修饰两类。
翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、脱乙酰化、甲基化、醇基化等。
这些修饰可以改变蛋白质的结构和功能，从而影响其在生物体内的作用。
翻译前修饰包括信号肽、伴侣蛋白等。
这些修饰可以改变蛋白质的转运路径和折叠状态，从而影响蛋白质的结构和功能。
四、结论总之，在蛋白质表达过程中可能发生读码误差、突变和修饰等误差，这些误差可能影响蛋白质的结构和功能，进而影响生物体的生命活动。
对于蛋白质表达过程中的误差，我们需要加强研究，找到有效的控制方法，从而保证蛋白质表达的准确性和稳定性。
【关于优化原核表达的一些总结】
我认为，进行原核表达条件优化主要应注意以下几方面：1．密码子最优化（codon of optimization）：大肠杆菌某些核糖体蛋白质中的使用频率不同，有最佳密码子（optimal codons）或偏爱密码子（preferred codons），稀有或利用率低的密码子（rare or low-usage codons）。
大肠杆菌稀有密码子主要有ATA，CTA，CCC，ACG，CGA，CGG，AGG，GGA，GGG等。
另外，大肠杆菌偏爱的终止密码子为UAA，而哺乳动物偏爱的终止密码子为UGA。
同时，终止密码子的下游碱基对翻译有效终止有影响，大肠杆菌中UAAN，N的影响力次序为：U>G>A，C；哺乳动物中UAGN，N的影响力次序为：A，G>>C，U。
我用的pET-43.1，先用宿主菌BL21（DE3），没有目的带出现，后改用RosettaBlueTM（DE3），目的蛋白表达效率达50%以上，并且是可溶的。
2．启动子是DNA链上RNA聚合酶的识别位点和结合位点，外源基因表达的理想启动子是可以指导高效转录，保证目的基因高效表达的启动子。
乳糖启动子是最常用的启动子，但容易引起外源基因的渗漏表达，对细胞的生长产生毒害作用；其他从乳糖启动子构建而来的启动子，多用IPTG诱导，IPTG对菌体也有毒害作用。
若IPTG对宿主菌有毒，可以同时加入IPTG和乳糖诱导表达，这样可减少IPTG的浓度。
若目的蛋白有毒，可用Invitrogen公司的pLEX系统等。
3．培养基的成分：用M9ZB和NZCYM培养基培养细菌，增加细菌质粒拷贝数；用LB培养基表达外源蛋白，提高蛋白表达量。
【毒性较大蛋白表达条件优化】：１）一般发酵时高温、高浓度诱导剂（ＩＰＴＧ）有利于表达表达包涵体形成，减少毒性。
２）加大氨苄的浓度（可达400mｇ／ｍｌ）并提高培养基中葡萄糖浓度（可达0.5％）有利于稳定表达，并要及时补充葡萄糖使其浓度维持在0.5％。
蛋白不表达：常见原因及分析
蛋白不表达：常见原因及分析根据自己体会和蛋白版的既往精华帖子，总结了没有发现蛋白质表达的原因，或者蛋白质不表达的原因，欢迎大家拍砖。
1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
见下图3.密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。
优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。
一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。
但是有一点我可以有很大把握的说：对于真核表达，密码子优化只能起锦上添花的作用（确认有表达，以此来提高表达量），而不能雪中送炭（没有表达出来，通过密码子优化极有可能不奏效）。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。
pET系统通常比较稳定。
但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。
还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。
这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。
当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。
N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。
原核表达实验报告 -回复
原核表达实验报告-回复什么是原核表达实验？在实验中原核生物如何表达外源蛋白？这个实验有哪些应用？本文将一步一步回答这些问题。
原核表达实验是指利用原核生物（如细菌）对外源基因进行表达的实验。
通常情况下，研究人员将目标基因插入一个载体中，然后将载体导入原核生物体内。
原核生物通过利用其自身代谢途径和蛋白合成机制，将外源基因转录成mRNA并翻译成蛋白。
在实验中，最常用的载体是质粒（plasmid），它是一种在细胞质中自由存在的环状DNA分子。
研究人员可以通过限制性内切酶的作用，将目标基因插入质粒的多个限制性内切位点中。
随后，带有目标基因的质粒被转化入细菌中，细菌质粒DNA酶解酶的作用下，转化为细胞DNA。
在细菌内部，目标基因通过细菌的转录和翻译机制进行表达。
对于转录，DNA的一条链被RNA聚合酶识别并合成相应的mRNA分子，这个过程称为转录。
翻译是指mRNA上的密码子通过核糖体和tRNA的催化作用，将氨基酸按照基因密码子的顺序连成多肽链，形成蛋白质。
这样，目标基因的DNA序列被转译为目标基因的蛋白质。
原核表达实验有广泛的应用。
首先，它被广泛用于基因工程研究中。
通过原核表达实验，研究人员可以将外源基因导入细菌中，使细菌表达出目标蛋白质，从而研究这些蛋白质的功能和机制。
其次，原核表达实验也可用于大规模生产重组蛋白质。
通过大量培养转化的细菌，可以获得大量目标蛋白质，用于药物研发、工业生产等领域。
另外，原核表达实验还可以用于抗原表达，用于蛋白质酶解学研究、免疫学研究等。
总结起来，原核表达实验是一种将目标基因表达为蛋白质的实验。
通过将目标基因插入质粒中，并将质粒导入原核生物体内，细菌通过其自身的转录和翻译机制将外源基因表达为蛋白质。
该实验在基因工程研究、蛋白质生产和其他领域具有广泛的应用。
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原核蛋白表达常见问题解析
1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？
在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为
包涵体。
经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。
虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。
实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的
培养基等方法获得更多的可溶蛋白。
2、跨膜蛋白为什么很难表达？
跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前
众说纷纭很多种理论。
以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个
原因：
跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式
的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与
信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞
一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌
这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可
能完成的任务。
另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水
性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物
自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。
3、如何选择蛋白表达宿主菌？
4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？
答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶
回收三类。
1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化
获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，
亲和纯化的方便快捷。
2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。
（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去
工具酶。
此方法能快速得到蛋白。
（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。
3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方
法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏
度较高。
5、表达得到的蛋白是有活性的么？
答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性
的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯
化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形
成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。
但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。
6、是否所有的位点特异性蛋白酶都有一样的酶切特性，只是识别位点不同？
答：位点特异性蛋白酶(例如凝血酶、肠激酶和Xa因子)通常被用来切割融合蛋白。
这些酶的活性和第二点酶切倾向性很不相同。
凝血酶在这三种中是特异性活性最高的，能够有效切质量比仅为1:2000的蛋白。
Xa因子似乎对于切点周围的序列很敏感，经常会出现特异性位点切割不理想却发生别的位点被切割的情况。
肠激酶的专一性是上述三种中最好的，但由于切割效率低（通常要求质量比达到1:10）而显得比较昂贵。
另一个需要考虑的问题是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。
在质量比比较高的酶切反应进行完后，通常要通过色谱法处理。
比较方便可行的方法是采用生物素化凝血酶结合链亲和素琼脂糖一起使用。
尽管没有一种蛋白酶完美无缺，凝血酶还算的上是活性高、专一性好的典型。
7、如果去除信号肽，会不会影响蛋白本身的表达？
答：重组蛋白表达强度不受信号肽调控，所以去除信号肽不会影响蛋白质表达。
但是信号肽一方面参与蛋白质折叠成特定空间结构，另一方面其还决定蛋白最终被定位到特定的亚细胞区，一般蛋白只有在特定亚细胞区才能发挥其功能，所以信号肽对蛋白最终活性还是有很大影响的。
8、如何确认表达的蛋白就是我的目的蛋白？
答：可以从以下三个方面予以确认。
首先在分子序列层面，构件好表达载体后，会对表达质粒进行测序确认，有测序文件可以查证。
其次表达过程中，会设置诱导和未诱导的两种裂解液对比，通过SDS-PAGE检测到蛋白条带的差异，在目的蛋白的理论大小位置处，可以看到差异。
最后，可以通过标签抗体或目的蛋白抗体进行WB验证。
9、导致蛋白表达量低或者不表达的原因有哪些？哪类蛋白不容易表达？
答：做原核蛋白表达纯化的人常常被一些问题所困扰，—般来说，在重组蛋白表达宿主的选择中，对原核来源的蛋白质应当只选择大肠杆菌进行表达，而不是真核表达系统，因为通常真核生物的翻译后修饰能力和改善的折叠能力对原核蛋白来说是不必要的，甚至是不想要的。
对于真核蛋白来说情况就不同了，因为有大量的实例表明，真核蛋白能在大肠杆菌中进行成功地表达。
当使用原核系统表达真核蛋白时，一个非常重要的考虑是: 像所有生物一样，大肠杆菌对密码子的使用有偏性，其tRNA丰度反映了这一偏性。
表达含有数个大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白时会受对应的 tRNA丰度的限制而效率不高。
tRNA短缺会导致翻译移框、氨基酸错误掺入及翻译提前终止等。
这个问题在稀有密码子集中分布于N端时尤其明显。
不过，通过合成密码子优化的基因或者使用稀有密码子tRNA丰度增加的商业化工程菌株（如Rosetta菌株，EMD——Novagen）可以避免这个问题。
在多数情况下, 如果重组基因是在亲缘关系很远的生物宿主中表达, 密码子偏性也需要加以矫正。