微波辅助提取虎杖中白藜芦醇的工艺研究

微波辅助提取虎杖中白藜芦醇的工艺研究【摘要】目的：优选微波辅助提取虎杖中白藜芦醇的最佳工艺。

方法：用紫外分光光度法测定白藜芦醇的含量，并以白藜芦醇的提取率为参考指标，通过单因素实验及正交实验方法对微波辅助提取法（MAE）提取虎杖中白藜芦醇的最佳工艺进行研究。

结果：经过正交实验得到从虎杖白藜芦醇的最佳工艺为：微波辅助作用时间15 min以70%的乙醇为提取剂，料液比1：30，微波辅助功率为500W。

结论：该实验确定的最佳提取工艺简便、快速、准确，灵敏度高和重现性好等优点。

【关键词】虎杖白藜芦醇微波辅助提取正交实验紫外分光光度法虎杖别名花斑竹、酸筒杆、酸桶笋、酸汤梗、川筋龙、斑杖根，为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum，的干燥根茎和根。

多生于山谷、溪旁或岸边，分布在我国中部及南部。

产于江西、福建、云南、四川、贵州等地。

药理作用：（1）对心血管系统的影响：强心扩血管作用；抑制血小板聚集、抗血栓；改善微循环、抗休克作用；降血脂；（2）对呼吸系统的影响：镇咳、平喘作用；（3）对消化系统的影响：胃肠道作用、保肝用；（4）止血抗炎作用；（5）镇静作用；（6）修复损伤的DNA及保护大脑皮层神经元功能、对酶活性抑制作用、对内分泌的影响、对基因表达的影响、利尿作用等[1]。

研究结果表明虎杖含有如下多种化学成分：含有大黄素、大黄素-6-甲醚、大黄素-8-单甲醚、大黄酚、大黄酸及蒽苷大黄素-6-甲醚-8-β-D-葡萄糖苷和大黄素-8-β-D-葡萄糖苷等[2]；含有白藜芦醇和白藜芦醇苷（虎杖苷）.其中白藜芦醇和白藜芦醇苷为主要药用成分。

白藜芦醇（3，4，5，-三羟基二苯乙烯；trans-resveratrol）是一种活性多酚物质，在虎杖、葡萄、花生、毛穗藜芦、毛脉酸模等植物中存在[3]。

白藜芦醇的功能作用：首先，具有抗癌作用，可用于预防与治疗慢性炎症和癌症。

对肿瘤的起始、促进、发展三个阶段均有抑制作用，可作为天然的化学防癌剂。

其次，在心血管方面的作用。

适量饮用葡萄酒有利于心血管健康的观点已得到普遍认同。

另外，白藜芦醇还具有抗氧化、抗自由基，保护肝脏，抗菌，消炎，抗过敏等多种有益人体的功能作用[4]。

目前，国内在白黎芦醇的提取方面研究较多。

一般是采用有机溶剂提取，如乙醇、甲醇、丙酮等，以丙酮提取率最高。

提取方式有浸渍提取、回流提取、超声提取等，硅胶柱层析或大孔吸附树脂吸附分离的方法来提纯白黎芦醇；检测多以高效液相色谱。

本实验以微波辅助提取，具有省时、方便等作用，微波辅助提取中药有效成分具有选择性好、提取纯度高和高效快速的特点，已在中草药化学成分提取方面得到广泛应用。

有关虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇苷和大黄素含量测定方法的研究报道较多，主要有分光光度法、胶束薄层色谱法、电化学发光法、高速逆流色谱法、高效液相色谱等[5-6]，其中以分光光度法最为简单方便。

本研究探讨微波辅助提取虎杖中白藜芦醇的工艺研究，并建立测定白藜芦醇含量的紫外分光光度法，旨在为虎杖的药理作用研究以及科学合理利用提供试验依据。

1 实验部分1.1 原料、试剂与仪器（1）实验原料、试剂；虎杖，产地：福建三明；95%乙醇；乙酸乙酯；石油醚；均为化学纯；白藜芦醇，产地：美国，分析纯。

（2）实验仪器；TR-02型药材粉碎机：（武义县屹立工具有限公司）；LWMC-205型可调功率微波化学反应器：（南京陵江科技开发有限责任公司）；SHB-III循环水式多用真空泵：（郑州长城科工贸有限公司）；UV-2550型紫外分光光度计：（厦门精艺兴业科技有限公司）；FA1604N型电子天平：（上海精密科学仪器有限公司）；RE-52B旋转蒸发仪：（上海博经经贸公司）；SYP智能型玻璃恒温水浴锅：（巩义市予华仪器责任有限公司）；玻璃仪器气流烘干器：（巩义市予华仪器责任有限公司）722S-可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司。

1.2 分析方法本方法采用紫外分光光度计在306.4nm出测量所提取液的吸光度。

一定的波长下有吸收峰进行测定。

白藜芦醇的英文名Resveratrol简写RES，分子式C14H12O3，分子量228.25，无味、白色晶体难溶于水，易溶于乙醇，甲醇，丙酮等有机溶剂，本实验以白藜芦醇为对照品，以乙醇为溶剂，采用分光光度法在306.4nm波长下直接进行白藜芦醇吸光度值的测定，从而分析计算其含量。

1.3 实验步骤（1）备料；把虎杖根茎烘干、把干净的虎杖用粉碎机粉碎，过40目筛后放存储瓶中备用。

（2）配制溶液；分别配制45%、55%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液：乙酸乙酯：水为1：1的溶液。

（3）供试品溶液制备；按照实验方案准确称取1.0g若干份虎杖根茎粉末，分别置于三角锥形瓶中，加入相应浓度和体积的乙醇浸泡6小时，置于微波化学反应器中按方案提供的条件提取，冷却室温后抽滤；加石油醚洗涤至上层清液为无色，滤液再用乙酸乙酯：水为1：1的溶液萃取3次（每次所用溶液为20ml），将萃取液转入旋转回流蒸发仪中，40℃水浴浓缩，样品浓缩后，至于50ml容量瓶中加95%乙醇至刻度，摇匀，分别取2ml至25ml容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试液备用。

（4）微波辅助提取虎杖中白藜芦醇及测定的工艺流程；虎杖根茎→干燥→粉碎→烘干→过筛（40目）→按料液比浸渍→微波提取→冷却→石油醚洗涤→1：1的乙酸乙酯：水溶液萃取→旋转回流蒸发仪（40℃水浴）蒸发→定容（50mL容量瓶）→移取2.00mL→定容（25mL容量瓶）→测定吸光值→分析计算提取率。

1.4 标准曲线的绘制（1）对照品溶液的制备；准确称取白藜芦醇标准品10.00mg至50mL容量瓶中，用无水乙醇配成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。

（2）最大吸收波长的选择；准确吸取对照品溶液0.3mL，置于10mL容量瓶中，加人95%乙醇定容，再取95%的乙醇溶液为空白对照液，及所制取的供试品溶液，将三种溶液用UV-2550型紫外分光光度计于波长为200——400nm范围进行扫描。

结果表明：供试品溶液及对照品溶液均在波长306.4nm处有最大吸收峰，因此选择306.4nm为测定波长。

（3）标准工作曲线：分别精确吸取0.2mg/mL的白藜芦醇对照品溶液0.0mL、0.15mL、0.3mL、0.45mL、0.6mL、0.75ml、0.9ml置于10ml容量瓶中定容，同时以95%乙醇试剂空白对照，在306.4nm处测定吸光度。

以白藜芦醇标准溶液的浓度为横坐标，测定的吸光度为纵坐标，作图得到标准曲线，其回归方程为：Y=0.1614X+0.0682，R=0.9991。

本品在3.0μg～18.0μg/ml范围内线性关系良好。

结果见（图1）。

1.5 微波辅助波提取虎杖白藜芦醇的影响因素微波时间：5—25min；微波功率：200W—600W；溶剂：不同浓度的乙醇（45%-80%）料液比：1：15—1：35。

（1）微波辅助提取单因素实验；准确称取1.0g干燥的白藜芦醇根茎粉末，用不同微波时间、微波功率、乙醇浓度、料液比分别进行单因素实验。

其中相同的提取条件分别是微波时间5min、微波功率400W、乙醇浓度70%、料液比1：25。

（2）微波波提取正交优化实验设计；实际操作中各因素相互交叉影响，为了全面考察影响因素，在单因素的基础上，选取各单因素的较优条件，设计4因素3水平正交实验L9（34），确定白藜芦醇的最佳提取条件。

1.6 虎杖中白藜芦醇提取量的计算方法白藜芦醇提取率：x（%）=（a×50×25/2m）/106式中：x为样品中白藜芦醇的含量%；a为对应标准曲线上所对应的样品中白藜芦醇的质量（ug）；m为样品的质量（g）。

2 结果分析与讨论2.1 虎杖中白藜芦醇提取的单因素实验（1）料液比的选择；料液比即提取过程中原料与提取溶剂的比例（为便于换算，使用质量w/体积v）。

料液比对提取过程的影响主要体现在相同的提取条件下，白藜芦醇等化合物的溶解度一定，此时若增大提取溶剂，则溶解的化合物的量也增大。

理论上，在原料一定时，提取溶剂增大，三萜类化合物的浸出量增大；但提取溶剂并非能无限增大，若提取溶剂用量太大，一方面回收溶剂的成本增加，另一方面提取过程加热的能耗增加。

为寻求最佳的料液比，本实验考察在70%乙醇﹣水体系，微波功率为400W、微波提取时间为5min，不同料液比条件下白藜芦醇的提取率，结果见图2所示。

（2）乙醇浓度的选择；白藜芦醇是多酚化合物，主要来源于蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的根茎提取物。

白藜芦醇为无味的白色晶体；难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。

考虑到甲醇和丙酮的毒性和挥发性，所以本实验采用乙醇-水为溶剂，根据相似相容原理，调节乙醇水比例，使其极性与白藜芦醇相近，从而使得白藜芦醇在提取溶剂中达到最大溶解度。

在乙醇﹣水体系下，微波功率为400W、微波提取时间为5min、料液比1∶25，三萜类化合物的提取率见图3。

结果表明随乙醇体积分数的增大，提取率增大，浓度增大有利于增大白藜芦醇的溶解度，当达到一定程度时提取率不再增大，所以选择乙醇浓度70%为最佳浓度。

（3）微波提取时间的影响；白藜芦醇从虎杖的根茎中溶解到溶剂中是需要一定的时间，当破碎的细胞中的白藜芦醇溶于溶剂中后，采用微波直接作用于虎杖根茎分子，使细胞破裂是需要一定的时间，时间的长短可能决定着虎杖根茎细胞的破裂程度，从而影响虎杖中白藜芦醇的提取率。

为寻找最佳微波提取时间，在微波功率为400W时，料液比1∶25，乙醇浓度70%的条件下，按不同微波提取时间进行提取实验，结果如（图4）。

（图4）表明提取率随时间的延长而增大，当提取时间到达15min后，随着微波时间的延长，提取率增大的不明显或已经停止增长，说明15min时提取率已经达到最大值，所以采取15min为最佳微波时间。

（4）微波功率的影响；粉碎至一定粒度后的药材，一部分虎杖根茎细胞可能会碎裂，其中所含的白藜芦醇可直接被溶剂萃取而转入溶剂中，溶剂与虎杖根茎粉末固体之间的浸泡过程，溶剂不断向固体内部扩散，在细胞内溶解白藜芦醇。

当破碎的细胞中的白藜芦醇溶于溶剂中后，采用微波可直接作用于虎杖根茎分子，使分子的热运动加剧，从而引起温度升高，这种热效应可以快速破坏细胞壁，使虎杖中的白藜芦醇有效成分更快的分离提取出来，为寻找最佳微波功率，在微波时间为5min时，料液比1∶25，乙醇浓度70%的条件下，按不同微波功率进行提取实验，结果如（图5）。

（图5）表明提取率随微波功率而增大，但不是很明显，当达到500W时就已经达到了最大提取率，为节约能源的消耗，只需取500W就为最佳提取功率。

2.2 微波辅助波提取虎杖白藜芦醇的正交优化（1）因素水平；试验选择以下4个因素：微波时间（A）、微波功率（B）、乙醇浓度（C）、料液比（D）作为考察对象，每个因素取3个水平（表1），以提取物中白藜芦醇含量为评价指标，采用L9（34）正交表进行正交试验设计。