原核蛋白表达常见问题解析
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方
法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面
都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：
易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料
昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可
供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷
酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标志的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；
（4）一个多限制酶切位点接头；
（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：
获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测
一、试剂准备
1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100m
l ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤
（一）获得目的基因
1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计
一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT- PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
原核蛋白 泄漏表达
原核蛋白泄漏表达
英文回答：
When it comes to expressing recombinant proteins in prokaryotic expression systems, leakage expression is a common problem that can lead to reduced protein yields and increased contamination. Leakage expression refers to the unintended expression of the target protein during the induction phase of protein expression. This can occur due to several factors, including weak promoters, leaky ribosome binding sites, or mutations in the regulatory elements of the expression system.
To minimize leakage expression in prokaryotic systems, several strategies can be employed:
Use strong promoters: Strong promoters, such as the T7 promoter, can help to ensure that the target gene is only expressed during induction. This reduces the chances of leaky expression during the growth phase.
原核蛋白表达流程
原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标
蛋白。以下是一个典型的原核蛋白表达流程：
1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。常用的原核表达系统包括
大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。
2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割
和连接方法，确保目标基因正确插入载体。
3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。
4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。培
养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。
5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避
免蛋白质的降解。
7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层
析等，分离纯化目标蛋白。此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。
8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。确保表达的目标蛋白符合预期。
9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。
根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。
原核表达实验报告 -回复
原核表达实验报告-回复
实验目的：本实验旨在探究原核表达的过程和原理，分析原核表达实验的步骤和相关技术应用。
引言：
原核表达是生物学领域中常用的实验技术之一，它可以通过转录和翻译过程将外源基因导入到原核细胞中并使其表达出目标蛋白质。原核表达在基因工程、药物研发、蛋白质生产等方面起着重要作用。了解原核表达的过程和原理，掌握其实验步骤和技术应用，对于学习和应用相关领域的研究都具有重要意义。
实验步骤：
1. 选择合适的原核表达系统：原核表达系统主要包括细菌和酵母两种。在选择表达系统时，需要考虑目标蛋白质的生理特性和产量需求等因素。细菌表达系统常用的有大肠杆菌(E. coli) 和拟杆菌(Bacillus subtilis)，而酵母表达系统则常用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
2. 构建表达载体：构建表达载体是原核表达实验的关键一步。通常采用的是重组DNA技术，将目标基因插入载体中。载体中包含启动子、选择标记物和阻遏子等元件，以控制和增强目标基因的表达。
3. 转化表达细胞：将构建好的表达载体导入到表达细胞中。常用的转化方法有化学法、电转化法和热冲击法等。通过转化，表达载体成功导入到细胞内。
4. 选择和培养表达阳性克隆：转化后的细菌需要进行筛选，得到表达阳性克隆。通常通过选择标记物（如抗生素）对未转化细胞进行抑制，从而判断转化是否成功。表达阳性克隆可通过液体培养或固体培养等方式进行扩增。
5. 蛋白质表达和纯化：经过培养扩增的表达阳性克隆可进行蛋白质表达和纯化。比较常用的方法有亲和层析、离心扩增和玻璃珠破碎等。
《原核表达实验》课件
宿主菌表达目标蛋白质。
5
制备DNA模板
从适当来源获取DNA模板，构建表达载体， 为实验做好准备。
转化表达宿主菌
选择合适的表达宿主菌，通过转化方法 将表达载体导入宿主菌中。
纯化蛋白质
根据需要选择合适的方法进行蛋白质纯 化，以获取高纯度的目标蛋白质。
制备DNA模板
DNA模板的来源包括基因库、PCR产物等。构建表达载体，并根据实验需要制备适量的DNA模板，为后续实验 做好准备。
纯化蛋白质
根据目标蛋白质的特性和实验要求，选择适当的纯化方法，例如亲和层析、离子交换层析等，保证纯度和活性。
结论
通过学习原核表达实验，我们可以更好地理解蛋白质的结构和功能，并为未来的科研工作提供有力的支持。 总结原核表达实验的优缺点，展望其在未来科学研究中的应用前景。
克隆表达载体
选择合适的表达载体，根据载体和目标基因序列的特点进行克隆操作。注意 避免操作中可能发生的错误。
转化表达宿主菌
根据实验要求选择适当的表达宿主菌，通过化学方法、热激转化等方式将表 达载体导入宿主菌中，并对转化结果进行鉴定。
百度文库
培养表达
根据所选宿主菌的特性和表达需求，进行培养条件的优化。添加适当的诱导 剂，控制表达过程的时机和水平。
《原核表达实验》PPT课 件
原核表达实验PPT课件
简介
原核表达实验是一种常用的生物学实验方法，用于在原核生物中大量表达蛋 白质。通过本课程，了解原核表达实验的重要性和应用。
原核蛋白可溶性表达策略及方案
原核蛋白可溶性表达策略及实验方案
可溶性表达策略
大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为3种：第1种为胞外分泌，即目的蛋白被分泌到培养基中。这种方式表达的蛋白容易纯化，不易降解，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外；第2种为周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N末端；第3种为胞内表达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。
因为多数蛋白不能够进行分泌表达，且表达量较少，所以分泌蛋白表达方法很少被使用；现阶段实验科研中常用的方法是融合型蛋白表达，包括蛋白上清表达和包涵体复性，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。有关通过蛋白复性获得可溶性蛋白请参见《包涵体蛋白复性的方法操作》，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。
降低重组蛋白合成的速率
可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。常用的方法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。
密码子优化
密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。值得注意的是，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响，在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。
原核蛋白表达常见问题解析
原核蛋白表达常见问题解析
原核蛋白表达常见问题解析
1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？
在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为
包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的
培养基等方法获得更多的可溶蛋白。
2、跨膜蛋白为什么很难表达？
跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前
众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个
原因：
跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与
信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞
一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌
这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可
能完成的任务。
另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于
自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。
3、如何选择蛋白表达宿主菌？
4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切
回收三类。
1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化
原核表达系统蛋白表达问题解析
活性蛋白整体方案原核表达系统蛋白表达问题解析
摘要：本文主要对原核蛋白表达纯化体系中的常见问题进行收集整理，并附有解决思路和相应的实际操作。
外源DNA片段成功插到载体里面（PCR鉴定），但无法表达蛋白
一般判断目的基因是否表达，首先要进行SDS-PAGE检测。跑胶的时候一定要设对照：Marker，标准品阳性对照，以及空白载体(诱导)和重组载体(不诱导)2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。跑SDS-PAGE的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在100ng左右；但是不能跟着做western blot了。银染的灵敏度在0.1～1ng；或是Sypro Red，灵敏度高还可以继续做Western blot。
在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要先判断载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。其次要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。最后，也需要注意基因中是否有稀有密码子，可更换表达菌株。
每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。不同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。例如，使用BL21(DE3)菌株表达不成功可以尝试用Rosetta系列菌株表达，它能够由一种氯霉素抗性的、与pET相容的质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。有时不明原因的表达蛋白截短(比预期的分子量要小很多)也可能是由于稀有密码子造成的。
原核蛋白可溶性表达策略及方案
原核蛋白可溶性表达策略及实验方案
可溶性表达策略
大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为3种：第1种为胞外分泌，即目的蛋白被分泌到培养基中。这种方式表达的蛋白容易纯化，不易降解，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外；第2种为周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N末端；第3种为胞内表达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。
因为多数蛋白不能够进行分泌表达，且表达量较少，所以分泌蛋白表达方法很少被使用；现阶段实验科研中常用的方法是融合型蛋白表达，包括蛋白上清表达和包涵体复性，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。有关通过蛋白复性获得可溶性蛋白请参见《包涵体蛋白复性的方法操作》，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。
降低重组蛋白合成的速率
可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。常用的方法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。
密码子优化
密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。值得注意的是，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响，在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。
原核蛋白表达
原核蛋白表达
原核蛋白表达是一种十分重要的生物化学研究，它主要的目的是通过提高原核生物中蛋白质的表达水平，从而获得更高的蛋白质表达产品，并用于各种生物学研究和应用。原核蛋白表达技术是当今生物技术发展中最重要的技术之一，它可以大量表达蛋白质，并且还可以检测其功能特性。该技术有效地定位和表达蛋白质，从而使研究人员能够更好地研究蛋白质的结构及其功能，解析疾病机理及其相关的治疗途径。
原核蛋白表达的基本原理是通过提取基因的DNA序列，然后将其转录成mRNA，最后再通过转录因子结合到mRNA上，来决定蛋白质的表达水平。一般情况下，原核蛋白表达技术主要有三种：重组质粒系，质粒表达系统和转染表达系统。其中，重组质粒表达系统的基本原理是将选定的DNA序列插入质粒，然后将质粒转染到宿主生物体中，从而获得蛋白质的表达产物。质粒表达系统的核心是将所需DNA序列植入质粒，再将其注入细胞中，以此实现蛋白质的表达。转染表达系统是使用rDNA技术将cDNA插入病毒DNA，然后将病毒植入宿主细胞中，从而实现蛋白质的表达。
原核蛋白表达技术在某些领域有着重要的应用，比如在药物研发、药物调控、基因治疗等等，可以大大提升药物的效率与疗效。同时，原核蛋白表达技术还可以用于生物学研究，比如分子诊断、器官模型、生物反应器等，为基础研究科学的发展提供了重要的基础。
在原核蛋白表达的实验中，准确性和精确性是最重要的因素，有
必要通过一些控制试验来确定最佳实验条件。在实施原核蛋白表达实验前，必须测定细胞表达的最佳培养条件。例如，可以根据细胞能否正确表达蛋白质来调节培养基中添加的营养成分，如氨基酸、类固醇、抗生素等等，并且还要确定最佳温度、湿度、pH等参数，以优化蛋白质的表达水平。此外，在实施原核蛋白表达实验过程中也要注意实验操作的洁净度，使用洁净的容器和设备，并且严格按照规定的时间和步骤进行实验，以确保实验的准确性和精确性。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项
时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：
易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标志的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；
（4）一个多限制酶切位点接头；
（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：
获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测
一、试剂准备
1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤
（一）获得目的基因
1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项
时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：
易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标志的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；
（4）一个多限制酶切位点接头；
（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：
获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测
一、试剂准备
1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤
（一）获得目的基因
1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
原核表达系统三大要素的选择及优化
原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。
在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。
1. 表达菌株
菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。
图1 大肠杆菌
原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。
2. 质粒载体
质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。
图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱
启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。
终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA 提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。
原核蛋白表达与纯化
原核表达概述 原核表达原理概述 表达载体 表达菌株 表达条件
原核表达原理概述
目的基因
构建
转化
培养，诱导
表达载体
重组载体 表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
表达载体
• 启动子
• 融合标签
• 常用表达载体系统
常见启动子 • λpL启动子： • trp启动子： 热诱导启动子 化学诱导启动子
常用表达载体系统
系统名称 公司 pGEX 启动子 抗性 Amp 常用标签 GST· Tag 特点 可溶性表达，纯化难以控制，谷 胱甘肽 一步洗脱，得到的蛋白纯 度较低,通常需要去掉GST· Tag 可溶性表达，纯化难以控制，麦 芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度 较低,通常需要去掉MBP· Tag 种类丰富。标签小，无需切割， 一般来说，对蛋白活性无影响。 纯化及其方便。 同pET系统
Guarante L, Roberts TM, Ptashne M. A technique for expression eukaryotic genes in bacteria. Science, 1980, 209: 1428~1430
• 启动子Plac + 操纵基因lacO + 结构基因 • lacI负调控： 阻遏物lacI与操纵基因lacO结合，抑制表达 IPTG：半乳糖苷类似物，结合阻遏物lacI使其失活，启动诱导表达 • cAMP-CAP正调控 cAMP结合并激活CAP，起始转录，实现正调控 葡萄糖抑制腺苷酸环化酶，ATP不能转化为cAMP，无cAMP-CAP，无转录
浅谈原核表达
浅谈原核表达的技巧
摘要：原核表达是表达外源基因常用的方法，具有操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点。本文作者根据自己的实践经验，总结了原核表达的一些技巧。
关键词：原核表达表达载体限制性内切酶
将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于生长和控制；易于培养，实验耗费少；可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒。原核表达是近年来表达外源蛋白常用的方法，本文根据自己的实践经验，着重谈谈对原核表达中的技巧问题。
一、原核表达一般程序
表达前准备-获得目的基因-构建含目的片段的表达载体（测序验证）-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析。
二、原核表达中各操作步骤的关键因素及技巧
1.表达前的准备要素：原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。正所谓“磨刀不误砍柴功”，经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验，可免去许多不必要的麻烦。
（1）对表达载体的分析
载体的选择：同样的载体，同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量起高，但另外一个就是做不出来，所以表达载体的选择非常重要，没有万能的载体。选择载体通常我们关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题：是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的有无，筛选报告基因的位置等。所选载体一定要保持原来的遗传背景（有些载体经过多次交换已变异）。选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如果为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择非融合表达。融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项
发布时间： 2019-06-03 新闻来源：
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：
易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标志的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点) ；
（4）一个多限制酶切位点接头；
（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：
获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测
一、试剂准备
1、LB 培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤
（一）获得目的基因
1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR 方法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
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原核蛋白表达常见问题解析
1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？
在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为
包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的
培养基等方法获得更多的可溶蛋白。
2、跨膜蛋白为什么很难表达？
跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前
众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个
原因：
跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式
的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与
信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞
一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌
这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可
能完成的任务。
另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水
性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物
自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。
3、如何选择蛋白表达宿主菌？
4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？
答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶
回收三类。
1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化
获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，
亲和纯化的方便快捷。
2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。
（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去
工具酶。此方法能快速得到蛋白。
（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。
3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方
法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏
度较高。
5、表达得到的蛋白是有活性的么？
答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性
的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯
化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形
成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。
6、是否所有的位点特异性蛋白酶都有一样的酶切特性，只是识别位点不同？
答：位点特异性蛋白酶(例如凝血酶、肠激酶和Xa因子)通常被用来切割融合蛋白。这些酶的活性和第二点酶切倾向性很不相同。凝血酶在这三种中是特异性活性最高的，能够有效切质量比仅为1:2000的蛋白。Xa因子似乎对于切点周围的序列很敏感，经常会出现特异性位点切割不理想却发生别的位点被切割的情况。肠激酶的专一性是上述三种中最好的，但由于切割效率低（通常要求质量比达到1:10）而显得比较昂贵。另一个需要考虑的问题是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。在质量比比较高的酶切反应进行完后，通常要通过色谱法处理。比较方便可行的方法是采用生物素化凝血酶结合链亲和素琼脂糖一起使用。尽管没有一种蛋白酶完美无缺，凝血酶还算的上是活性高、专一性好的典型。
7、如果去除信号肽，会不会影响蛋白本身的表达？
答：重组蛋白表达强度不受信号肽调控，所以去除信号肽不会影响蛋白质表达。但是信号肽一方面参与蛋白质折叠成特定空间结构，另一方面其还决定蛋白最终被定位到特定的亚细胞区，一般蛋白只有在特定亚细胞区才能发挥其功能，所以信号肽对蛋白最终活性还是有很大影响的。
8、如何确认表达的蛋白就是我的目的蛋白？
答：可以从以下三个方面予以确认。
首先在分子序列层面，构件好表达载体后，会对表达质粒进行测序确认，有测序文件可以查证。
其次表达过程中，会设置诱导和未诱导的两种裂解液对比，通过SDS-PAGE检测到蛋白条带的差异，在目的蛋白的理论大小位置处，可以看到差异。
最后，可以通过标签抗体或目的蛋白抗体进行WB验证。
9、导致蛋白表达量低或者不表达的原因有哪些？哪类蛋白不容易表达？
答：做原核蛋白表达纯化的人常常被一些问题所困扰，—般来说，在重组蛋白表达宿主的选择中，对原核来源的蛋白质应当只选择大肠杆菌进行表达，而不是真核表达系统，因为通常真核生物的翻译后修饰能力和改善的折叠能力对原核蛋白来说是不必要的，甚至是不想要的。对于真核蛋白来说情况就不同了，因为有大量的实例表明，真核蛋白能在大肠杆菌中进行成功地表达。当使用原核系统表达真核蛋白时，一个非常重要的考虑是: 像所有生物一样，大肠杆菌对密码子的使用有偏性，其tRNA丰度反映了这一偏性。表达含有数个大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白时会受对应的 tRNA丰度的限制而效率不高。tRNA短缺会导致翻译移框、氨基酸错误掺入及翻译提前终止等。这个问题在稀有密码子集中分布于N端时尤其明显。不过，通过合成密码子优化的基因或者使用稀有密码子tRNA丰度增加的商业化工程菌株（如Rosetta菌株，EMD——Novagen）可以避免这个问题。在多数情况下, 如果重组基因是在亲缘关系很远的生物宿主中表达, 密码子偏性也需要加以矫正。