SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解
聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超
Βιβλιοθήκη Baidu
过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。
7、染色与脱色 电泳结束后，取下玻板，在自来水下用特制板撬开 短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧 溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入 染色液染色 60 mins ，再用脱色液脱色，直至蛋白质区 带清晰，即可计算相对迁移率。
8、 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离 (cm) 以及各蛋白质样品 区带中心与加样端的距离 (cm) ，按下式计算相对迁移率 mR ：
颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具 有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者
佳。
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的 样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它 可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二 级和三级结构。
CH2=CH
丙烯酰胺
C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH C=O NH2 C=O NH CH2 NH C=O C=O NH2
CH2-CH ( CH2-CH )nCH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH
PAGE
聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂
甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过 硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此 凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的双 重作用。
CH2=CH
C=O NH2
SDS－PAGE测定蛋白质
相对分子质量
【目的要求】 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量及染色鉴 定。
【实验原理】
电泳
带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的
现象。在一定的电场强度下，分子在凝胶介质中的迁移速率取决 于分子的大小、构型和带电量的大小。
后，除去覆盖的蒸馏水。
2）浓缩胶的制备 配制5% 浓缩胶。在烧杯中依次加入重蒸水2.92ml,浓缩胶 缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml, 凝胶储备液 0.8ml ， 10% 过硫酸铵 25ul 和 TEMED 10ul 。由于 AP 和 TEMED 相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用 移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，灌满后小心
【操作方法】
１、制胶玻板的清洗 用海绵和洗涤剂轻柔地清洗，严禁使用刷子和颗粒状的 去污粉与洗衣粉，完全冲洗干净后烘干。
【操作方法】
2、垂直板电泳槽
3、凝胶的制备
1）分离胶的制备 配制12%分离胶。在烧杯中依次加入重蒸水3.35ml,分离胶缓冲液 （ 1.5mol/L Tris-HCl,pH8.8 ） 2.5ml,10%SDS 0.1ml, 凝 胶 储 备 液 4.0ml，10% 过硫酸铵50ul和TEMED 10ul。由于AP和TEMED相遇后凝胶 即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、 短玻璃板间的窄缝内，留出梳齿的齿高加 1cm 的空间停止灌胶，小心 覆盖一层蒸馏水，37℃烘箱下聚合（约30 min）。待分离胶聚合完全
2）样液的准备
用移液枪小心吸取处理好的血清50ul至1.5ml
的离心管中，再加入50ul上样缓冲液，混匀后
沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。
5、加样 用移液器分别取5 l样品液，小心将样品加 到凝胶凹形样品槽底部。 6、电泳 将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接， 打开电泳仪开关，设置电压为200V，电泳 60mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电 泳，关闭电源。
当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时， 蛋 白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对 数呈线性关系：
lgMW = K - bm
将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE 中的电泳 迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲
线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的
电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。
相对迁移率mR= 蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
【思考题】
1、在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴
酚兰的作用分别是什么？
2、在SDS-PAGE中,分离胶中的TEMED和AP的作用
是什么?
3、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟 ?
Staking gel
Separating gel
C=O NH2 C=O NH2
聚丙烯酰胺
PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变
Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。
PAGE 分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电 泳体系中缓冲液 pH 值与凝胶中的相同 . 带电颗粒在电场
作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电
插入梳齿，避免混入气泡，37℃烘箱下聚合（约30 min）。
4、蛋白质样品的处理
1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白 牛碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶 开封后，沸水浴中加热3-5min后上样。
MW=97,400 MW=66,200 MW=31,000 MW=20,100 MW=14,400
聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超
Βιβλιοθήκη Baidu
过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。
7、染色与脱色 电泳结束后，取下玻板，在自来水下用特制板撬开 短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧 溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入 染色液染色 60 mins ，再用脱色液脱色，直至蛋白质区 带清晰，即可计算相对迁移率。
8、 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离 (cm) 以及各蛋白质样品 区带中心与加样端的距离 (cm) ，按下式计算相对迁移率 mR ：
颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具 有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者
佳。
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的 样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它 可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二 级和三级结构。
CH2=CH
丙烯酰胺
C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH C=O NH2 C=O NH CH2 NH C=O C=O NH2
CH2-CH ( CH2-CH )nCH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH
PAGE
聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂
甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过 硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此 凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的双 重作用。
CH2=CH
C=O NH2
SDS－PAGE测定蛋白质
相对分子质量
【目的要求】 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量及染色鉴 定。
【实验原理】
电泳
带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的
现象。在一定的电场强度下，分子在凝胶介质中的迁移速率取决 于分子的大小、构型和带电量的大小。
后，除去覆盖的蒸馏水。
2）浓缩胶的制备 配制5% 浓缩胶。在烧杯中依次加入重蒸水2.92ml,浓缩胶 缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml, 凝胶储备液 0.8ml ， 10% 过硫酸铵 25ul 和 TEMED 10ul 。由于 AP 和 TEMED 相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用 移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，灌满后小心
【操作方法】
１、制胶玻板的清洗 用海绵和洗涤剂轻柔地清洗，严禁使用刷子和颗粒状的 去污粉与洗衣粉，完全冲洗干净后烘干。
【操作方法】
2、垂直板电泳槽
3、凝胶的制备
1）分离胶的制备 配制12%分离胶。在烧杯中依次加入重蒸水3.35ml,分离胶缓冲液 （ 1.5mol/L Tris-HCl,pH8.8 ） 2.5ml,10%SDS 0.1ml, 凝 胶 储 备 液 4.0ml，10% 过硫酸铵50ul和TEMED 10ul。由于AP和TEMED相遇后凝胶 即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、 短玻璃板间的窄缝内，留出梳齿的齿高加 1cm 的空间停止灌胶，小心 覆盖一层蒸馏水，37℃烘箱下聚合（约30 min）。待分离胶聚合完全
2）样液的准备
用移液枪小心吸取处理好的血清50ul至1.5ml
的离心管中，再加入50ul上样缓冲液，混匀后
沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。
5、加样 用移液器分别取5 l样品液，小心将样品加 到凝胶凹形样品槽底部。 6、电泳 将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接， 打开电泳仪开关，设置电压为200V，电泳 60mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电 泳，关闭电源。
当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时， 蛋 白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对 数呈线性关系：
lgMW = K - bm
将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE 中的电泳 迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲
线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的
电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。
相对迁移率mR= 蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
【思考题】
1、在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴
酚兰的作用分别是什么？
2、在SDS-PAGE中,分离胶中的TEMED和AP的作用
是什么?
3、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟 ?
Staking gel
Separating gel
C=O NH2 C=O NH2
聚丙烯酰胺
PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变
Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。
PAGE 分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电 泳体系中缓冲液 pH 值与凝胶中的相同 . 带电颗粒在电场
作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电
插入梳齿，避免混入气泡，37℃烘箱下聚合（约30 min）。
4、蛋白质样品的处理
1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白 牛碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶 开封后，沸水浴中加热3-5min后上样。
MW=97,400 MW=66,200 MW=31,000 MW=20,100 MW=14,400