彗星试验琼脂糖凝胶片保存方法研究

相对偏差 ( %)
+ 1121 - 7175
Olive 尾矩
2310 ±1810 1619 ±2316 1813 ±2613 1817 ±2812 1912 ±2819
相对偏差 ( %)
+ 8128 + 2167
尾 DNA 含量
5115 ±2713 3411 ±3011 2811 ±1614 3612 ±3111 2911 ±2212
相对偏差 ( %)
- 17160 - 19161
尾长Π头长
1126 ±1111 1107 ±1143 0187 ±1127 1139 ±2115 0179 ±1130
相对偏差 ( %)
- 18169 - 43117
注 : (1) 相对偏差 = (第 14 天损伤值 - 第 1 天损伤值)Π第 1 天损伤值
冷曙光 牛勇 潘祖飞1 郑玉新
中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 ,北京 100050
单细胞凝胶电泳技术检测环境因素致 DNA 损伤具有很 高的灵敏性 ,已在国内外广泛用于职业危险因素引起的人群 健康效应研究[1] 。国内多数现场与实验室距离较远 ,不具备 荧光显微镜和图像存储设备 ,因此极大地限制了该技术的应 用和推广 。湿片在保存和运输方面困难较大 ,并且储存时间 越长 ,DNA 扩散的可能性就越大 ,结果越不稳定 。找到一种 稳定可靠的凝胶片保存方法 ,是将该方法推广应用于现场工 作的迫切需求 。国内有文献报道使用冷冻法保存凝胶片 ,但 只能保存 2～3 天 。国外已有研究使用甲醇脱水干燥法和乙 醇脱水干燥法保存凝胶片 ,但尚没有系统的研究这两种脱水 干燥法对琼脂糖凝胶片保存的影响 [2 ,3] 。本研究比较了乙醇 和甲醇两种脱水干燥法对凝胶片保存的影响 。
(2002202221 收稿)
文章编号 :100028020 (2003) 0120061202
·方法与技术·
甲基氧化偶氮甲醇对大鼠脑组织细胞增殖的影响
汤宁
中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所 ,北京 100050
甲基氧化偶氮甲醇 (methylazoxymethanol ,MAM) 是一种糖 苷配基苏铁素类烷化剂 。可从一些被当地居民当作食物的热 带植物种子中萃取得到 。有报道表明 ,MAM 是一种强烈的抗 有丝分裂化合物 ,可以引起实验动物头小畸形 [1] ,神经行为改 变[2] 。MAM 可使鸟嘌呤的 7 位碱基甲基化和杀死分裂中的 培养脑细胞[3] 。发育过程中的脑组织因神经元细胞不足可能 是 MAM 导致头小畸形的原因 。细胞增殖分析被认为是发育 过程中重要的生物标志物 ,细胞周期中 S2期细胞百分比与细 胞增殖相关[4] 。本研究采用已知的天然植物神经毒素 MAM , 分析不同部位脑组织中 S2期细胞百分比 ,进一步探讨细胞增 殖生物标志物在神经系统发育损伤中的应用 ,探讨 MAM 染毒 引起的头小畸形的机制 。
秩和检验 。
2 结果与讨论
湿琼脂糖凝胶片和不同干燥法 、不同保存时间的脱水干 燥琼脂糖凝胶片中 ,4 个彗星损伤指标与平行操作的阴性对 照和阳性对照组相比均有显著性差异 ( P 均小于 01001) (结果 未列) 。
附表为 25μmolΠL H2O2 处理组的湿琼脂糖凝胶片和脱水 干燥后的琼脂糖凝胶片的彗星损伤测量结果 ,湿凝胶片的尾 长 、olive 尾矩 、尾 DNA 含量和尾长Π头长比这四个指标与两种
3 参考文献
1 Kassie F , Parzefall W , Knasmuller S. Single cell gel electrophoresis as2
say : a new technique for human biomonitoring studies. Muta Res ,2000 , 463 ,13 —31 2 Woods JA , O′leary KA , McCarthy RP , et al . Preservation of comet assay slides : comparison with fresh slides. Muta Res ,1999 ,429 ,181 —187 3 Zhu CQ , Lam TH , Jiang CQ , et al . Increased Lymphocyte DNA strand breaks in rubber workers. Muta Res ,2000 ,470 ,201 —209 4 朱志良 ,庄志雄 ,黄钰 ,等. 单细胞凝胶电泳图象分析系统的研制与 应用. 中华劳动卫生职业病杂志 ,2001 ,19 (4) :298 —300
附图 不同保存方法和时间的单细胞凝胶电泳图片
第1期
汤宁. 甲基氧化偶氮甲醇对大鼠脑组织细胞增殖的影响
61
脱水干燥法的干凝胶片相比均存在显著性差异 ,而 1 天和 14 焦的问题 (如附图) 。由此可见 ,脱水干燥后的凝胶片至少可 天保存时间的干燥凝胶片间四个指标比较均无显著性差异 。 保存两周以上 ,这利于在现场短时间内对大量样本进行处理 ; 此外镜检时发现干燥保存的凝胶片染色后 ,由于凝胶的干燥 另一方面读取脱水干燥后的凝胶片 ,聚焦准确将提高结果的 所有细胞均在同一个平面上 ,解决了湿片图象读取时不易聚 精确度 。
附表 25μmolБайду номын сангаасL 处理组两种脱水干燥存片方法的结果比较(1)
保存方法 保存时间
细胞数 (个)
湿凝胶片
60
乙醇脱水 1 天 57
干燥法 14 天 63
甲醇脱水 1 天 59
干燥法 14 天 62
尾长
5616 ±3714 4114 ±4219 4119 ±4115 4216 ±4511 3913 ±4213
1 材料与方法
111 材料 11111 仪器 恒压恒流电泳仪 、电泳槽 、4 ℃冰箱 、OLYMPUS IX50 型荧光倒置显微镜 、Kodak DC290 数码相机 。 11112 试剂 正常熔点琼脂糖凝胶 、低熔点琼脂糖凝胶 、淋 巴细胞分离液 、NaCl (分析纯) 、Na22EDTA (分析纯) 、Tris 碱 (分 析纯) 、DMSO (分析纯) 、Triton X2100 (分析纯) 和溴化乙啶 (分 析纯) 。 11113 血样 静脉血 3ml ,取自一位 40 岁健康男子 ,肝素抗凝。 112 方法 11211 H2O2 处理 常规提取淋巴细胞 ,定容至 3ml 的 PBS 中 。将淋巴细胞悬液均分到 3 个 5ml 试管中 ,分别加入 H2O2 至终浓度分别为 0 (阴性对照) 、25 (处理组) 和 50μmolΠL (阳性 对照) ,置于 37 ℃恒温水浴摇床中 30min ,离心弃上清 ,使用 PBS 洗涤细胞两次 ,定容至 015ml 。 11212 单细胞凝胶电泳 使用两层凝胶法 ,第一层为 100μl 1 %的正常熔点琼脂糖凝胶 ,第二层为 100μl 1 %的低熔点琼脂 糖凝胶和 10μl 的淋巴细胞悬液的混合液 。将制好的载玻片 浸 入 含 215molΠL NaCl 、100mmolΠL Na22EDTA、10mmolΠL Tris (NaOH 调 pH 10) 、体积分数分别为 10 %的 DMSO 和 1 %的 Tri2 ton X2100 (用前加入) 的裂解液中 ,4 ℃放置 2h。电泳前将载片 置于预冷的碱性电泳缓冲液 (300mmolΠL NaOH、1mmolΠL Na22 EDTA、pH > 13) 中于 4 ℃放置 40min。于电压 1125VΠcm、电流 300mA 的条 件 下 4 ℃电 泳 20min。将 电 泳 完 毕 的 载 片 置 于 pH714 的 014molΠL Tris 缓冲液中 10min 以中和强碱 。每个剂 量制备 3 张琼脂糖凝胶片 。全部操作在黄光下完成 。 11213 琼脂糖凝胶片脱水干燥保存方法 在不同处理组中 ,
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (No. 39970633) 作者简介 :冷曙光 ,男 ,博士研究生 1 本溪钢铁公司劳动卫生与职业病研究所 ,117000
分别取出 2 张已经中和的凝胶片 ,进行脱水干燥保存 。乙醇 脱水干燥法是将已经中和的琼脂糖凝胶片置于冰冷无水乙醇 中脱水 10min ,然后置于空气中自然干燥 。甲醇脱水干燥法是 将已经中和的琼脂糖凝胶片置于冰冷无水甲醇中脱水 10min , 后置于 50 ℃烤箱中放置 5min ,取出后琼脂糖凝胶片自然干 燥 。已干燥的琼脂糖凝胶片置于普通载玻片盒中 ,常温下保 存 。阳性和阴性对照与处理组琼脂糖凝胶片均平行操作 。 11214 读片 湿琼脂糖凝胶片在做完后即使用 50μl 30μmolΠL 的溴乙锭溶液染色立即读片 。脱水干燥的琼脂糖凝胶片则存 于载片盒中于第 1 和 14 天时使用同样的溴乙锭溶液染色读 片 。照片存于计算机中 。待试验全部结束后 ,使用朱正良等 制的单细胞凝胶电泳软件 IMI 110 测量 4 个常见的损伤指标 : 尾长 、olive 尾矩 、尾 DNA 含量和尾长Π头长比[4] 。每个实验组 随机读取 50 个以上的细胞 。 113 统计分析
用胰 酶 法 分 离 细 胞[7] , 碘 化 丙 啶 ( propidium iodide ) 染 色[6] ,用 FACSCalibur 流 式 细 胞 计 (Becton Dickinson) 测 定 , 用 CellQuest 程 序 (Becton Dickinson) 计 数 , 用 ModFit 程 序 (Verity Software House , Inc. ) 分析细胞周期 。以细胞周期中 S2期细胞 百分比作为细胞增殖指数 ( PI = 单位体积样品中 S2期细胞数 ÷单位体积样品中细胞总数 ×100 %) 。 113 统计分析
第 32 卷 第 1 期 60 2003 年 1 月
卫 生 研 究 JOURNAL OF HYGIENE RESEARCH
文章编号 :100028020 (2003) 0120060202
彗星试验琼脂糖凝胶片保存方法研究
Vol. 32 No. 1 Jan. 2003
·方法与技术·
1 材料与方法
111 实验动物 采用 NCTR 繁殖的出生第 1 天 ( PND1) 的 SD 大鼠 。所有
PND1 幼鼠来自 8 窝 ,每窝 10 只动物 ,5 只雄性 、5 只雌性动 物 ,但只有雄性动物用于实验 ,雌性动物用于保持自然状态 。
作者简介 :汤宁 ,男 ,硕士 ,副研究员
4 窝 PND1 雄鼠一次性皮下注射注射给予 MAM 10mgΠkgBW ,4 窝作为对照 ,同时给予生理盐水 ,无特殊病原条件 ( SFP) 下饲 养 。于 PND7 、14 、21 、28 和 60 日龄时于每窝各取 1 只动物 (每 组动物数为 4 只 ,除 PND60 对照组因动物意外死亡仅 3 只) , 分别采集脑干 、尾核 、小脑 、额部皮层 、海马 、下丘脑和嗅球组 织 ,组织于枸橼酸2蔗糖2二甲基亚砜溶液 [5] , - 80 ℃保存 。 112 流式细胞计细胞周期分析
进一步比较甲醇和乙醇脱水干燥存片方法间的彗星损伤 参数未发现显著性差异 。甲醇脱水干燥的凝胶片保存 2 周后 除 olive 尾矩外尾长 、尾 DNA 含量和尾长Π头长这 3 个指标的 变化均大于乙醇脱水干燥保存的凝胶片 。由于甲醇脱水干燥 法比乙 醇 脱 水 干 燥 法 步 骤 多 了 一 步 , 即 50 ℃烤 箱 中 放 置 5min ,且琼脂糖凝胶片在存放过程中 ,有部分甲醇脱水干燥的 琼脂糖凝胶片出现了凝胶层与载玻片剥离的现象 ,而乙醇脱 水干燥法未出现上述情况 ,所以考虑到现场使用的方便性和 可靠性 ,作者推荐乙醇脱水干燥存片方法作为现场使用的首 选方法 。
1125μmolΠl 处理组湿凝胶片 ,2125μmolΠl 处理组乙醇脱水保存 1 天的凝胶片 ,3125μmolΠl 处理组乙醇脱水保存 14 天的凝胶片 ,41 阳性对照组湿凝胶片 ,5125μmolΠl 处理组甲醇脱水保存 1 天的凝 胶片 ,6125μmolΠl 处理组甲醇脱水保存 14 天的凝胶片