丹酚酸B的水解动力学及降解机理_郭永学

丹酚酸B的水解动力学及降解机理郭永学，张华，董悦生，修志龙*大连理工大学环境与生命学院 生物科学与工程系 大连 116024摘要：目的研究丹酚酸B的水解动力学特征和降解机理。

方法运用HPLC定量分析丹酚酸B，运用LC-MS及NMR检测丹酚酸B的水解产物，推测其降解途径。

结果丹酚酸B降解符合一级动力学特征，降解速率随缓冲盐浓度的增加，温度的升高而加快，pH-速率图是 “S”型曲线，在pH2.0时最为稳定。

1H(13C)-NMR鉴定结果表明，丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、紫草酸和紫草酸异构体Ⅰ等是丹酚酸B的降解产物。

结论得出了丹酚酸B的水解动力学特征，初步推断了丹酚酸B的降解机理。

关键词：丹酚酸B；水解；动力学；降解机理； LC/MSHydrolysis Kinetics and DegradationMechanismof Lithospermic Acid BGuo Yongxue，Zhang Hua，Dong Yuesheng，Xiu Zhilong* Department of Bioscience and Biotechnology,School of Environmental and Biological Science and Technology, Dalian University of Technology, Dalian 116024,China ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the kinetics and mechanism of degradation of lithospermic acid B(LAB) in aqueous solution. METHODS High performance liquid chromatography (HPLC), liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) were employed. RESULTS The degradation follows pseudo-first-order kinetics under all experimental conditions. The results indicated that the degradation rate increased with the increase of buffer concentration and temperature. The pH-rate profile shows a characteristic S-shape, and the maximum stability was obtained at pH 2.0. Six degradation products including danshensu, protocatechuic aldehyde, caffeic acid, savianolic acid E, lithospermic acid and its isomer I were separated and identified by 1H(13C) NMR analysis. CONCLUSION The characters of kinetics and mechanism 作者简介：郭永学，男，博士生通讯作者：修志龙，男，博士生导师 Email：zhlxiu@of degradation of LAB in aqueous solution were studied. The primary degradation pathway of LAB is proposed.KEY WORDS：Lithospermic acid B; Hydrolysis; Kinetics; Reaction mechanism; LC/MS丹参是唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根茎，是味传统中药，具有“袪瘀止痛，活血通经、清心除烦”等功效[1]。

丹酚酸B是丹参的主要水溶性成分，含量丰富（占干重的2-8%，约占丹参中总酚酸质量的54%），在抗氧化、清除自由基、保护心脑血管缺血再灌注损伤方面有较强的生物活性[2,3]。

从分子结构上看，丹酚酸B是由两分子丹参素和一个分子咖啡酸二聚体以酯键缩合而成的低聚物，在水溶液中不稳定。

王凤美[4]等在研究样品处理方法对丹酚酸B的影响时发现用微沸的水提取丹酚酸B时，其含量先增大后降低。

倪力军[4,5]等在研究加热方式对缩合酚酸影响时，发现丹酚酸B对温度很敏感，加热方式不同，提取液中丹酚酸B的含量相差1倍以上。

张军[6]等研究发现丹酚酸B不仅对温度敏感，还对pH敏感，丹酚酸B在pH2时比较稳定，在pH12时短时间内就迅速消失。

曲桂武[7]等研究了不同添加剂对水溶液中丹参酚酸B的影响，结果表明，酸性添加剂对溶液中丹酚酸B的保护作用明显好于碱性或中性添加剂,其中以抗坏血酸的保护效果最佳。

由此可知，影响丹酚酸B热稳定的因素主要是温度和pH。

但到目前为止，未见有关丹酚酸B降解规律及其降解途径的报道。

本文以物理药剂学中反应动力学和热为学为理论基础，以HPLC，LC-MS 和NMR为分析手段，系统研究了丹酚酸B在高温加速实验条件下的水解动力学特征与降解机理。

1.材料与方法1.1 主要仪器与试剂高效液相色谱仪（Agilent 1100系列）。

TSQ三级四极杆质谱仪（Finnigan ）。

半制备型高效液相色谱（岛津（SHIMADZU）LC-6AD）。

分析LC-MS （Waters2690 分离单元，Waters996 二极管阵列检测器，Waters Millennium32 色谱工作站，Finnigan TSQ三级四级杆质谱仪，Hypersil AA-ODS 色谱柱）。

核磁共振仪（Bruker 400HZ）甲醇、乙腈（色谱纯， TEDIA）。

其它试剂均为分析纯，水为Millipore制备超纯水。

丹参（河北省安国县丹参药材基地）。

丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B标准品（含量均不低于98.5%，中国药品生物制品检定所）。

1.2 HPLC分析方法色谱柱Hypersil AA-ODS C8 (150mm×4.6mm, 5µm)；柱温箱温度：30o C；检测波长为288 nm；洗脱流速为1.0 mL/min；进样量是10µL；流动相由A：1%(v/v)，醋酸水溶液和B：乙腈-甲醇(3:2, v/v)组成，梯度洗脱程序见表1。

1.3 HPLC-ESI/MS分析方法色谱条件同上，ESI离子源m/z扫描范围为120~1200；扫描周期是1s；离子喷雾电压选择4.5KV；毛细管温度是325℃；夹套气（N2）流量为40psi；辅助气（N2）流速是20Arbitary units；检测方式选择负离子检测。

1.4 丹酚酸B水解过程以丹参制取含量为70%的丹酚酸B样品，称样品 100mg，用pH2.0的去离子水定容于10mL的容量瓶中，保存在4℃冰箱中。

每次实验时，取40µl加入到装有960µL相应缓冲溶液的反应器中，密封， 90±0.5℃的恒温加热。

根据预反应结果，当反应物浓度下降为原浓度约10%时，取出40µL，迅速冷却以中止反应，冰中保存，在6h内进样10µL分析。

1.5离子强度对反应速率的影响根据碰撞理论，凡在溶液中进行的反应会受到离子强度的影响。

为了排除由于离子强度不同给反应速率造成的影响，用NaCl调节离子强度到0.5M。

1.6 pH和缓冲盐对反应速率的影响为了维持相对稳定的pH，水解实验是在缓冲溶液中进行的。

实验中选择了醋酸盐和磷酸盐缓冲溶液，在pH 0.4-1.27用HCl-NaCl；pH 2-3.0用H3PO4-NaH2PO4；pH 3.5-5.5用HAC-NaAC； pH 6.0-7.0用 Na2HPO4-NaH2PO4。

为了正确判断pH对丹酚酸B降解速率的影响，首先要排除缓冲盐的影响。

在每个pH下，测定三个缓冲盐浓度（0.048，0.096，0.192M）下的速率常数。

1.7温度对反应速率的影响实验中其它条件保持一定的情况下，在pH 0.93和2.0两点考察了温度影响，为了保证用Arrhenius方程外推的正确性，实验中选择的温度范围比较宽，包括50、60、70、80和90℃。

2. 结果与分析2.1 丹酚酸B 的水解对于一级反应，有以下特征： t k C C obs t −=0ln 或)ln(10t obs C C t k = （1） 其中，C 0,C t 分别是反应起始时刻与t 时刻的反应物浓度，t 为反应时间，k obs 为反应速率常数。

丹酚酸B 的浓度总是随着水解时间呈指数性下降，呈现出一级反应的特征。

从丹酚酸B 的起始浓度C 0和t 时刻的浓度C t 可以算出丹酚酸B 的降解速率常数k obs ，一级反应的另一重要特征是速率常数的量纲为（时间）-1。

对丹酚酸B 降解实验的所有数据用公式1进行拟合，发现丹酚酸B 的浓度剩余率的自然对数ln(C t /C 0)和时间存在良好的线性关系，相关系数均大于0.95。

部分一级动力曲线见图2。

从图2可知，在浓度为0.05mol/L 的缓冲盐溶液中，丹酚酸B 在不同pH 下的降解均符合一级动力学特征。

2.2缓冲盐浓度对反应速率的影响丹酚酸B 的降解速率随缓冲盐浓度的变化情况见图3。

从图3可知，无论在磷酸缓冲溶液中(Fig.3a)，还是在醋酸缓冲溶液中(Fig.3b)，反应速率常数k obs 均随着缓冲盐的浓度增大而增大。

2.3 pH 对反应速率的影响对于一个液体制剂而言，pH 是影响药物降解速率的重要因素之一，也是药物稳定性研究中关注较多的一个参数。

这类反应的反应速率常数可用以下公式来表示：k obs =k P H +k b [B] （2）其中，常数k obs 是丹酚酸B 降解的表观速率常数，k p H 是特殊酸碱催化速率常数，k b 是一般催化剂的催化速率常数由公式2可知，对于一个pH 确定的反应，图3的曲线外推至缓冲盐浓度为零时，就得到了排除缓冲盐影响的速率常数k pH ，它表示反应只受特殊酸碱催化的速率常数。

将一系列外推得到的速率常的log k pH 对pH 绘图，就得到了消除缓冲盐影响的pH-速率曲线图4。

从图4可知，丹酚酸B 的降解pH-速率曲线符合药剂稳定性研究中常见的“S”型曲线，而且在pH 4.5-6.0之间有一个“拐”点，在pH 2.0时，丹酚酸B 最为稳定，而当pH<1.0时，丹酚酸B 的降解速率随着pH 的减少呈线性递增，这种趋势说明H +在反应中起主导作用；PH>2.0时，随着pH 的增加，丹酚酸B 的降解速率明显加快，表明碱催化成为主要因素。