034 G16S-0202-01
白念珠菌对氟康唑耐药机制的研究
㊃论著㊃白念珠菌对氟康唑耐药机制的研究封小川1,2 元航1 郑莹莹1,3 白江苗1 张欠欠1(1.延安大学医学院,延安716000;2.延安市人民医院,延安716000;3.延安大学附属医院,延安716000)ʌ摘要ɔ 目的 通过研究白念珠菌对氟康唑耐药相关基因E R G 11㊁C D R 1㊁C D R 2和MD R 1的表达水平及其与耐药的关系,旨在对本地区以白念珠菌感染为主的侵袭性念珠菌病的防治提供依据㊂方法 选取延安地区两家三甲医院临床确诊的对氟康唑耐药及敏感的白念珠菌各10株,扩增其靶酶编码基因E R G 11,分析突变位点;使用荧光染料罗丹明6G 分析耐药组与敏感组菌株的外排情况;采用荧光定量P C R 检测白念珠菌外排泵编码基因的表达水平㊂结果 E R G 11扩增测序结果显示,耐药菌株C 3号虽发生了碱基位点突变,但并未引起编码氨基酸的改变,耐药菌株C 7号及敏感菌株C 12号发生了碱基位点的突变,引起编码氨基酸的改变;荧光染料罗丹明6G 检测白念珠菌外排实验结果显示,耐药菌和敏感菌无论加入葡萄糖与否外排均存在显著差异,且耐药组加入葡萄糖较未加入葡萄糖外排量明显增加,差异有统计学意义(P <0.01);R T -P C R 检测外排泵基因结果显示,C D R 1与C D R 2外排泵基因表达水平在耐药菌与敏感菌之间差异有统计学意义(P <0.05)㊂结论 研究基因表达及外排泵功能检测结果均表明,本地区白念珠菌对氟康唑的耐药机制主要与外排泵基因过度表达相关,未发现靶酶编码基因有意义的突变㊂ʌ关键词ɔ 氟康唑;耐药机制;E R G 11;C D R 1;C D R 2ʌ中图分类号ɔ R 379.4 ʌ文献标志码ɔ A ʌ文章编号ɔ 1673-3827(2023)18-0481-06S t u d y on t h e m e c h a n i s m o f f l u c o n a z o l e r e s i s t a n c e i n C a n d i d a a l b i c a n s F E N G X i a o c h u a n 1,2,Y U A N H a n g 1,Z H E N G Y i n g y i n g 1,3,B A I J i a n g m i a o 1,Z HA N G Q i a n qi a n 1(1.M e d i c a l C o l l e g e o f Y a n a n U n i v e r s i t y ,Y a n a n 716000,C h i n a ;2.Y a n a n P e o p l e s H o s p i t a l ,Y a n a n 716000,C h i n a ;3.Y a n a n U n i v e r s i t y A f f i l i a t e d H o s pi t a l ,Y a n a n 716000,C h i n a )ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T o s t u d y t h e e x p r e s s i o n l e v e l s of f l u c o n a z o l e r e s i s t a n tg e n e s E R G 11,C D R 1,C D R 2,a n d MD R 1i n C a n d i d a a l b i c a n s a n d th ei r r e l a t i o n s h i p w i t h d r u g re s i s t a n c e ,a n d t o p r o v i d e a b a s i sf o r t h e p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f i n v a -s i v e c a n d i d i a s i s m a i n l y c a u s e d b y C a n d i d a a l b i c a n s i n f e c t i o n i n t h i s r e gi o n .M e t h o d s T e n f l u c o n a z o l e r e s i s t a n t s t r a i n s a n d 10f l u c o n a z o l e s e n s i t i v e s t r a i n s w e r e s e l e c t e d f r o m e a c h h o s p i t a l i n t w o t e r t i a r y a n d f i r s t -c l a s s h o s p i t a l s i n Y a n 'a n a r e a .A m -p l i f y i n g t h e t a r g e t e n z y m e c o d i n g g e n e E R G 11,a n a l y z i n g t h e m u t a t i o n s i t e s ,f l u o r e s c e n t d y e u s i n g rh o d a m i n e 6G w e r e u s e d t o a n a l y z e t h e e f f l u x o f s t r a i n s f r o m d r u g r e s i s t a n t a n d s e n s i t i v e g r o u p s .T h e n ,f l u o r e s c e n c e qu a n t i t a t i v e P C R w a s u s e d t o d e -t e c t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e g e n e e n c o d i n g t h e e f f l u x p u m p o f C a n d i d a a l b i c a n s .R e s u l t s E R G 11a m p l i f i c a t i o n a n d s e -q u e n c i n g r e s u l t s s h o w e d t h a t a l t h o u g h t h e r e s i s t a n t s t r a i n C 3h a d a b a s e s i t e m u t a t i o n ,i t d i d n o t c a u s e c h a n g e s i n t h e c o d i n ga m i n o a c i d .T h e r e s i s t a n t s t r a i n C 7a n d t h e s e n s i t i v e s t r a i n C 12h a d ab a s e s i t e m u t a t i o n ,c a u s i n g c h a n g e s i n t h e c od i n g am i -n o a c i d ;f l u o r e s c e n t d ye r h o d a m i n e 6G w a s u s e d t o d e t e c t t h e ef f l u x o f C a n d i d a a l b i c a n s .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e e f f l u x o f r e s i s t a n t i s o l a t e a n d s e n s i t i v e i s o l a t e w e r e s ig n i f i c a n t l y d i f f e r e n t wh e t h e r g l u c o s e w a s a d d e d o r n o t ,a n d t h e e f f l u x o f d r u gr e s i s t a n t i s o l a t e w i t h g l u c o s e w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t w i t h o u t g l u c o s e ,a n d t h e d i f f e r e n c e w a s s t a t i s t i c a l l y s i gn i f i -c a n t (P <0.05);t h e R T -P C R d e t e c t i o n o f e f f l u x p u m p g e n e s s h o w e d a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f C D R 1a n d C D R 2e f f l u x p u m p g e n e s b e t w e e n d r u g-r e s i s t a n t a n d s e n s i t i v e i s o l a t e (P <0.05).C o n c l u s i o n T h e r e -s u l t s o f g e n e e x p r e s s i o n a n d e f f l u x p u m p f u n c t i o n t e s t i n g i n t h i s s t u d yi n d i c a t e t h a t t h e r e s i s t a n c e m e c h a n i s m o f C a n d i d a a l -b i c a n s t o f l u c o n a z o l e i n t h i s r e g i o n w a s m a i n l y r e l a t e d t o o v e r e x p r e s s i o n o f e f f l u x p u m p g e n e s ,a n d n o s i g n i f i c a n t m u t a t i o n s w e r e f o u n d i n t h e t a r g e t e n z y m e c o d i n g ge n e s .基金项目:陕西省重点研发计划项目(2021S F -230);榆林市科技项目(C X Y -2020-064);延安大学校产学研项目(C X Y 202121)作者简介:封小川,女(汉族),硕士,主治医师.E -m a i l :x i a o c h u a n 880112@163.c o m 通信作者:张欠欠,E -m a i l :z h a n g q i a n yd @163.c o m ㊃184㊃ 中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M yc o l ,D e c e m b e r 2023,V o l 18,N o .6ʌK e y w o r d sɔf l u c o n a z o l e;d r u g r e s i s t a n c e m e c h a n i s m s;E R G11;C D R1;C D R2[C h i n J M y c o l,2023,18(6):481-486]近年来,世界范围内以白念珠菌感染为主的侵袭性念珠菌病呈上升趋势,全球S E N T R Y抗真菌监测显示,在欧洲,白念珠菌引起的感染占念珠菌属的52.5%㊁亚太地区为46.0%㊁拉丁美洲为43.9%㊁美国和加拿大为42.7%[1],我国流行病学调查显示[2-3],白念珠菌引起的感染占念珠菌属的65%,个别地区甚至大于70%,在免疫功能低下者和植入医疗设备的健康人中白念珠菌的感染率居首位,感染病死率高达68.9%[4],美国每年也会因置入导管引发的白念珠菌感染造成约10万人死亡[5]㊂美国感染病学会(I D S A)指出氟康唑是既往非粒细胞缺乏念珠菌血症患者初始治疗及I C U中高危患者侵袭性念珠菌感染预防的首选药物[6],在发展中国家,三唑类药物(如氟康唑等)是治疗侵袭性念珠菌感染尤其是白念珠菌感染的主要药物[7]㊂但随着氟康唑在临床上的长期广泛应用,致使白念珠菌对氟康唑的耐药性不断增强,据美国疾控中心(C D C)统计,在感染念珠菌患者的血液样本中,约有7%对氟康唑耐药[8]㊂全球S E N T R Y监测显示[9],白念珠菌对氟康唑的耐药率为11.9%,我国白念珠菌对氟康唑的耐药率小于6%,剂量依赖性敏感(S D D)率为4.35%[10],这势必给临床治疗白念珠菌引发的疾病过程中带来严峻考验㊂文献报道显示[11-13],白念珠菌对氟康唑耐药机制主要是靶酶编码基因E R G11的突变和外排泵编码基因过表达,但由于不同地区白念珠菌的感染及其耐药不同,其耐药机制亦不尽相同,因此,本文通过研究白念珠菌对氟康唑耐药相关基因E R G11㊁C D R1㊁C D R2和MD R1的表达水平及其与耐药的关系,探究延安地区白念珠菌对氟康唑的耐药机制,对管理目前有限的抗真菌药物,以及为患者提供精准治疗服务至关重要㊂1材料和方法1.1材料菌株收集延安市两家三甲医院送检并经鉴定为白念珠菌且对氟康唑耐药和敏感的菌株各10株,耐药菌株编号C1-C10,敏感菌株编号C11-C20㊂标准质控菌株:白念珠菌A T C C90028㊂纳入标准:①经质谱鉴定为白念珠菌;②根据美国临床实验室标准化研究所(C L S I)判断标准[14],敏感(S):M I Cɤ8μg/m L,耐药(R):M I Cȡ64μg/m L,药敏结果复核为白念珠菌对氟康唑耐药及敏感菌株;③所有操作均符合实验室操作标准㊂主要试剂和仪器 Y e a s t O n e p l a t e真菌药敏板试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)(批号:280543)㊁T a q D N A聚合酶(北京百奥莱博科技有限公司)(批号:J N0015)㊁逆转录试剂盒(广州赛国生物科技有限公司)(批号:70060000)㊁罗丹明6G(西亚化学试剂商店)(批号:20211115)㊁V I T E K M S全自动快速质谱微生物检测系统(法国梅里埃公司)㊁A B I7300型全自动荧光定量P C R 仪(美国A B I公司)㊁C y t o m i c s500流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)㊁N a n o d r o p O n e超微量分光光度计(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)㊁T a n o n3500型凝胶成像分析系统(上海天能有限公司)㊂1.2方法E R G11基因扩增并测序白念珠菌D N A的提取:菌株培养㊁离心后,提取出白念珠菌D N A,与5μL样品混合均匀后进行电泳约55m i n,应用电脑成像系统进行凝胶相片拍摄㊂以G e n B a n k公布的白念珠菌标准菌株E R G11基因序列数据为准, P C R引物设计:E R G11F:5 -A T G G C T A T T-G T T G A A A C T G T C A T T G-3 (第1~25位)㊁E R G11 R:5 -T T A A A A C A T A C A A G T T T C T C T T T T T-T C C-3 (第1560-1587位)㊂罗丹明6G在试验菌株中外排情况的测定①实验菌株经离心㊁预冷,重悬于P B S使葡萄糖耗尽,加入罗丹明6G后将试管放于冰面上,然后在菌液中加入P B S混合均匀㊁离心,用流式细胞仪进行分析记录,此时菌株的荧光强度设为外排前的起始荧光强度;②洗3次预冷P B S,将多余的罗丹明6G去除后分为两管,一管50μL菌液加入1m L P B S,另一管50μL菌液加入1m L P B S,离心加入P B S混合均匀,运用流式细胞仪分析,将未用罗丹明6G处理的菌株细胞的荧光强度作为自身荧光对照;③将摄取罗丹明6G之后的细胞荧光强度作为基底,分别减去加与不加葡萄糖外排之后的细胞㊃284㊃中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r2023,V o l18,N o.6荧光强度,进行数据分析㊂白念珠菌外排泵基因表达的检测 白念珠菌外排泵基因引物序列见表1㊂表1 白念珠菌外排泵基因引物T a b .1 G e n e p r i m e r s o f C a n d i d a a l b i c a n s e f f l u x p u m p 序列名称片段片段大小18S r R N AF :5'-T CG G G G G T A T C A G T A -T T C A G T T G T C -3'83b pR :5'-T C C T T G G T A A A T G C T T T -C G C A G T A G -3'C D R 1F :5'-TG A C T C C T G C T A C C G T G T -T G -3'194b pR :5'-A C C T G G A C C A C T T G G A A -C A T -3'C D R 2F :5'-C C TG G A A G C A C A G T T G T C -C A -3'161b pR :5'-T C C C C C T T T T G C A T A G C A -C C -3'MD R 1F :5'-G G G T G C T G T T T G T G G T C C -T A -3'196b pR :5'-A C C G G T G A T G G C T C T C A A -T C -3'A C T 1F :5'-TG G A C G G T G A A G A A G T T G -C T -3'184b pR :5'-T T G G A T T G G G C T T C A T C A -C C A -3'P MA 1F :5'-A C CG T T G C C G A A T T T G C T T -C -3'194b pR :5'-G C A A T A C C A A C G G C A T C A -C C -3'白念珠菌总R N A 的提取 采用T r i z o l 法提取白念珠菌总R N A ,R T -P C R 扩增外排泵基因严格按照试剂盒说明书进行操作㊂P C R 反应条件:94ħ预变性3m i n ,94ħ变性10s ,55ħ退火20s ,72ħ延伸30s ,40个循环㊂收集荧光阈值(c yc l e t h r e s h o ld ,C t ),将核糖体基因18S r R N A 设定为内参基因,用相对定量әC t 表示(әC t =C t 目的基因-C t 18S )并进行分析,其中әC t 值越小,相对基因表达量越高,反之则越低,见图1及图2㊂1.3 统计学分析采用S P S S 25.0统计软件分析,计量资料均用 x ʃs 表示,采用t 检验,检验水准α=0.05,P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果2.1 E R G 11基因的检测结果实验菌株E R G 11基因P C R扩增的产物经纯图1 实验菌株R T -P C R 溶解曲线 图2 实验菌株R T -P C R 扩增曲线F i g.1 R T -P C R d i s s o l u t i o n c u r v e o f e x p e r i m e n t a l s t r a i n F i g.2 R T -P C R a m p l i f i c a t i o n c u r v e o f e x p e r i m e n t a l s t r a i n s 化并测序,测序结果与G e n B a n k 中的标准序列X 13296进行比对分析,发现氟康唑耐药的C 3号菌株第414位碱基发生了突变GңA ,但并未引起第118位氨基酸甘氨酸(G l y )密码子的改变;氟康唑耐药的C 7号菌株及对氟康唑敏感的C 12号菌株的第518位碱基发生了突变CңG ,引起第173位氨基酸密码子改变,致脯氨酸(P r o )变为精氨酸(A r g),见图3~6及表2㊂表2 白念珠菌E R G 11基因突变及对应氨基酸改变T a b .2 M u t a t i o n o f E R G 11g e n e a n d c o r r e s p o n d i n g am i n o a c i d c h a n ge s i n C a n d i d a a l b i c a n s 菌株编号碱基突变位点氨基酸变化C 3G 414A G 118G C 7C 518G P 173R C 12C 518GP 173R注:C 12为敏感菌株,C 3和C 7为耐药菌株㊂2.2 罗丹明6G 的外排情况结果显示,敏感株在摄取罗丹明6G 后,未加葡萄糖几乎不发生外排,加葡萄糖后略有外排,但二者比较差异无统计学意义(P >0.05);耐药株在摄取罗丹明6G 后,无论加葡萄糖与否均发生外㊃384㊃ 中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M yc o l ,D e c e m b e r 2023,V o l 18,N o .6图3白念珠菌E R G11基因扩增D N A凝胶电泳图图4耐药组白念珠菌C3碱基峰值图图5耐药组白念珠菌C7碱基峰值图图6敏感组白念珠菌C12碱基峰值图F i g.3 A m p l i f i e d D N A g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f C a n d i d a a l b i c a n s E R G11g e n e F i g.4 C3b a s e p e a k o f C a n d i d a a l b i c a n s i n d r u g r e s i s t a n c e g r o u p F i g.5 C7b a s e p e a k o f C a n d i d a a l b i c a n s i n d r u g r e s i s t a n c e g r o u p F i g.6 C12b a s e p e a k o f C a n d i d a a l b i c a n s i n s e n s i t i v e g r o u p排,加葡萄糖较未加葡萄糖的外排量增加,二者比较差异具有统计学意义(P<0.01);将耐药组株对罗丹明6G的外排与敏感组菌株对罗丹明6G的外排量进行分析,耐药组罗丹明6G的外排量明显高于敏感组,差异具有统计学意义(P<0.01),见表3和图7㊂表3白念珠菌耐药组与敏感组罗丹明6G外排实验结果比较T a b.3 C o m p a r i s o n o f r h o d a m i n e6G e f f l u x t e s t r e s u l t s b e t w e e nd r u g-re s i s t a n t g r o u p a n d s e n s i t i v e g r o u p of C a n d i d a a l b i c a n s分组耐药组(n=10)敏感组(n=10)t P未加葡萄糖外排能力5.47ʃ0.530.45ʃ0.2327.621<0.01加入葡萄糖后外排能力7.77ʃ0.80.44ʃ0.2527.526<0.01 t-11.6020.44P<0.01>0.052.3 R T-P C R测定外排泵基因表达水平统计学分析显示,耐药组和敏感组肌动蛋白相关基因A C T1和质膜H+-A T P酶编码基因P MA1的表达水平相比较,差异无统计学意义(P >0.05);耐药组C D R1和C D R2外排泵基因表达量较敏感组显著增高,差异有统计学意义(P<0.01),图7敏感和耐药白念珠菌罗丹明6G外排实验结果F i g.7 R e s u l t s o f r h o d a m i n e6G e f f l u x t e s t o f s e n s i t i v e a n d d r u g-r e s i s t a n t C a n d i d a a l b i c a n s见表4和图8㊂表4白念珠菌主动外排泵基因在敏感组与耐药组相对表达水平的比较(әC t值)T a b.4 C o m p a r i s o n o f r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l s o f a c t i v e e f f l u x p u m p g e n e o f C a n d i d a a l b i c a n s b e t w e e n s e n s i t i v e g r o u p a n d d r u g r e s i s t a n t g r o u p外排基因耐药组(n=10)敏感组(n=10)t PC D R16.42ʃ0.905.00ʃ0.863.589<0.01 C D R27.75ʃ1.116.30ʃ1.033.040<0.01 MD R19.74ʃ0.719.05ʃ1.141.616>0.05 A C T18.15ʃ0.318.16ʃ0.42-0.030>0.05 P MA18.04ʃ0.118.07ʃ0.14-0.612>0.05㊃484㊃中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r2023,V o l18,N o.6图8敏感和耐药白念珠菌外排泵基因的表达量F i g.8 E x p r e s s i o n o f e f f l u x p u m p g e n e i n s e n s i t i v e a n d d r u g-r e s i s t-a n t C a n d i d a a l b i c a n s3讨论全世界每年由念珠菌引起的深部器官感染病例40万以上,病死率超过45%[15],尤其白念珠菌的发病率㊁致死率明显上升㊂唑类药物中的氟康唑是临床早期经验治疗白念珠菌感染尤其作为高危人群预防白念珠菌感染的首选药物,使其在人体内长期处于亚治疗水平,引起耐药性增加[16],白念珠菌耐药是目前临床治疗其感染失败的一个重要原因,研究报道,E R G11基因错义突变可使氟康唑抗真菌的作用靶点去甲基化酶C Y P51的血红素表面结合位点发生变化,从而使氟康唑无法与白念珠菌有效结合而致耐药[17],而且白念珠菌细胞膜上的外排泵活力增强也是白念珠菌对氟康唑耐药的主要机制之一[18]㊂本研究中靶酶编码基因E R G11的目的基因扩增测序中虽然引起氨基酸的改变,即耐氟康唑的C7号菌株及对氟康唑敏感的C12号菌株的第518位碱基发生了突变,引起第173位氨基酸密码子改变,致P r o变为A r g,但耐药及敏感菌株中均存在,虽为错义突变,但该突变没有发生在E R G11点突变的105-165㊁266-287㊁405-488氨基酸之间的3个 热点 区域[19],也不是既往文献报道的Y123F㊁K143R㊁F449V和G464S等多个与白念珠菌对氟康唑耐药有关的突变位点[20],推测这个位点的突变在白念珠菌对氟康唑耐药机制中为无意义突变,但此也不能表明该机制在本地区白念珠菌耐药性的产生中无作用,可能与样本量较少有关,尚需扩大样本量进行进一步研究㊂罗丹明6G作为白念珠菌细胞膜上活性流出系统的底物,具有无毒㊁易检测㊁易吸收入射光的能量等优点,准确测量白念珠菌中罗丹明6G的积累浓度值有利于选择抗性菌株中C D R1㊁C D R2㊁MD R1等基因的过度表达㊂研究结果显示,加入荧光染料罗丹明6G后,耐药组罗丹明6G的外排量明显高于敏感组,说明白念珠菌对氟康唑耐药为主动外排系统所致㊂为排除实验环境(如菌株的生长环境和R N A的抽提等)对外排泵基因的检测结果的影响,耐药组和敏感组加入肌动蛋白相关基因A C T1和质膜H+-A T P酶编码基因P MA1,比较其表达水平,差异无统计学意义(P>0.05),说明实验环境对外排泵基因的检测结果没有影响㊂耐药组C D R1和C D R2外排泵基因表达量较敏感组显著增高,差异有统计学意义(P<0.01),由此可知影响本地区白念珠菌对氟康唑耐药机制中最为重要的是其药物外排泵基因C D R1㊁C D R2过度表达,并且耐药组耐药基因C D R1㊁C D R2相对表达量均显著高于敏感株组,与文献报道结果相似[21-22]㊂分析原因主要是,C D R1的表达受顺式作用调控元件的控制,包括一个B E E(基础表达元件)㊁一个D R E(药物敏感元件)㊁两个S R E(甾醇调控元件)和一个N R E(负调控元件),而C D R2的表达仅受D R E的控制,在这些不同的元件中,只有D R E参与必需的C D R1和C D R2的高表达和对氟康唑外排的上调相反,MD R1基因不具有D R E元件,并且MD R1启动子也不直接与氟康唑反应[21]㊂综上所述,本地区白念珠菌的耐药机制主要与外排泵基因过度表达相关,未发现靶酶编码基因有意义的突变,由于白念珠菌对氟康唑耐药现象的产生并非由于单一机制的调控,且临床很多患者存在滥用抗真菌药物的现象,导致白念珠菌对氟康唑的耐药性不断提高,而新型抗真菌药开发缓慢,改善白念珠菌对氟康唑的耐药问题迫在眉睫,因此,我们急需进一步探索白念珠菌致病机制和耐药机制,寻找新的药物治疗靶点,探索新的治疗体系,提高患者的生存率㊂参考文献[1]P F A L L E R M A,D I E K E MA D J,T U R N I D G E J D,e t a l.T w e n t y y e a r s o f t h e S E N T R Y a n t i f u n g a l s u r v e i l l a n c e p r o-g r a m:R e s u l t s f o r C a n d i d a s p e c i e s f r o m1997-2016[J].O p e n F o r u m I n f e c t D i s,2019,6(S u p p l1):S79-S94. 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茵芍平肝冲剂质量标准研究
史上最快最全的网络文档批量下载批量上传，尽在：/item.htm?id=9176907081 史上最快最全的网络文档批量下载批量上传，尽在：/item.htm?id=9176907081 茵芍平肝冲剂质量标准研究朱庄松（广东省梅州市人民医院，广东梅州 514031）摘要：目的建立茵芍平肝冲剂的质量标准。
方法采用薄层色谱法对栀子进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定芍药苷的含量。
色谱柱为Thermo ODS-2 HYPERSIL(150×46.5nm),流速为0.8ml·min-1,流动相为乙腈-水（17:83），检测波长为230nm，柱温为30℃。
结果在TLC色谱中能检出栀子。
芍药苷的线性范围为2.105～11.367μg/ml（r=1.0000，n=5），平均回收率为99.65%（RSD=0.90%，n=5）。
结论所建标准可用于该制剂的质量控制。
关键词：茵芍平肝冲剂；芍药苷；高效液相色谱法；栀子；薄层色谱法Preparation and Quality Criteria of Yinshao Pinggan Chongji Zhu zhuang-song(The People’s Hospital of Meizhou city in Guang Dong Province，Meizhou 514031，China）ABSTRACT：OBJECTIVE To establish the quality criteria for Yinshao Pinggan Chongji. METHOD Fructus Gardeniae were identified by TLC and paeoniflorin was determined by HPLC. The samples were separated on Thermo ODS-2 HYPERSIL(150×46.5nm),the mobile phase with a flow rate of 0.8ml·min-1, was acetonitrile-water（17：83），the detectionwavelength was 230nm and the column temperature was 30℃. RESULTS Fructus Gardeniae could be identified by TLC. Determination method of paeoniflorin was linear at range of 2.105~11.367µg/ml（r=1.0000，n=5），the average recovery was 99.65%（RSD=0.90%，n=5）.CONCLUSION The methods could be used for quality control of Yinshao Pinggan Chongji.KEY WORDS Yinshao Pinggan Chongji；paeoniflorin；HPLC；Fructus Gardeniae；TLC茵芍平肝冲剂是我院研制的广东省药监局批准注册的医院制剂，由茵陈、白芍、栀子等中药组成，具有清热解毒、除湿化瘀、疏肝解郁、养阴护肝等作用，用于治疗急慢性肝炎、甲乙型肝炎等。
应用TLC-CMS技术检测核桃青皮中吲哚类生物碱
1.2.3薄层色谱分离纯化 用微量进样器吸取25 “L吲哚类生物碱对照品
溶液，置于全自动点样机上，设置点样参数（点样 间距10 mm,点样宽度8 mm,点样数目4,点样量 分别为2, 4, 6,点样速度5 s/^L）,在聚酰胺薄膜上 进行点样；再吸取25 “L供试品溶液，点样20 “L。
配制甲醇：氯仿：苯：石油醚展开剂，倒入展 开缸后盖等待20 min,将点样完成的硅胶板轻轻放 入展开剂液面高2~3 mm的平卧式展开缸内，待到 展开剂前沿距离硅胶板顶端约1 cm处时，取岀晾 干。将晾干的层析板放入薄层色谱成像系统 ，在 365 nm的紫外光灯下观察层析情况，并拍照记录［"。 1.2.4红外光谱仪检测
The Indole Alkaloids in Walnut Green Husk were Detected by TLC-CMS
YANG Weimin, DU Jingqi, LU Wenjing (Provincial and Local Joint Cultivation Base， Shanxi Key Laboratory of Phytochemistry in Lvliang， Shanxi Engineering
硝苯地平缓释片(II)CTD资料
注册分类第1 页共126 页上海玉瑞生物科技（安阳）药业有限公司硝苯平缓释片（Ⅱ）申报生产资料 模块 --3.2.P.5 制剂质量控制CTD第 2 页 共 126页表 3.2.P.5.3.2-2 鉴别（二）保留时间统计表表 3.2.P.5.3.3.3.1-2 中国药典流动相（甲醇 - 水（ 60：40））实验结果注：峰纯度合格标准：纯度角度＜纯度阈值。
结论：中国药典流动相中酸破坏样品杂质Ⅰ峰、杂质Ⅱ峰纯度不合格，且杂质Ⅰ峰与前杂质峰分离度不合格。
碱破坏样品杂质Ⅰ峰纯度不合格表 3.2.P.5.3.3.3.1-3美国药典流动相（乙腈 - 甲醇 - 水（ 50：25：25））实验结果上海玉瑞生物科技（安阳）药业有限公司硝苯平缓释片（Ⅱ）申报生产资料CTD 模块--3.2.P.5 制剂质量控制注：峰纯度合格标准：纯度角度＜纯度阈值。
结论：美国药典流动相中光照破坏样品杂质Ⅰ峰纯度不合格，酸破坏样品杂质Ⅰ峰纯度不合格，且杂质Ⅰ峰与前杂质峰分离度不合格。
碱破坏样品杂质Ⅱ峰纯度不合格。
; 表3.2.P.5.3.3.3.1-4英国药典流动相（乙腈- 甲醇- 水（9：36：55））实验结果第3 页共126页上海玉瑞生物科技（安阳）药业有限公司硝苯平缓释片（Ⅱ）申报生产资料 模块 --3.2.P.5 制剂质量控制CTD第 4 页 共 126页注：峰纯度合格标准：纯度角度＜纯度阈值。
结论：各破坏样品溶液中，主峰、杂质Ⅰ、Ⅱ与前后峰分离度均符合规定，峰纯度均符合要求，但主峰保留时间达到 时间可能过长。
45分钟, 后续可能杂质洗脱上海玉瑞生物科技（安阳）药业有限公司硝苯平缓释片（Ⅱ）申报生产资料 模块 --3.2.P.5 制剂质量控制第 5 页 共 126 页CTD① 中国药典流动相改进 总流速 :1.0ml/min 流动相：甲醇 - 水（45：55）表 3.2.P.5.3.3.3.2-2中国药典流动相改进（甲醇：水 -45 ：55）注：峰纯度合格标准：纯度角度＜纯度阈值。
滨和微生物-2018年
10%乳糖
20 支 30.00
A039
尿素（脲酶）
20 支 25.00 A084
0.1%美兰牛乳
20 支 30.00
A040
七叶苷（灵）
20 支 20.00 A085
胆汁溶菌
20 支 30.00
A041
胆汁七叶苷
20 支 25.00 A086
胆汁溶菌对照
20 支 15.00
A042 β—半乳糖苷(ONPG) 20 支 30.00 A088
1%Nacl 甘露醇
20 支 15.00
A050
苯丙氨酸
20 支 20.00 A091
1%Nacl 甘露糖
20 支 15.00
A051
蕈糖(海藻糖)
20 支 25.00 A092
1%Nacl 蔗糖
20 支 15.00
-2-
细
编号
品号
规格 单价(元) 编号
品号
规格 单价(元)
菌 微
A093
1%Nacl 阿拉伯糖
20 支
15.00
A104 1%Nacl葡萄糖磷酸盐胨水 20 支
15.00 A165
麦芽糖
20 支
15.00
（四）非发酵细菌微量生化反应管专用管
A166
蔗糖
20 支
15.00
A125
侧金盏花醇
20 支
30.00 A167
棉子糖
20 支
25.00
A126
葡萄糖
20 支
15.00 A168
蕈糖(海藻糖)
葡萄糖酸盐
20 支 15.00 A208
甲基α-D吡喃葡萄糖苷（MGP）
金雀花根水提物和乙醇提取物对小鼠高尿酸血症的影响
China Pharmacy 2022V ol.33No.14中国药房2022年第33卷第14期金雀花根水提物和乙醇提取物对小鼠高尿酸血症的影响Δ赵俊杰1，2＊，张金娟3，张春雷1，朱勤凤1，廖尚高1#（1.贵州医科大学药学院，贵阳550025；2.贵州医科大学附属医院药剂科，贵阳550002；3.贵州医科大学基础医学院，贵阳550025）中图分类号R 965文献标志码A 文章编号1001-0408（2022）14-1694-06DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.14.06摘要目的探讨金雀花根水提物（WCS ）和乙醇提取物（ECS ）对小鼠高尿酸血症（HUA ）的影响。
方法将昆明种小鼠随机分为正常对照组、模型组、别嘌醇组（阳性对照，5mg/kg ）、苯溴马隆组（阳性对照，7.8mg/kg ）和WCS 低、中、高剂量组（38、75、150mg/kg ）以及ECS 低、中、高剂量组（50、100、200mg/kg ），每组10只。
除正常对照组外，其余小鼠连续7d 腹腔注射氧嗪酸钾联合灌胃次黄嘌呤建立HUA 模型。
于建模第3天，各给药组小鼠灌胃相应药物，正常对照组和模型组灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续5d 。
称定给药期间小鼠的体质量；末次给药1h 后，计算肝、肾、脾的脏器指数，测定血清尿酸（SUA ）、血尿素氮（BUN ）、血肌酐（SCR ）含量以及血清和肝组织中黄嘌呤氧化酶（XOD ）活性；检测肝组织中XOD mRNA 和蛋白的相对表达量以及肾组织中葡萄糖转运蛋白9（GLUT 9）、尿酸转运蛋白1（URAT 1）、有机阴离子转运蛋白1（OAT 1）的相对表达量；观察肾组织的病理变化。
结果各组小鼠肝脏指数和脾脏指数差异无统计学意义（P ＞0.05）。
与正常对照组比较，除别嘌醇组外的各给药组小鼠的体质量和BUN 、SCR 含量差异无统计学意义（P ＞0.05）；模型组和别嘌醇组小鼠的肾脏指数、SUA 含量均显著升高（P ＜0.05）；模型组小鼠血清和肝组织中XOD 活性、肝组织中XOD mRNA 和蛋白的相对表达量、肾组织中GLUT 9和URAT 1蛋白的相对表达量均显著升高（P ＜0.05），肾组织中OAT 1蛋白的相对表达量显著降低（P ＜0.05）。
基因工程-第9章-外源基因的表达
故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，
Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。
-35区，位于转录起始位点上游35bp处， 故称-35区，一般由10个碱基组成。一般认为， -35区是RNA聚合酶σ亚基的识别与结合位点。 当σ亚基附着在-35区后，便带动RNA聚合酶 的核心酶(core enzyme，无σ亚基的RNA聚合 酶)沿DNA链向转录起始方向滑动至Pribnow盒， 并与之接触，而一旦它们相互结合之后，σ亚
转录终止子，目的是为了稳定载体系统。因
为上游强的tac启动子控制的转录必须由强终
止子抑制，才不至于干扰与载体本身稳定性 有关的基因 表达。
2.分泌型克隆表达载体pIN Ⅲ系统
这个载体系统是以pBR322为基础构建的。
它带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即
Ipp(脂蛋白基因)启动子。ห้องสมุดไป่ตู้启动子的下游装
1. 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶
结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表 达不可缺少的重要调控序列。没有启动子， 基因就不能转录。
原核生物启动子是由两段彼此分开且又 高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成 极为重要。
Pribnow盒，位于转录起始位点上游5～
10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，
点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G／
C的区域，G／C富含区域又具有回文对称结 构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环
结构，并且具有与A/T富含区对应的一串U。
4．衰减子
衰减子(attenuator)是指在某些前导序列中 带有控制蛋白质合成速率的调节区。在原核 生物中，一条mRNA分子常常编码数种不同的 多肽链。这种多顺反子mRNA的头一条多肽链 合成的起始点，同RNA分子的5’-P末端间的距 离可达数百个核苷酸。这段位于编码区之前 的 不 转 译 的 mRNA 区 段 ， 叫 做 前 导 序 列 (1eader)。此外，在mRNA的3'-OH末端，以及 在多顺反子mRNA中含有的长达数百个碱基的 顺反子间序列(intercistranic-sequence)，即间隔 序列 (spacer)，也发现有不转译的序列。
抗宫炎软胶囊的质量标志物分析
抗宫炎软胶囊的质量标志物分析作者：袁敏艳张敏张硕曹思源季嘉城王鹏娇张荣平高秀丽来源：《中国药房》2022年第17期摘要目的分析抗宮炎软胶囊（KSC）的质量标志物（Q-marker）。
方法采用超高效液相色谱（UPLC）法，建立20批KSC的指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行相似度评价，确定共有峰;采用同一UPLC法测定去甲异波尔定、盐酸益母草碱、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、异毛蕊花糖苷的含量;通过网络药理学、分子对接方法筛选和分析KSC治疗宫颈炎的相关靶点和通路，构建“成分-靶点-通路”网络，分析其潜在Q-marker。
结果 20批KSC共有12个共有峰，相似度均大于0.99;共指认出去甲异波尔定、盐酸益母草碱、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、异毛蕊花糖苷6个共有峰。
上述6个成分的含量分别为1.336～1.774、0.093～0.143、4.970～5.888、0.505～0.623、5.206～6.226、0.785～0.895 mg/g。
网络药理学筛选得到6个成分的14个关键靶点和94条通路，其与核心靶点（蛋白激酶B1、肿瘤坏死因子）的结合能均小于-6.4 kJ/mol。
结论去甲异波尔定、盐酸益母草碱等6个成分可能是KSC的潜在Q-marker。
关键词抗宫炎软胶囊;网络药理学;指纹图谱;含量测定;质量标志物;分子对接中图分类号 R917; R284 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2022）17-2082-06DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.17.07Q-marker analysis of Kanggongyan soft capsuleYUAN Minyan ZHANG Min ZHANG Shuo CAO Siyuan JI Jiacheng WANG Pengjiao ZHANGRongping GAO Xiuli（1. State Key Laboratory of Function and Application of MedicinalPlants/School ofPharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China;2. Center for Microbiology and BiochemicalPharmaceutical Engineering， Guiyang 550025， China; 3. Experimental Animal Center， Guizhou MedicalUniversity，Guiyang 550025，China;4. School of Pharmacy，Kunming Medical University，Kunming 650500，China）ABSTRACT OBJECTIVE To analyze quality maker （Q-marker） of Kanggongyan soft capsule （KSC）. METHODS Thefingerprints of 20 batches of KSC were established by ultra high performance liquid chromatography（UPLC）method. SimilarityEvaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint（2012 edition）were used to evaluate the similarity and confirm commonpeaks. The contents of norisoboldine，leonurine hydrochloride，forsythoside B，acteoside，poliumoside and isoacteoside weredetermined by the same UPLC method. Targets and pathways related to KSC in the treatment of cervicitis were screened andanalyzed by network pharmacology and molecular docking method to construct a“component-target-pathway”network，andanalyze its potential Q-marker. RESULTS Twelve common peaks were identified in the fingerprints of 20 batches of KSC，and thesimilarity was greater than 0.99. Six common peaks were identified，including norisoboldine，leonurine hydrochloride，forsythosideB，acteoside，poliumoside and isoacteoside. The contents of the above 6 components were 1.336-1.774，0.093-0.143，4.970-5.888， 0.505-0.623，5.206-6.226 and 0.785-0.895 mg/g，respectively. By network pharmacology analysis，14 key targets and 94 pathwayswere obtained，and their binding energies to the core targets（protein kinase B1，tumor necrosis factor）were all less than -6.4kJ/cal.CONCLUSIONS Six components such as norisoboldine and leonurine hydrochloride are potential Q-marker of KSC.KEYWORDS Kanggongyan soft capsule;network pharma cology;fingerprints;content determination;quality marker;molecular docking抗宫炎软胶囊（Kanggongyan soft capsule，KSC）是由抗宫炎片更改剂型而来的中药第九类新药，包含广东紫珠、乌药、益母草 3 味中药[1]。
韩城地区煤层气成因类型及微生物开发潜力
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收稿日期：２０２２－１２－０９ 基金项目：国家自然科学基金项目（４２１７２２００，４１９７２１８３） 第一作者：郭智栋，男，山西朔州人，工程师，Ｅｍａｉｌ：ｇｕｏｚｄ＠ｐｅｔｒｏｃｈｉｎａ．ｃｏｍ．ｃｎ 通信作者：鲍园，男，江苏邳州人，博士，教授，Ｅｍａｉｌ：ｙｂａｏ＠ｆｏｘｍａｉｌ．ｃｏｍ
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第 ４３卷 第 ３期 ２０２３年 ５月
西安科技大学学报 ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＸＩ’ＡＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＳＣＩＥＮＣＥＡＮＤＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ３ Ｍａｙ２０２３
郭智栋，王玉斌，鲍园，等．韩城地区煤层气成因类型及微生物开发潜力［Ｊ］．西安科技大学学报，２０２３，４３（３）：５３９－５４８． ＧＵＯＺｈｉｄｏｎｇ，ＷＡＮＧＹｕｂｉｎ，ＢＡＯＹｕａｎ，ｅｔａｌ．ＣｏａｌｂｅｄｍｅｔｈａｎｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎＨａｎｃｈｅｎｇＢｌｏｃｋ ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＸｉ’ａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０２３，４３（３）：５３９－５４８．
基于16S rDNA和COⅠ基因序列初步探究角壳网纹溞的分类地位
基于16S rDNA和COⅠ基因序列初步探究角壳网纹溞的分类地位王文平;邓道贵;张坤;徐敏;张晓莉;刘飞【期刊名称】《生态科学》【年(卷),期】2015(034)005【摘要】在安徽升金湖中首次发现了角壳网纹溞.利用特异性分子标记,对角壳网纹溞的16S rDNA和COⅠ基因进行了PCR扩增和测序,并进行了相关的分子遗传学分析.结果表明:角壳网纹溞的16S rDNA和COⅠ基因中A+T含量均超过60％,明显高于C+G的含量.角壳网纹溞不仅在形态上与其他同属种类相差校大,在分子进化中也与其他同属种类的遗传距离相差较大.通过K-2P双参数模型计算,角壳网纹溞COⅠ基因的种间平均遗传距离高达20％,种间遗传距离的范围为16.7％-23.9％.因此,结合其形态学和分子遗传学的特征暗示角壳网纹溞的进化地位应为网纹溞属中一个相对独立的分支.【总页数】7页(P16-22)【作者】王文平;邓道贵;张坤;徐敏;张晓莉;刘飞【作者单位】淮北师范大学生命科学学院,资源植物生物学安徽省重点实验室,淮北235000;淮北师范大学生命科学学院,资源植物生物学安徽省重点实验室,淮北235000;淮北师范大学生命科学学院,资源植物生物学安徽省重点实验室,淮北235000;淮北师范大学生命科学学院,资源植物生物学安徽省重点实验室,淮北235000;淮北师范大学生命科学学院,资源植物生物学安徽省重点实验室,淮北235000;淮北师范大学生命科学学院,资源植物生物学安徽省重点实验室,淮北235000【正文语种】中文【中图分类】Q751【相关文献】1.基于16S rDNA基因序列探讨引进物种紫扇贝(Argopecten purpuratus)在海湾扇贝属(Argopecten)中的分类地位 [J], 胡丽萍;姜黎明;黄晓婷;包振民2.基于激光共聚焦扫描显微术和16S rRNA 基因序列探讨一株水华蓝藻的分类地位[J], 舒惠琳;翁笑艳;庄惠如;郑凌凌3.基于16S rDNA和COⅠ基因序列探讨四种溞类的系统关系和分类地位 [J], 徐敏;张海军;邓道贵;王文平;张晓莉;查岭生4.基于28S rDNA基因序列研究十种臂尾轮虫的系统关系和分类地位 [J], 程双怀;席贻龙;项贤领;胡好远5.基于16S rDNA序列探讨十种臂尾轮虫的系统关系和分类地位 [J], 程双怀;席贻龙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
广东省各收费站编号
关于规范非经营性路桥收费站收费许可证的通知
粤价〔2002〕91号
各市、县（区）、自治县物价局：
为进一步加强我省的路桥收费管理，配合做好非经营性路桥收费站车辆通行费实行“收支两条线”管理工作，现决定从2002年7月1日起，全省非经营性路桥收费站启用新的行政事业性收费许可证。
现将有关事项通知如下：
一、新的收费许可证由省物价局统一印制（样式见附件1），并于近期下发到市，申领、发证、年审等管理办法仍按原规定执行。
收费站悬挂的许可证牌也应按新的统一样式（样式见附件2）同步更换。
二、第一批换领新证的非经营性路桥收费站名单见附件3，请及时通知收费单位换证。
三、经营性路桥收费站继续使用现行的收费许可证。
附件：
1、非经营性路桥收费站收费许可证样式（略）
2、非经营性路桥收费站收费许可证牌样式（略）
3、第一批换领新证的非经营性路桥收费站名单
二○○二年三月二十五日第一批换领新证的非经营性路桥收费站名单。
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EPOXY PRIMER, EPOXY MID-COAT, POLYURETHANE FINISH (three coats)i (Maximum Operating Temperature 120°C/250°F)1.0 Scope1.1 This specification lists the acceptable materials and provides surface preparation and application instructions. This specification is designed for shop, field application and includesfield touch-up/repair procedures.1.1.1 When work is to be performed on site it shall be in accordance to G16S-0101-54, Job Site Painting Requirements. If this document was not issued, contact theDow Representative.1.2 When SSPC, NACE; ISO or DIN standards are referenced, the appropriate specification thatprevails in the country where the coating system is applied shall be used.1.3 Unless other requirements are included in this specification, the Painting Specifications common in the respective country (e. g. ISO 12944 in Europe) and the paint manufacturer’srecommendations shall be followed.1.4 This paint specification shall be applied to carbon steel surfaces only.2.0 Surface Preparation2.1 Prior to abrasive blasting, surfaces shall be tested for soluble salts if the environmental conditions indicate contamination could occur. Chloride levels shall be less than 30μg/cm2; ifchloride levels are greater than 30μg/cm2 surfaces shall be washed as per SS PC-SP-1 or ISO 12944.2.2 Surfaces to be coated shall be abrasive blast cleaned; cleanliness shall equal: NACE-2 Near white blastSSPC – SP 10 Near white blastISO-8501-1 Sa 2 ½ very thorough blast-cleaningISO 12944 Sa 2 ½Abrasive selected for blasting shall create a sharp angular profile (i.e.: mineral grit); abrasivewhich peen the surface (i.e. steel shot) shall not be used.Surface profile range 2.0 mil (50 microns) to 3.0 mils (75 microns). Surface profile measuredas per ASTM-4417, method C, ISO-8503-1, or DIN 4768 (R z).2.3 Surface preparation for field touch-up/repair shall be as follows:2.3.1 Well adhered coating adjacent to the area of repair shall be roughened and feathered. The feathered edge shall be approximately 1” (2.5 cm) in width.2.3.2 Field welds, non-prepared surfaces and damaged areas which display signs of corrosion shall be abrasive blasted as per 2.2. If dry abrasive blasting is notallowed, surfaces shall be vacuum blasted or wet abrasive blasted. Wet blast cleanliness shall be as per 2.2., medium flash rusting of the surface accordingISO DIS 8501-4 / SSPC –VIS 5 (I) NACE No. 9 is accepted for priming.2.3.3 Use of power tools for surface preparation is limited to areas of damaged coating less than 4 sq. ins. (25 cm²) and the surface is limited to minor surface rust.Cleanliness shall be as per SSPC-SP-11 / PMa per ISO 8501-2 / ISO 12 944Power Tool Cleaning to bare Metal; profile ranges between 0.75 mils (20microns) to 1.0 mils (25 microns). The use of power tools for other applicationsrequires SME approval.3.0 Film Thickness iiGeneralTypeSpecified Dry Film Thickness bySpray in Microns (mils)Specified Dry Film Thickness byBrush/Roll in Microns (mils)iiiEpoxy Primer 125 (5) 100 (4)Epoxy Mid-Coat 125 (5) 100 (4)Polyurethane Finish 50 (2) 50 (2)Total 300 (12) 250 (10)ivNote: Specified dry film thickness = thickness as per SSPC-PA-2 / Nominal dry film thickness (NDFT)according to ISO 12944Note on Touch-Up: All touch-up / field repairs and weld seams shall be spot primed with a surfacetolerant epoxy primer (see Tables 3 and 4),an epoxy mid coat and a polyurethane finish coat (seeTables 1 and 2). Dry film thickness shall be a minimum of 125 microns (5 mils). Application may beby brush or spray.4.0 Application4.1 The coating material shall be mixed and applied in accordance to the coating manufacturer’slatest published data sheets. These data sheets shall be present at the jobsite and shall be considered part of this specification.4.2 Coatings shall be applied by spray unless stated otherwise by the job specifications or localregulations. If spray application is not allowed, the primer shall be applied by brush, the second or third coat may be applied by brush or roller.4.3 Stripe coating is mandatory for corners, edges, welds, nuts and bolts. Stripe coating shall beperformed prior to application of the second coat; material used shall be as specified for thesecond coat and shall be applied by brush.4.4 To prevent adhesion loss between coats when performing field or shop work, the paintedsurfaces shall be checked for contamination. If contamination is detected the surfaces shallbe cleaned as per SSPC-PA-1, Solvent Cleaning / water, solvent or chemical cleaning per ISO 12 944, part 4; maximum soluble chloride level is 30 μg/cm².5.0 Quality Assurance5.1 The applicator shall perform all inspections and tests necessary to ensure surface preparation and coating application comply with the requirements of this specification. The applicator shall daily document the test results using a Quality Assurance form or the Dow Quality Assurance form when issued.5.2 Each coat shall be of the correct color, free of defects such as but not limited to pinholes,blisters, dry spray, detrimental runs and sags, excessive or inadequate film build, improper recoat times, foreign inclusions and adhesion between coats and to the substrate shall equalthe manufacturer’s limits. Defects shall be corrected prior to application of the next coat andwhen necessary a new coat shall be applied.5.2.1 Dry film thickness (NDFT) shall be as specified in Section 3 of this specification. Test procedures shall be in accordance to SSPC-PA-2, ISO-12944 and ISO-2808. Maximum allowable dry film thicknesses shall be as per material datasheets.6.0 Materials6.1 Coating and touch-up materials shall be selected from the material specifications (see Tables1 to 4).6.2 The color of the finish coat shall be as specified in the job specifications, contract documentsor G16D-0120-01.6.2.1 Each preceding coat shall be a contrasting shade with sufficient contrast to distinguish between each individual coat.6.3 When a complete system is applied by one applicator, the same coating manufacturer’sproducts shall be used for all coats. When the complete system is applied by more than oneapplicator, the initial applicator shall identify the product used by stenciling the product nameto the item painted. Subsequent coats shall be by the same manufacturer. If unmarked, contact the Dow Representative.6.3.1 Table 1: Approved materials list when ambient air or metal temperature is above 10°C/50°FManufacturer Paint Type Product ID Max TempAmercoat / PPG Primer Amerlock 400 120°C(250°F)Amercoat / PPG Mid-Coat Amerlock 400 120°C(250°F)Amercoat / PPG Finish Coat Amerlock 450H 120°C(250°F)Carboline Primer Carboguard 890 EF 120°C(250°F)Carboline Mid-Coat Carboguard 890 EF 120°C(250°F)Carboline Finish Coat Carboguard 134 HS 120°C(250°F)Devoe / International Primer Bar-Rust 231 120°C(250°F)Devoe / International Mid-Coat Bar-Rust 231 120°C(250°F)Devoe / International Finish Coat Devthane 379 120°C(250°F)Hempel Primer Hempadur Mastic 45881 120°C(250°F)Hempel Mid-Coat Hempadur Mastic 45881 120°C(250°F)Hempel Finish Coat Hempathane HS 55610 120°C(250°F)International Primer Interseal 670 HS 120°C(250°F)International Mid-Coat Interseal 670 HS 120°C(250°F)International Finish Coat Interthane 990 HS 120°C(250°F)Jotun Coatings Primer Primemastic Universal 120°C(250°F)Jotun Coatings Mid-Coat Primemastic Universal 120°C(250°F)Jotun Coatings Finish Coat Hardtop XP 120°C(250°F)Sherwin-Williams Primer Macropoxy 646 120°C(250°F)Sherwin-Williams Mid-Coat Macropoxy 646 120°C(250°F)Sherwin-Williams Finish Coat Hi-Solids Polyurethane 120°C(250°F)Sigma / PPG Primer Sigmacover 280 120°C(250°F)Sigma / PPG Mid-Coat Sigmacover 280 120°C(250°F)Sigma / PPG Finish Coat Sigmadur 550 120°C(250°F)Sika Primer Sika Poxicolor Plus 120°C(250°F)Sika Mid-Coat Sika Poxicolor Plus 120°C(250°F)Sika Finish Coat SikaCor EG5 120°C(250°F)6.3.2 Table 2: Approved materials list when ambient air or metal temperature is less than 10°C/50°F or if a faster cure is required.Manufacturer Paint Type Product ID Max TempAmercoat / PPG Primer Amerlock 2 120°C(250°F)Amercoat / PPG Mid-Coat Amerlock 2 120°C(250°F)Amercoat / PPG Finish Coat Amerlock 450 H 120°C(250°F)Carboline Primer Carboguard 890 LT 120°C(250°F)Carboline Mid-Coat Carboguard 890 LT 120°C(250°F)Carboline Finish Coat Carbothane 134 HS 120°C(250°F)Devoe / International Primer Bar-Rust 235 120°C(250°F)Devoe / International Mid-Coat Bar-Rust 235 120°C(250°F)Devoe / International Finish Coat Devthane 379 120°C(250°F)Hempel Primer Hempadur Mastic 45880 120°C(250°F)Hempel Mid-Coat Hempadur Mastic 45880 120°C(250°F)Hempel Finish Coat Hempathane HS 55610 120°C(250°F)International Primer Interseal 670HS 120°C(250°F)International Mid-Coat Interseal 670HS 120°C(250°F)International Finish Coat Interthane 990HS 120°C(250°F)Jotun Coatings Primer Primemastic Universal CC 120°C(250°F)Jotun Coatings Mid-Coat Primemastic Universal CC 120°C(250°F)Jotun Coatings Finish Coat Hardtop XP 120°C(250°F)Sherwin-Williams Primer Dura-Plate 235 120°C(250°F)Sherwin-Williams Mid-Coat Dura-Plate 235 120°C(250°F)Sherwin-Williams Finish Coat Hi-Solids Polyurethane 120°C(250°F)Sigma / International Primer Sigmacover 630 LT 120°C(250°F)Sigma / International Mid-Coat Sigmacover 630 LT 120°C(250°F)Sigma / International Finish Coat Sigmadur 550 120°C(250°F)Sika Primer Sika Poxicolor Rapid 120°C(250°F)Sika Mid-Coat Sika Poxicolor Rapid 120°C(250°F)Sika Finish Coat SikaCor EG 5 120°C(250°F6.3.3 Table 3: Approved touch-up/repair materials list when ambient air or metal temperature is above 10°C/50°F.Amercoat / PPG Touch-Up Primer/Repair Amerlock 400 AL 120°C(250°F)Carboline Touch-Up Primer/Repair Carbomastic 15 LO 120°C(250°F)Devoe / International Touch-Up Primer/Repair Bar-Rust 231 AL 120°C(250°F)Hempel Touch-Up Primer/Repair Hempadur Mastic 45880#19870120°C(250°F)International Touch-Up Primer/Repair Interplus 356 120°C(250°F)Jotun Coatings Touch-Up Primer/Repair Primemastic Universal –Aluminum Filled120°C(250°F)Sherwin-Williams Touch-Up Primer/Repair Epoxy Mastic Aluminum II 120°C(250°F) Sigma / PPG Touch-Up Primer/Repair Sigmacover 630 Aluminum 120°C(250°F)Sika Touch-Up Primer/Repair Sika Poxicolor Primer HE 120°C(250°F)NOTE: Complete specified mid coat and finish coat shall be applied over the touch up primer/repair coatas per Table 1.6.3.4 Table 4: Approved touch-up/repair materials list when ambient air or metal temperature is less than 10°C/50°.Manufacturer Paint Type Product ID Max TempAmercoat / PPG Touch-Up Cold/Repair Amerlock 2 AL 120°C(250°F)Carboline Touch-Up Cold/Repair Carbomastic 15 FC 120°C(250°F)Devoe / International Touch-Up Cold/Repair Bar-Rust 231 AL with060 Cold weather Cure120°C(250°F)Hempel Touch-Up Cold/Repair Hempadur Mastic 45880#19870120°C(250°F)International Touch-Up Cold/Repair Interplus 356 120°C(250°F)Jotun Coatings Touch-Up Cold/Repair Primemastic Universal CC –Aluminum Filled120°C(250°F)Sherwin-Williams Touch-Up Cold/Repair Epoxy Mastic Aluminum II 120°C(250°F)Sigma / PPG Touch-Up Cold/Repair Sigmacover 630 LT Aluminum 120°C(250°F)Sika Touch-Up Cold/Repair Sika Poxicolor Primer HE 120°C(250°F)NOTE: Complete specified mid coat and finish coat shall be applied over the touch up primer/repair coatas per Table 2.。