猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析_硕士论文 精品

猪脑心肌炎病毒广西株的分离
及其全基因组序列分析 二○○九 年 六 月
硕士学位论文
猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析
学科专业预防兽医学
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论文答辩日期学位授予日期
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猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析
中文摘要
脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus, EMCV）属于微RNA病毒科（Picornaviridae）、心病毒属（Cardiovirus）的成员，可引起猪的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。

针对猪EMCV VP3/VP1基因序列设计并合成一对特异性引物，以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品，建立了检测EMCV核酸的SYBR Green I real-time PCR方法。

该方法线性关系好，标准曲线的相关系数达到0.991；敏感性高，初始模板的检出下限为1×101拷贝/μL，比常规PCR方法高100倍；特异性强，与其它猪源病毒均不发生交叉反应；重复性好，组内与组间的变异系数均小于3%。

应用所建立的方法对临床29份可疑病料进行检测，结果1份为阳性。

将该份疑似病料上BHK-21细胞，并对其进行特性鉴定，确诊为EMCV，命名为EMCV-GXLC，设计5对引物，采用RT-PCR技术扩增EMCV分离株基因组完整开放阅读框（ORF）序列，应用3′-RACE和5′-RACE技术扩增分离株的3′-UTR和5′-UTR，分别进行扩增片段的克隆和测序。

结果表明，EMCV-GXLC株基因组全长7 725 nt，编码区为6 879 nt，编码2 292个aa，将该株全基因组上传NCBI，GenBank 登录号：FJ897755。

应用分子生物学软件对EMCV-GXLC全基因组核苷酸及推导氨基酸序列进行了序列比对和同源性分析。

全基因组比对结果表明，分离株与来源于广西的FJ604852、FJ604853，北京的DQ464062，河北的DQ464063，韩国的DQ517424、EU780148、EU780149等猪源EMCV分离株的同源性较高，达99.5%以上。

各个片段推导的氨基酸同源性分析显示，非结构蛋白比结构蛋白保守；在非结构蛋白中，3D蛋白最为保守，2A相对变异较大，预示EMCV的诊断引物可以基于3D基因；在结构蛋白中，VP2蛋白相对保守，VP1蛋白同源性最低、变异性较大，适合用于分子流行病学的调查。

VP1蛋白有两个潜在的N-糖基化基序，分别为N29QT和N62QT，VP1是表位最多的区域，预测有9个可能的表位；VP2和VP3共有6个潜在的N-糖基化位点。

3′-UTR和5′-UTR二级结构分析显示，FJ897755与来源于韩国的DQ517424相似度最高。

进化树分析显示，结构蛋白与全基因序列的系统发育进化树相近，且不同结构蛋白基因序列之间的系统发育进化树结构也类似，在分析EMCV分离株的进化关系时，可以使用VP3/VP1基因来绘制系统发育进化树。

关键词：猪脑心肌炎病毒；荧光定量PCR；分离；测序；全基因组；进化分析
ISOLATION AND GENOMIC SEQUENCE ANALYSIS OF PORCINE ENCEPHALOMYOCARDITIS VIRUS GUANGXI
STRAIN
英文摘要
Encephalomyocarditis virus (EMCV) is a member of the genus Cardiovirus of the family Picornaviridae, it is clinically characterized by encephalitis, myocarditis or inflammation around cardiac muscles.
A pair of primers was designed according to the sequence of the VP1 gene of EMCV and a real-time PCR assay based on SYBR Green I for detection of EMCV was established. The assay had a good linear relationship between initial templates and Ct values, and the correlation coefficient of the standard curve was 0.991. Also, it was highly sensitive and had a detection limit of 1×101 copies/μL of initial templates, which was 100 times more sensitive than the conventional PCR. Moreover, it was highly specific and had no cross-reaction with other porcine viruses. Finally, it was highly reproducible and had a coefficient of variations less than 3 percent for both intra- and inter-assay.
One EMCV strain was isolated from the clinical tissue samples orignated from pig farms in Guangxi by using BHK-21 cells. This isolate was designated EMCV-GXLC（GenBank accession No. FJ897755），and identified using IFA. The virus particles with diameter of 27 nm were observed by immune electron microscopy (IEM). Five pairs of primers were designed and five overlapping cDNA fragments covering the complete open reading frame (ORF) within BJC3 and HB1 were amplified using RT-PCR. The 5'-rapid amplification of cDNA ends (RACE) and 3'-RACE were employed to amplify the 5'-untranslated region (UTR) and 3'-UTR of the RNA of the viruses. The sequences of RT-PCR-generated cDNA fragments from EMCV-GXLC viruses were assembled. The complete genomes of EMCV-GXLC consisted of 7 725 nucleotides, and possessed a large ORF with a size of 2 292 amino acids.
The homology of the genomic nucleotide sequences and the predicted amino acids were aligned and analyzed among EMCV-GXLC and other EMCV strains available in GenBank. The results showed that
KEY WORDS:encephalomyocarditis virus (EMCV)；real-time PCR；isolation；sequence；genome；phylogenetic analysis
目录
中文摘要 (I)
英文摘要 (II)
目录 (III)
插图和附表 ......................................................................................................................... V I
插图清单 ......................................................................................................................... V I 附表清单 ........................................................................................................................ V II
缩略词表 .......................................................................................................................... V III 1.文献综述 . (1)
1.1 EMCV基因组结构 (1)
1.1.1 EMCV衣壳蛋白及其功能 (2)
1.1.2 EMCV非结构蛋白P2和P3 (3)
1.1.3 EMCV 5′-UTR结构与功能 (3)
1.1.4 EMCV 3′-UTR (5)
1.2 EMCV诊断技术 (5)
1.2.1 病毒分离 (5)
1.2.2 抗体检测方法 (5)
1.2.3 抗原检测方法 (6)
1.3 EMCV的流行情况及流行特点 (6)
1.3.1 流行情况 (6)
1.3.2 流行特点 (7)
1.4 EMCV的公共卫生学意义 (8)
1.5 研究内容与技术路线 (9)
1.5.1 研究内容 (9)
1.5.2 技术路线 (10)
2.猪脑心肌炎病毒SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立 ... 错误！未定义书签。

2.1 材料与方法 ............................................................................. 错误！未定义书签。

2.1.1 病毒与引物 ..................................................................... 错误！未定义书签。

2.1.2 主要试剂 ......................................................................... 错误！未定义书签。

2.1.3 试验用溶液配制 ............................................................. 错误！未定义书签。

2.1.4 主要仪器设备 ................................................................. 错误！未定义书签。

2.2 方法 ......................................................................................... 错误！未定义书签。

2.2.1 质粒标准品的制备 ......................................................... 错误！未定义书签。

2.2.2 Real-time PCR反应条件的优化.................................... 错误！未定义书签。

2.2.3 Real-time PCR标准曲线的制作.................................... 错误！未定义书签。

2.2.4 Real-time PCR的敏感性试验........................................ 错误！未定义书签。

2.2.5 Real-time PCR的特异性试验........................................ 错误！未定义书签。

2.2.6 Real-time PCR的重复性试验........................................ 错误！未定义书签。

2.2.7 Real-time PCR的初步应用............................................ 错误！未定义书签。

2.3 结果与分析 ............................................................................. 错误！未定义书签。

2.3.1 质粒标准品的制备 ......................................................... 错误！未定义书签。

2.3.2 Real-time PCR反应条件的优化.................................... 错误！未定义书签。

2.3.3 Real-time PCR标准曲线的制作.................................... 错误！未定义书签。

2.3.4 Real-time PCR的敏感性试验........................................ 错误！未定义书签。

2.3.5 Real-time PCR的特异性试验........................................ 错误！未定义书签。

2.3.6 Real-time PCR的重复性试验........................................ 错误！未定义书签。

2.3.7 Real-time PCR的初步应用............................................ 错误！未定义书签。

2.4 讨论 ......................................................................................... 错误！未定义书签。

2.4.1 荧光定量PCR检测方法的建立.................................... 错误！未定义书签。

2.4.2 荧光定量PCR反应特点................................................ 错误！未定义书签。

2.4.3 影响荧光定量PCR反应的因素.................................... 错误！未定义书签。

2.4.4 荧光定量PCR反应的优缺点........................................ 错误！未定义书签。

2.5 小结 ......................................................................................... 错误！未定义书签。

3.猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列测定........... 错误！未定义书签。

3.1 材料 ......................................................................................... 错误！未定义书签。

3.1.1 病料收集 ......................................................................... 错误！未定义书签。

3.1.2 主要试剂 ......................................................................... 错误！未定义书签。

3.1.3 试验用溶液配制 ............................................................. 错误！未定义书签。

3.1.4 主要仪器设备 ................................................................. 错误！未定义书签。

3.2 方法 ......................................................................................... 错误！未定义书签。

3.2.1 病毒的分离 ..................................................................... 错误！未定义书签。

3.2.2 病毒的RT-PCR鉴定...................................................... 错误！未定义书签。

3.2.3 EMCV-GXLC株间接免疫荧光抗体试验（IFA）....... 错误！未定义书签。

3.2.4 EMCV-GXLC株TCID50的测定 ................................... 错误！未定义书签。

3.2.5 分离株的全基因组扩增、克隆与测序 ......................... 错误！未定义书签。

3.3 结果与分析 ............................................................................. 错误！未定义书签。

3.3.1 EMCV病毒的分离......................................................... 错误！未定义书签。

3.3.2 EMCV-GXLC株的RT-PCR鉴定 ................................. 错误！未定义书签。

3.3.3 EMCV-GXLC株间接免疫荧光抗体试验（IFA）....... 错误！未定义书签。

3.3.4 EMCV-GXLC株TCID50的测定 ................................... 错误！未定义书签。

3.3.5 EMCV-GXLC株基因片断的RT-PCR扩增结果 ......... 错误！未定义书签。

3.3.6 EMCV-GXLC株各个基因片段的克隆、测序及序列拼接错误！未定义书签。

3.4 讨论 ......................................................................................... 错误！未定义书签。

3.4.1 关于EMCV的分离........................................................ 错误！未定义书签。

3.4.2 关于EMCV的鉴定........................................................ 错误！未定义书签。

3.4.3 关于EMCV-GXLC株全基因的扩增............................ 错误！未定义书签。

3.5 小结 ......................................................................................... 错误！未定义书签。

4.猪脑心肌炎病毒广西株(EMCV-GXLC)全基因组分子特征分析错误！未定义书签。

4.1 材料 ......................................................................................... 错误！未定义书签。

4.1.1 本研究所用EMCV分离株信息.................................... 错误！未定义书签。

4.1.2 分子生物学分析软件 ..................................................... 错误！未定义书签。

4.2 方法 ......................................................................................... 错误！未定义书签。

4.2.1 基因组结构分析 ............................................................. 错误！未定义书签。

4.2.2 序列比对 ......................................................................... 错误！未定义书签。

4.2.3 结构蛋白基本特征、表位预测及二级结构 ................. 错误！未定义书签。

4.2.4 系统进化分析 ................................................................. 错误！未定义书签。

4.3 结果与分析 ............................................................................. 错误！未定义书签。

4.3.1 EMCV-GXLC株的基因组组成和结构分析................. 错误！未定义书签。

4.3.2 EMCV各基因片段同源性分析..................................... 错误！未定义书签。

4.3.3 EMCV多聚蛋白各基因片段连接处氨基酸分析......... 错误！未定义书签。

4.3.4 EMCV-GXLC株VP1分子特征................................... 错误！未定义书签。

4.3.5 EMCV-GXLC株VP2、VP3分子特征........................ 错误！未定义书签。

4.3.6 EMCV-GXLC株5′-UTR二级结构预测...................... 错误！未定义书签。

4.3.7 EMCV-GXLC株3′-UTR二级结构预测...................... 错误！未定义书签。

4.3.8 EMCV系统发育进化树绘制......................................... 错误！未定义书签。

4.4 讨论 ......................................................................................... 错误！未定义书签。

4.4.1 EMCV-GXLC株基因组序列比较................................. 错误！未定义书签。

4.4.2 EMCV-GXLC株的变异特点......................................... 错误！未定义书签。

4.4.3 EMCV-GXLC株VP1的抗原性.................................... 错误！未定义书签。

4.4.4 病毒基因组的系统发育进化关系 ................................. 错误！未定义书签。

4.5 小结 ......................................................................................... 错误！未定义书签。

5.结论 (11)
附录 (12)
附录1：SYBR Green I real-time PCR用重组质粒测序结果 (12)
附录2：SYBR Green I real-time PCR重复性试验数据 (12)
附录3：EMCV-GXLC株第1 ~ 5代细胞毒TCID50测定结果 (13)
附录4：EMCV-GXLC株全基因组序列 (15)
致谢 (20)
攻读学位期间发表论文情况 (21)
申明 (22)
参考文献 (23)
插图和附表
插图清单
图1- 1 EMCV 基因组结构和多聚蛋白裂解图 (2)
Fig. 1-1 Organization and polyprotein of the genome of EMCV (2)
图1-2 近年来EMCV全球流行情况 (7)
Fig. 1-2 The recent global epidemic of EMCV (7)
图2-1 PCR扩增产物 .................................................................................................. 错误！未定义书签。

Fig. 2-1 Product of PCR ................................................................................................. 错误！未定义书签。

M. DNA Marker DL2 000；1. PCR产物..................................................................... 错误！未定义书签。

M. DNA Marker DL2 000；1. PCR product ................................................................ 错误！未定义书签。

图2-2重组质粒鉴定....................................................................................................... 错误！未定义书签。

Fig. 2-2 Identification of the recombinant plasmid................................................... 错误！未定义书签。

图2-3 SYBR Green I real-time PCR的扩增曲线(A)、熔解曲线(B) ...................... 错误！未定义书签。

Fig. 2-3 Dynamic curve(A) and melting curve(B) of SYBR Green I real-time PCR错误！未定义书签。

图2-4 SYBR Green I real-time PCR的标准曲线 .................................................... 错误！未定义书签。

Fig. 2-4 Standard curve of SYBR Green I real-time PCR ....................................... 错误！未定义书签。

图2-5 SYBR Green I real-time PCR特异性试验 .................................................... 错误！未定义书签。

Fig. 2-5 Specificity assay of SYBR Green I real-time PCR ...................................... 错误！未定义书签。

图3-1 EMCV在BHK-21细胞上产生的细胞病变 .................................................. 错误！未定义书签。

Fig. 3-1 CPE of EMCV in BHK-21 cells .................................................................... 错误！未定义书签。

图3-2 EMCV-GXLC株3D基因片段的RT-PCR鉴定........................................... 错误！未定义书签。

Fig. 3-2 Identification of 3D gene of EMCV-GXLC strain ...................................... 错误！未定义书签。

图3-3 EMCV-GXLC株的间接免疫荧光抗体试验鉴定结果 .................................. 错误！未定义书签。

Fig. 3-3 IFA identification of EMCV-GXLC strain in BHK-21 cells ....................... 错误！未定义书签。

图3-4 EMCV-GXLC株基因组各片段扩增结果 ...................................................... 错误！未定义书签。

Fig. 3-5 The amplified fragments the genome of EMCV-GXLC strain by RT-PCR错误！未定义书签。

图4-1 EMCV-GXLC株的序列信息.......................................................................... 错误！未定义书签。

Fig. 4-1 Sequence information about EMCV-GXLC strain ..................................... 错误！未定义书签。

图4-2 EMCV-GXLC株基因组组成简图.................................................................. 错误！未定义书签。

Fig. 4-2 The genome organization diagram of EMCV-GXLC strain ...................... 错误！未定义书签。

图4-3 EMCV-GXLC株与EMCV参考毒株VP1蛋白氨基酸序列比对............... 错误！未定义书签。

Fig. 4-3 Alignment of the predicted amino acid sequences for VP1 of EMCV ....... 错误！未定义书签。

图4-4 EMCV-GXLC株VP1蛋白特性预测............................................................ 错误！未定义书签。

Fig.4-4 Prediction on antigen sites and some characters of VP1 protein of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。

图4-5 EMCV-GXLC株VP2和VP3氨基酸序列 .................................................. 错误！未定义书签。

Fig. 4-5 Predicted amino acid sequences of VP2 protein and VP3 protein of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。

图4-6 EMCV-GXLC株VP2蛋白特性预测............................................................ 错误！未定义书签。

Fig. 4-6 Prediction on antigen sites and some characters of VP2 protein of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。

图4-7 EMCV-GXLC株VP3蛋白特性预测............................................................ 错误！未定义书签。

Fig. 4-7 Prediction on antigen sites and some characters of VP3 protein of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。

图4-8 EMCV-GXLC株与部分EMCV参考株的5′-UTR二级结构预测 ............. 错误！未定义书签。

Fig. 4-8 Prediction of the 5′-UTR secondary structure of EMCV-GXLC strain and reference
EMCV .................................................................................................................... 错误！未定义书签。

图4-9 部分EMCV分离株的ploy（C）结构域基因片段比对结果....................... 错误！未定义书签。

Fig. 4-9 Alignment of the nucleotide sequences for ploy(C) of EMCV ................... 错误！未定义书签。

图4-10 EMCV-GXLC株与部分EMCV参考株的3′ -UTR二级结构预测 ............. 错误！未定义书签。

Fig. 4-10 Prediction of the 3′-UTR secondary structure of EMCV-GXLC strain and reference EMCV .................................................................................................................... 错误！未定义书签。

图4-11 EMCV 全基因组、ORF核苷酸序列系统发育进化树............................... 错误！未定义书签。

Fig. 4-11 Phylogenetic trees derived from EMCV complete genome and ORF nucleotide sequences错误！未定义书签。

图4-12 EMCV CCR、VP3/VP1、VP2和VP1核苷酸序列绘制的系统发育进化树错误！未定义书签。

Fig. 4-12 Phylogenetic trees derived from four EMCV datasets，i.e. CCR，VP3/VP1，VP2 and VP1 nucleotide sequences ............................................................................................. 错误！未定义书签。

图4-13 EMCV P2、P3、2A、3D核苷酸序列绘制的系统发育进化树 ................. 错误！未定义书签。

Fig. 4-13 Phylogenetic trees derived from four EMCV datasets，i.e. P2，P3，2A and 3D nucleotide sequences ............................................................................................................... 错误！未定义书签。

图4-14 EMCV 3′-UTR、5′-UTR核苷酸序列绘制的系统发育进化树 .................. 错误！未定义书签。

Fig. 4-14 Phylogenetic trees derived from EMCV 3′-UTR and 5′-UTR nucleotide sequences错误！未定义书签。

附表清单
表2-1 荧光定量PCR所用引物 ................................................................................ 错误！未定义书签。

Table 2-1 The primers of real-time PCR ................................................................... 错误！未定义书签。

表2-2 模板浓度、引物浓度的优化........................................................................... 错误！未定义书签。

Table2-2 Optimize the concentration of template and primers ............................... 错误！未定义书签。

表2-3 SYBR Green I real-time PCR敏感性试验 ................................................... 错误！未定义书签。

Table 2-3 Sensitivity assay of SYBR Green I real-time PCR ................................... 错误！未定义书签。

表2-4 SYBR Green I real-time PCR的重复性试验 ............................................... 错误！未定义书签。

Table 2-4 Reproducibility assay of SYBR Green I real-time PCR .......................... 错误！未定义书签。

表3-1 PCR所用引物 ................................................................................................. 错误！未定义书签。

Table 3-1 The primers for PCR .................................................................................. 错误！未定义书签。

表3-2 扩增EMCV-GXLC株全基因组序列所用的引物 ........................................ 错误！未定义书签。

Table3-1 Primers used for amplification of the complete genome of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。

表3-3 用于5′-RACE和3′-RACE的引物 ............................................................... 错误！未定义书签。

Table 3-3 Primers for 5′-RACE and 3′-RACE .......................................................... 错误！未定义书签。

表3-4 EMCV-GXLC株细胞毒TCID50测定........................................................... 错误！未定义书签。

Table 3-4 Detection the TCID50 of EMCV-GXLC strain.......................................... 错误！未定义书签。

表4-1 EMCV参考毒株 ............................................................................................. 错误！未定义书签。

Table 4-1 EMCV reference strains in this study ....................................................... 错误！未定义书签。

表4-2 EMCV-GXLC株基因组结构......................................................................... 错误！未定义书签。

Table 4-2 The genome organization of EMCV-GXLC strain .................................. 错误！未定义书签。

表4-3 EMCV-GXLC株与其他EMCV参考株核苷酸及推导的氨基酸同源性分析错误！未定义书签。

Table4-3 Comparison of the nucleotide and deduced amino acid sequences of the EMCV-GXLC strain with other EMCV strains .......................................................................... 错误！未定义书签。

表4-4 EMCV多聚蛋白各基因片段连接处氨基酸分布情况.................................. 错误！未定义书签。

Table 4-4 Putative polyprotein cleavage sites junction predicted amino acid sequences错误！未定义书签。

缩略词表
缩略词英文全称中文全称
aa amino acid 氨基酸
Amp ampicillin 氨苄青霉素
bp base pair 碱基对
BHK-21 Baby hamster kidney cell line 乳仓鼠肾细胞传代细胞系cDNA complementary DNA 互补DNA
CPE cytopathic effect 细胞病变
CSFV classical swine fever virus 猪瘟病毒
DEPC diethyl pyrocarbonate 焦磷酸二乙酯
DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸
dNTPs deoxyribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核苷
EDTA Ethylene diamine tetra acetaticacid 乙二胺四乙酸
EMCV Encephalomyocarditis virus 脑心肌炎病毒
FMDV Foot and mouth disease virus 口蹄疫病毒
IFA indirect immunofluorescent antibody assay 间接免疫荧光抗体试验
IPTG β-D-thiogalactopyranoside 异丙基硫代半乳糖苷
kb kilo base pair 千碱基对
L liter 升
mg milligram 毫克
min minute 分钟
mL milliter 毫升
nt nucleotide 核苷酸
PBS phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液
PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应
r/min revolutions per minute 每分钟转数
RACE rapid amplification of cDNA ends 快速扩增cDNA末端RNasin ribonuclease inhibitor 核糖核酸酶抑制剂
RT reverse transcription 反转录
s second 秒
TCID5050% tissue culture infection dose 半数组织（细胞）培养感染量µL microliter 微升
1.文献综述
脑心肌炎是由脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）引起的猪、某些哺乳动物乃至灵长类动物以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的一种急性传染病[1]。

EMCV感染猪只所致病情的严重程度与病毒的毒力和猪只的年龄有关，感染断奶前仔猪可引起致死性心肌炎，造成急性死亡，死亡率最高可达100%[2]；而断奶后到成年猪则多呈亚临床感染，偶尔引起死亡；怀孕母猪感染时可引起流产、产死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障碍症，通常不发生猪只死亡[3]。

1945年，Helwig等[4]从佛罗里达州一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩体内分离得到第一株EMCV。

几年后，Dick等[5]又从一只患脑脊髓炎的恒河猴体内分离得到该病毒。

随后相继报道，该病毒可以感染多种动物，包括狒狒、非洲绿猴、松鼠、大象、疣猪、貘、长颈鹿甚至蚊子等[6,7]。

1958年，巴拿马首次报道EMCV引起了仔猪急性致死性心肌炎[8]。

随后在意大利、希腊、塞浦路斯、比利时、法国、英国等国报道了该病的暴发流行[9,10]。

但直到1986年才将EMCV与猪的繁殖障碍性疾病联系起来[11,12,13]。

到目前为止，报道过EMCV感染猪的地区有欧洲、亚洲、非洲、北美洲、南美洲五大洲，尤以欧洲居多。

猪脑心肌炎不仅给许多国家带来了较大的经济损失，也给人类的健康带来了安全隐患。

我国猪场也已证实存在EMCV感染，到目前为止，我国也已分离鉴定出4株猪源EMCV，分别是引起仔猪心肌炎型和引起母猪繁殖障碍型的毒株[14]。

1.1 EMCV基因组结构
脑心肌炎病毒是微RNA病毒科心病毒属的唯一成员[15]。

EMCV只有一个血清型[16,17]。

病毒粒子呈圆形，直径27 nm，无囊膜。

分子量为2.4×103KDa，沉降系数为156 S，在氯化铯中的浮密度为1.34 g/cm3。

EMCV基因组全长约7.8 Kb，单股正链RNA病毒，具有典型的微RNA病毒科成员基因组结构特点——（L）-4-3-4，如图1-1所示。

EMCV 基因组RNA含有5′-UTR（5′untranslated regions）、3′-UTR（3′untranslated regions）和一个较大的阅读框架（open reading frame，ORF）。

ORF所编码的病毒蛋白被称为“多聚蛋白”。

多聚蛋白在病毒自身所编码的三种不同蛋白酶的作用下，被分解成P1、P2、P3产物和一个病毒自身编码的前导蛋白（L 蛋白）。

在病毒粒子的形成过程中，EMCV前体蛋白分别成熟为P1、P2和P3多肽，P1又继续裂解为1A（VP4）、1B（VP2）、1C（VP3）和1D（VP1）；P2和P3编码蛋白加工相关蛋白（2Apro，3Cpro和3CDpro）和基因组复制相关蛋白（2B，2C，3AB，3BVPg，3CDpro和3Dpol）。

在P1蛋白的前端，靠近5'-UTR处还有一个前导蛋白（Leader protein），简称L蛋白。

在5'-末端有一个小的蛋白——VPg，仅含有20～24个氨基酸残基，在病毒RNA 开始复制时起―引物蛋白‖的作用，同时参与病毒的装配。

病毒RNA只有与VPg结合后，才能够被装入病毒衣壳[18]。

在VPg和病毒基因之间含有多聚尿嘧啶（Poly U）。

VPg的酪氨酸残基通过磷酸二酯键共价连接于病毒RNA 5′-末端的pUpUp上。

在距RNA翻译起始点5′-末端上游150个碱基处有一个Poly C片段，长度因毒株不同而异，约50 nt～200 nt[19]。

EMCV RNA 5′-末端无帽子结构，但有一个非编码前导序列（5′-UTR）。

在病毒的3′-末端也含有一个非翻译序列（3′-UTR）。

图1- 1 EMCV 基因组结构和多聚蛋白裂解图
Fig. 1-1 Organization and polyprotein of the genome of EMCV
A. EMCV 基因组简图；
B. EMCV多聚蛋白加工模式图
A. Diagram of the viral RNA genome of EMCV;
B. Processing pattern of EMCV polyprotein
1.1.1EMCV衣壳蛋白及其功能
P1蛋白前体裂解为具有功能性的衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4[20]。

VP1、VP2和VP3位于病毒粒子的表面，VP4位于衣壳内侧，紧贴于VP1、VP2、VP3复合体。

VP1、VP2和VP3的C端位于病毒粒子的表面，N端在病毒粒子的内部。

对于微RNA病毒，中和抗原位点主要在VP1和VP3的BC环以及VP2的EF环上[20]。

EMCV的4种衣壳蛋白中VP1的抗原性最强，且与病毒粒子表面的拓扑结构、抗原性、受体吸附以及脱壳有关。

X射线检晶仪对相关微RNA病毒的检测发现VP1最为突出。

抗VP1的多克隆抗体可以中和EMCV在小鼠体内的感染，这表明VP1应该是一种可以引起对EMCV感染保护性免疫的抗原[21,22]。

VP1和VP3是主要的抗原表位区域，VP1编码277 aa，VP3编码231 aa。

VP1/VP3结合区是EMCV相对变异较大的区域，是研究EMCV遗传变异的主要结构域。

Koenen 等[23]对欧洲主要EMCV流行区域不同毒株进行VP3/VP1和3D区域的分子进化分析，将欧洲EMCV流行毒株分成2个进化分支。

VP4蛋白在病毒进入细胞的早期阶段是必需的，而其具体的作用机制还不是十分清楚[24]。

1.1.2EMCV非结构蛋白P2和P3
病毒的非结构蛋白由P2区的2A、2B、2C（编码产物的分子量分别为16 kDa、17 kDa和36 kDa[25]）和P3区的3A、3B、3C、3D（编码产物的分子量分别为10 kDa、2 kDa、22 kDa和51 kDa）组成。

病毒的非结构蛋白主要分为两类，一类是参与病毒蛋白编码加工相关蛋白（2A、3C、3CD），另一类是病毒基因组复制相关蛋白（2C、3B、3AB、3D）。

EMCV的2A蛋白参与自动催化和病毒多聚蛋白的早期裂解。

病毒多聚蛋白合成后，首先由2A蛋白酶将蛋白水解成P1和P2＋P3，再由3C蛋白酶将P2和P3分别水解成单体——2A、2B和2C以及3A、3B、3C和3D。

病毒的2A蛋白含有许多酵母核糖体蛋白都有的核定位信号，2A蛋白的缺失可以阻止病毒的核定位[25]。

同时，缺失2A蛋白的病毒也会丧失抑制细胞mRNAs“帽”结构依赖性翻译的能力[26]，这一抑制机制与2A病毒蛋白和游离的40S紧密结合但却不出现在80S聚集区有关[27]。

Krausslich等[28]研究发现，2A蛋白酶通过裂解eIF4G来抑制宿主细胞内的蛋白合成。

尽管2A蛋白在EMCV的病毒周期中如此重要，但是最新的研究表明，2A基因缺失345 nt的病毒仍然能够对细胞感染，且感染细胞后，各种生物学指标基本稳定。

2C 蛋白可能具有ATP酶活性[29]，在肠病毒属和鼻病毒属病毒中，2C蛋白也是一种抗胍标记的基因来源，这种标记的复合物可以影响RNA合成的启动。

2C在病毒复制过程中所起的作用目前还不清楚。

2B蛋白可以改变细胞膜，增加细胞膜的渗透性，这可能对病毒感染晚期病毒粒子的释放具有重要的作用。

P3的裂解产物3A、3B、3C和3D与病毒基因组的复制关系紧密。

3B即VPg蛋白[30]，其序列富含亲水性氨基酸，只在多肽的氨基末端有一个酪氨酸残基。

在正链和负链RNA合成的启动过程中都需要VPg的参与。

3C和它的前体3CD在病毒蛋白的水解过程中发挥主要作用。

在被2A蛋白羧基末端附近的多肽段催化后，3C蛋白几乎参与了病毒蛋白所有的后期水解过程[31]。

3D基因相对保守，根据3D基因设计的PCR引物用于检测EMCV，特异性和敏感性都很高[32,33]。

3D编码RNA聚合酶，可以催化引物介导的反应中新生RNA链的延长，在病毒聚合酶复合物中发挥着重要的作用，且3D可作为免疫和感染动物的鉴别诊断抗原。

1.1.3EMCV 5′-UTR结构与功能
EMCV 5'-UTR较长，一般约800 nt左右。

5'-UTR主要的功能区域包括poly(C)和内部核糖体进入位点（Internal ribosomal entry site, IRES）。

1.1.3.1 Poly(C)结构域
Poly(C)存在于口蹄疫病毒属和心病毒属，心病毒属成员的poly(C)长度约80～250 nt。

对心病毒来说，病毒的poly(C)越长，可能对动物的致病性也越强[19,34]。

利用病毒
全长感染性克隆技术，不同长度的poly(C)全长感染性克隆体（C8, C12, 和C13UC10），在转染后获得的子代病毒与亲本病毒——EMCV野生株（C115UCUC3UC10）在细胞感染实验中没有明显的不同，有人因此认为poly(C)不是影响EMCV组织培养等环节的关键性因素[35]；但也有人认为poly(C)的长度影响病毒在一些鼠源细胞上的增殖，而不影响在HeLa细胞上的增殖[36]。

甚至有人用实验证明，截短poly(C)的EMCV全长感染性cDNA克隆子代病毒在小鼠体内没有致病性，而完整poly(C)长度的EMCV全长感染性cDNA克隆恢复病毒能将小鼠致病[2]。

1.1.3.2 IRES序列
IRES 由450个碱基组成，它可以有效的引导核糖体进入病毒途径而不是细胞途径。

被捕获的核糖体沿着一条长的ORF而下，合成多聚蛋白。

IRES使得病毒基因组可以不经过正常的5′-帽结构，直接进行多聚蛋白的翻译[37,38,39]。

IRES基序一方面限制了EMCV编码衣壳蛋白的变异[40]；另一方面又对处于其后的基因序列起到强有力的启动，甚至这种启动作用不依赖于其它启动子即可发挥作用。

位于IRES基序之前，EMCV 5'-末端基因组核苷酸序列不需要完全保守，即使有个别的点突变，只要其IRES 基序的核心序列不发生突变，即可完成病毒RNA的转录[41]。

IRES翻译效率的高低与免疫球蛋白重链在双链结构中的比例有关，免疫球蛋白IgG重链和轻链的比例接近l：l时IRES能有效介导RNA的翻译，而当IgG重链的比例降低到40 %时IRES的翻译效率也随之降低[42]。

IRES翻译起始除需要正常的起始因子外还需要IRES翻译作用因子(ITAFs)，不同的脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点需要的ITAFs也不同，ITAFs加强了IRES中两个正常的起始因子的连接，并且ITAFs 之间的相互作用也决定了IRES作用的方向性[43]。

EMCV 5′-UTR的IRES包含有一个真核起始因子eIF-2/2B[44]。

通过基因组学和生物化学研究表明，一个57 kDa大小的RNA结合蛋白（p57）在EMCV的复制、翻译机制中起到关键性作用[45]。

利用EMCV IRES独特的翻译机制，即直接以IRES基序对下游基因序列进行转录、翻译“起始”调控[46]，改造表达载体取得一连串的成功。

IRES对于构建新型载体，提高外源基因的表达量有明显的作用[47,48,49]；甚至利用IRES 构建的载体能够高效表达两个外源基因[50,51]。

目前，EMCV的IRES还广泛应用于实验和制药领域的蛋白表达，如红细胞和无细胞的抽提物的蛋白表达[52]。

1.1.3.3L蛋白
EMCV L蛋白的功能目前还不是很清楚，但位于L蛋白内部的“锌指”基序，能够稳定空间构象，调控病毒mRNA转录、翻译[53]。

法国Kassimi研究小组利用“锌指”基序这种调控机制，将绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）插入到EMCV全长感染性cDNA克隆质粒上，经体外转录、转染BHK-21细胞后，获到携有GFP标记的恢复病毒——rEMCV2887A-egfp[32]。