重组汉坦病毒核壳蛋白的制备及其单克隆抗体的研制

论 著重组汉坦病毒核壳蛋白的制备及其单克隆抗体的研制3黄汉菊1 王小红1 杨　泗1 黄庆华1朱慧芬2 沈关心2 郭兆彪3 杨瑞馥31　同济医科大学基础医学院微生物学教研室,武汉　4300302　同济医科大学基础医学院免疫学教研室,武汉　430030　3　军事医学科学院微生物流行病研究所,北京　100071 摘要　将PCR 扩增的H TV 762118RNA 小片段的c DNA 克隆插入到载体pD S 56 RBS 2(O )26H is 中,通过IPT G 诱导表达以及镍螯合层析纯化重组N P ,经过SD S 2PA GE 、免疫转印和EL ISA 方法分析其蛋白特性,证实该重组N P 与毒粒N P 相同,均为49.6ku ,能与肾综合征出血热(H FR S )患者血清产生特异性反应。

以此重组N P 作为抗原制备抗N P 单克隆抗体,获得两株持续稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

用抗N P M c A b 建立检测Ig M 抗体的EL ISA 捕获法。

证实纯化重组N P 作为抗原,避免了组织培养病毒的感染性和非特异性以及难以标准化的缺点。

所建立的EL ISA 捕获法检测H FR S 患者血清中Ig M 抗体的方法特异性强、敏感性高,可作为H FR S 的早期诊断试剂。

关键词　汉坦病毒;　重组N P 蛋白;　抗体,单克隆中图法分类号　R 373,　Q 51Prepara tion of Recom b i nan t Nucleocapsid Prote i n of Han tav irusand the D evelopm en t of The ir M onoclona l An tibod iesH uang H an ju ,W ang X iaohong ,Yang Si et a lD ep a rt m en t of M icrobiology ,S chool of B asic M ed ica l S ciences , T ongj i M ed ica l U n iversity ,W uhan 430030Abstract T he c DNA ,the s m all fragm en t of H an taviru s (H TV )762118RNA am p lified by reverse tran scri p ti on po lym erase chain reacti on (R T 2PCR ),w as cloned in to the exp ressi on vecto r pD S 56 RB S 2(O )26H is to largely exp ress recom b inan t nucleocap sid p ro tein (r N P ),w h ich induced by IPT G ,and pu ri 2fied by affin ity ch rom atograp hy on a n ickel 2chelate resin ,in E scherich ia coli .T he characteristics of r N P w ere analyzed by SD S 2PA GE ,i m m unob lo t and EL ISA .T he resu lts dem on strated that bo th the r N P and viral N P have the sam e an tigen icity ,m o lecu lar w eigh t (49.6ku )and specific com b inati on w ith the sera from p atien ts w ith hem o rrhagic fever w ith renal syndrom e viru s (H FR S ).W ith the r N P as an tigen ,tw o hyb ridom as secreting an ti 2N P m onoclonal an tibodies persisten tly and stab ly w ere ob tained .A Λ2cap tu re EL ISA w as set up to detect Ig M an tibodies to H TV ,and it w as testified that th is m ethod u tilizing pu rified r N P as diagno stic an tigen cou ld avo id handling the infecti ou s viru s ,non 2specificity and difficu lties of stan 2dardizati on and so on .So ,th is novel Λ2cap tu re EL ISA based on r N P can be taken fo r sen sitive and specific early diagno sis of H FR S .Key words H an taviru s ;　recom b inan t p ro tein s ;　an tibodies ,m onoclonal3　国家自然科学基金资助项目(N o .39370657)黄汉菊,女,1951年生,副教授。

第28卷第1期第1页1999年　2月 同济医科大学学报A cta U niv M ed Tongji V o l .28　N o.1　P.1Feb .　1999 汉坦病毒(H an taan viru s)又名肾综合征出血热病毒(hem o rrhagic fever w ith renal syndrom e viru s,H FR S),是流行性出血热的病原体。

本病主要病变是全身小血管和毛细血管广泛受损,临床上以发热、出血、低血压和蛋白尿为特征,病死率高达10%。

患者感染后抗体出现早,发热第2d即可测出血清中的Ig M抗体,第7～10d达高峰。

IgG抗体在第3～4d出现,10～14d达高峰。

因此,抗H FR S Ig M抗体的检测可作为早期诊断指标。

已知H an taan病毒的基因组分为L、M、S3个基因片段,分别编码依赖RNA的RNA多聚酶、G1、G2外膜糖蛋白、核壳蛋白[1]。

S基因片段编码核壳蛋白,是抗体的主要识别抗原,是目前H FR S理想的诊断用抗原,已分别在原核系统、杆状病毒、痘苗病毒中进行了表达[2]。

1　材料与方法1.1　菌株与培养基E.Co li SG13009株,H TV2762118株,载体pD S56 RB S 2(O)26H is(德国Em st2Rodenw aldt 公司产品),L u ria2B ertan i(LB)培养基。

1.2　试剂材料聚乙二醇(PEG,MW20000),T riti on2x2100,三羟甲基氨基甲烷(T ris),中分子量标准蛋白(MW14 286～96233ku),乙二胺四乙酸(ED TA),IPT G (MW238.3),卡那霉素(Kanam ycin30m g L),氨苄青霉素(am p ic2illin100m g L),盐酸胍(Guan i2 dine,HC l,MW95.53),尿素(u rea),以上试剂均购自Sigm a公司,镍螯合凝胶(N i2+2N TA2sepharo se,购自德国Q iaexp ress公司),抗人Ig M HR P购自军事医学科学院微生物流行病研究所。

1.3　血清标本均为H FR S(22例)发病期1～7d的血清,其中湖北省随州市4例,湖北省黄冈地区4例,武汉市黄陂县6例,安徽省8例。

军事医学科学院微生物流行病研究所10例患者作为阳性对照。

正常人血清来自本校职工体检人员。

1.4　方法1.4.1　重组核壳蛋白(recom b inan t N P,r N P)表达载体的构建及r N P的纯化:通过PCR扩增获得H TV2762118RNA小片段的c DNA克隆(图1)经B am H 和B gl 双酶切后插入到载体pD S56 RB S 2(O)26H is中,再通过转化导入E.Co li SG13009株。

将表达克隆接种于含有卡那霉素、氨苄青霉素的LB培养基中旋转培养过夜,并经IPT G诱导培养5h后,收获细菌经溶菌酶裂解和超声粉碎等预处理后,将所获得的非溶解性表达产物溶于含8m o l L 尿素的T ris HC l缓冲液中,以10m l h速度泵进镍螯合柱内,经不同梯度的pH缓冲液洗脱,收集含重组蛋白质的组分,用含1m o l L尿素的9g L N aC l 缓冲液透析后测定其含量。

图1　PCR扩增H TV2762118c DNA片段电泳①汉坦病毒株　②核酸标准　③重组质粒1.4.2　N P蛋白的鉴定:采用SD S变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(SD S2PA GE)鉴定N P蛋白。

标准分子量蛋白按1Λg Λl的比例配制,加入20Λl。

待检蛋白质样品每孔加入20Λl,电泳约5～6h,直至溴酚蓝指示剂前沿下至凝胶末端1c m处,即停止电泳。

将胶块放在固定液中浸泡1h(57.0g三氯醋酸,17.0g磺基水杨酸,150m l甲醇,加水至500 m l)。

用50m l L甲醇和75m l L乙醇混合液脱色。

蛋白质混合样品经SD S2PA GE后,分离为不同的条带,亦可将PA GE胶上的蛋白条带转移到N C 膜上,将N C膜与抗血清一起孵育,使抗血清(第一抗体)与待检的抗原(特异的蛋白条带)反应,再与酶标记的第二抗体反应1.4.3　抗N P的M c A b的制备:用上述纯化重组蛋白作为抗原,按常规方法免疫B alb c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2 O融合,共通过4次融合、克隆、亚克隆[3]等过程,筛选出抗体阳性细胞克隆10株,将其制备腹水通过SPA2 sep haro se CL4B层析柱纯化抗N P的M c A b。

1.4.4　EL ISA捕获法:采取2种方法测试,其一,以抗人Ig M抗体包被EL ISA平板孔(1∶1000),4℃过夜,封闭后依次加入患者血清,纯化的N P抗原(10Λg m l,100Λl 孔)、酶标抗N P M c A b(本室标记);其二,以抗N P M c A b包被EL ISA平板孔(1∶1000),4℃过夜,封闭后依次加入纯化的N P抗原,患者血清,酶标抗人Ig M,加底物O PD显色,测定OD值,每次检测均设有阳性和阴性参考血清对・2・同济医科大学学报 1999年2月第28卷第1期照。