铁皮石斛茎尖诱导原球茎再生体系的研究
内生真菌MF24对铁皮石斛原球茎诱导作用及石斛的化学成分和活性研究
内生真菌MF24对铁皮石斛原球茎诱导作用及石斛的化学成分和活性研究铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.）是兰科石斛属草本植物，是药典收录的五种石斛之一，也是最为珍稀名贵的石斛植物。
由于自然繁殖率低，人工栽培技术不成熟，铁皮石斛野生资源已濒临枯竭。
本文以快速繁殖的铁皮石斛胚性组织原球茎为材料，根据兰科植物与真菌共生的生理特点，选取野生铁皮石斛的内生真菌小菇属（Mycena sp.）真菌（MF24）对液体培养的原球茎进行诱导作用，进行了较系统的研究，以期改善原球茎的药用质量而使其成为铁皮石斛的药用新资源。
此外，本文对铁皮石斛原球茎、金钗石斛（D.nobile Lindl.）、长距石斛（D.longicornu Lindl.）的化学成分和药理活性进行了研究，丰富石斛属植物的药用和开发研究。
一、促淋巴细胞增殖、自由基清除实验结果显示MF24真菌诱导子对铁皮石斛原球茎的药理活性有提高作用。
真菌诱导子处理的原球茎甲醇提取物（100μg／ml）对小鼠B淋巴细胞转化有促进作用，增殖率是9.36％，而对照原球茎没有这一活性，野生铁皮石斛强烈抑制B淋巴细胞转化。
与对照原球茎相比，真菌诱导子处理能使原球茎甲醇提取物促T淋巴细胞转化的活性提高84.8％。
10μg／ml剂量时，对照原球茎、真菌诱导子处理的原球茎、野生铁皮石斛的甲醇提取物的超氧阴离子清除率分别是24.48％、30.14％、12.72％；50％甲醇提取物清除率分别是31.95％、36.67％、18.46％。
二、通过对原球茎的化学成分研究以及它们的含量比较显示，MF24真菌诱导子对铁皮石斛原球茎的苯丙烷类和酚类化学成分含量有提高作用。
首次对悬浮培养的铁皮石斛原球茎的化学成分进行了研究。
共分离鉴定了16个化合物（TP1～TP16），其中1-O-p-香豆酰基-8-D-P比喃葡萄糖苷（TP1）、1-O-p-阿魏酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷（TP2）在10<sup>-7</sup>mol/L时都具有极显著的超氧阴离子清除活性，清除率分别是33.08％和84.31％。
铁皮石斛原球茎对诱导子诱导的生理响应机制研究
铁皮石斛原球茎对诱导子诱导的生理响应机制研究本文主要研究了草酸和铁皮石斛内生菌诱导子对铁皮石斛原球茎的生理影响,通过测定铁皮石斛原球茎的生长量、细胞活力、POD活性、可溶性蛋白含量、叶绿素含量和多糖含量的变化,分析铁皮石斛原球茎对不同诱导子诱导的生理响应,以期能够为植物抗逆性的研究提供理论基础。
结论如下：1.草酸诱导原球茎悬浮培养21～28 d,原球茎生长量均高于对照组,其中草酸终浓度为005 mmol/L 时,增长量达到59.28%,且继续上升。
2.草酸终浓度为0.05、0.1 mmol/L的悬浮培养原球茎,21d以后细胞活力均有明显上升的趋势,其中草酸终浓度为0.1 mmol/L的原球茎细胞活力较高,为3.52μg/(g·h)。
3.当原球茎振荡培养21d时,添加不同浓度草酸的原球茎可溶性蛋白含量均比对照组高。
其中草酸终浓度为0.1 mmol/L的原球茎可溶性蛋白含量为0.681 mg/g,可溶性蛋白含量依次为0.1、0.5、1、0.05、0 mmol/L的草酸终浓度诱导的原球茎。
4.添加草酸的原球茎叶绿素含量有少许提高,但不明显。
当草酸诱导原球茎21 d,原球茎叶绿素含量均较高,草酸终浓度为0.05、0.1、1 mmol/L差别不大,含量相对较高,草酸终浓度为0.05 mmol/L的诱导原球茎叶绿素含量为0.523 mg/g。
5.草酸终浓度为0.05 mmol/L时,铁皮石斛原球茎的多糖含量无明显变化,草酸诱导21d时含量很高,多糖含量为35.43%,与对照组相比提高了1倍。
6.在草酸诱导的铁皮石斛原球茎固体培养中,当培养基中草酸终浓度为0、0.05、0.1mmol/L时,原球茎生长状态良好,草酸终浓度为0.1 mmol/L时,原球茎能够逐渐生长成为完整的植株。
7.草酸终浓度为0.05 mmol/L,原球茎悬浮培养21～28 d,原球茎已适应草酸诱导,能够较好生长；且原球茎的生长量较高,持续,多糖含量一直处于较高的稳定状态。
铁皮石斛原球茎多糖的诱导、提纯、理化性质及生物活性研究
铁皮石斛原球茎多糖的诱导、提纯、理化性质及生物活性研究多糖是石斛的主要药用成分。
现代药理学研究表明，石斛多糖具有延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤、降血糖等多种药理活性。
铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall．ex Lindl）是石斛中的极品，具有益胃生津、滋阴清热、润肺止咳的功效。
近年来，由于过度消耗，石斛野生资源已濒临绝迹。
由此，提出铁皮石斛胚性组织原球茎（protocorm）替代其原植株成为药源的可能性。
但迄今有关铁皮石斛原球茎多糖的研究尚未见报道。
本研究旨在优化铁皮石斛原球茎生长和多糖积累的培养条件，了解铁皮石斛原球茎多糖的理化性质和生物活性。
研究结果如下：1．铁皮石斛原球茎悬浮培养诱导高含量多糖的研究（1）铁皮石斛原球茎生长、多糖积累以及营养物消耗的动态变化为筛选适合铁皮石斛原球茎的最佳培养方式，对比了固体培养和液体悬浮培养这两种培养方式，并研究了液体悬浮培养基质的营养消耗趋势，同时分析了液体培养液中pH值和电导率的变化。
结果表明：原球茎在固体培养条件下，培养60d后干重达到最大为13.40g／L，多糖产量最大值为2412.5mg／L，在液体悬浮培养条件下，干重需要50d达到最大为17.64g／L，多糖产量最大值为3081.2mg／L，液体悬浮培养在干重量、多糖含量和多糖产量等方面优于固体培养。
在70d的周期内，悬浮培养原球茎以近“S”型曲线生长；原球茎在培养初期生长较缓慢，培养10d后原球茎生长进入快速生长期，原球茎干重量在第50d有最大值（17.64g／L），随后下降，60d后原球茎开始衰亡。
多糖的积累与原球茎生长有一定的相关性，多糖含量从10d起开始逐步增长，30d达到最大（213.5mg／g·DW），而后迅速降低。
在悬浮培养过程中，糖和磷的消耗速度较快，铵态氮优于硝态氮被吸收利用；pH值在培养前10d快速下降，随后又逐渐回升；在指数生长期，培养基中电导率降低与原球茎干重量增加之间有线性负相关性。
铁皮石斛组织培养及试管苗营养器官和原球茎的结构观察
9期
张启香, 等: 铁皮石斛组织培养及试管苗营养器官和原球茎的结构观察
17 63
2. 1. 3 幼苗的生根 将有 4～5 片叶的幼苗切下, 接种于生根培养基中. 生根培养基以高盐的 MS 较 为适宜. 而盐分较低且适于诱导 PL Bs 的 1/ 2 M S 培
明显的 9 号培养基的生根率为 0, 说明铁皮石斛生 根需有较低浓度的 N AA, 而 9 号培养基中 NAA 的 浓度为 0. 此外, VW 培养基对铁皮石斛生根无明显
2. 1. 2 原球茎增殖 在诱导出原球茎之后, 在 12 材料褐化对培养造成的不利影响[ 8] , 而且能大大增 号培养基基础上补加 200 g·L - 1进行继代培养. 在 加原球茎的增殖系数, 一个月后能达到 12～20 倍; 培养过程中加上一定量的土豆汁后, 能有效地抑制 且原球茎比未加土豆汁的更健壮, 萌发率更高.
原球茎增殖率, 为铁皮石斛的快速繁殖和试管苗移 号和 9 号培养基高达 200% ( 表 1) , PL Bs 的诱导率
栽提供形态学依据.
也表现出较好的效果, 9 号培养基诱导率达到 15% ,
1 材料和方法
与其它处理差异显著. 而以 MS、VW 为基本培养基 时无 PL Bs 产生, 芽增殖系数多数小于 150% , 且整
(mБайду номын сангаасg·L- 1)
BA
KT
NAA
水解乳蛋白 LH
( g·L - 1)
PLBs 诱导率 In duct ion rate of PLBs( % )
芽增殖率
Indu ct ion rate of
bu ds( % )
幼苗长势
V igour of s eedlings
铁皮石斛原球茎组织培养研究进展
一••琴••零••零••琴••琴■■琴丨••琴丨■■琴••琴丨■■琴••琴••零••琴••琴丨■■琴••琴丨■■琴••琴••零••琴••琴••琴••琴••零••零■•零■•零■•零■•琴■•琴■•琴f文章编号：1002-0659 (2018) 02-0036-05I|铁皮石斛原球茎组织培养研究进展i专题综述t张鑫!(天津创世生态景观建设股份有限公司，天津南开300000)摘要：铁皮石斛是我国传统的名贵中药材，具有很高的药用价值，其所含的主要成分为石斛多糖和生 物碱。
由于长期的采挖，自然资源日益枯竭，现阶段铁皮石斛的种苗主要通过组织培养方法获得，但 在培养过程中存在诸多问题如出苗的成本过高，幼苗移栽成活率低，工厂化生产效率低等。
鉴于以上 问题，对于铁皮石斛原球茎的研究日益广泛，原球茎中含有同石斛苗相同的药用成分，通过大规模培 养来提取，同样可以满足药材市场对石斛的需求。
本文通过对相关文献的查阅，阐述了有关铁皮石斛 原球茎的组织培养方面的研究概况。
关键词：铁皮石斛；原球组织培养；多糖中图分类号：S682.1+9 文献标识码：A铁皮石斛（■O e/zdraW M m q^dna/e Kimura et Migo)是兰科（Orchidaceae)石斜属（Dendrobium)多年生附生草本植物，因其老基外呈黑色，又名为黑节草，是名贵中药，居“中华九大仙草”之首，所含的主要成分为石斛多糖及生物碱，另外，还 有酚类、菲类、芪类、倍半萜类及香豆素等。
现 代药理研究证明石斛多糖具有抗肿瘤、增强免疫 力的功能。
但由于铁皮石斛生长环境特殊，以及 长期采挖，自然资源日趋枯竭，已被国家列为重 点保护的野生药材。
从20世纪中期开始就有关 于铁皮石斛的研究，主要涉及组织培养方法、有 效成分含量和药理作用方面的研究。
随着研究的 深人，发现铁皮石斛在组织快繁过程中存在一些 问题，例如通过组培生产出苗的成本过高，幼苗 移栽成活率低，工厂化生产效率低。
黑节铁皮石斛原球茎诱导_再分化以及腋芽萌发和生根的初步研究
第30卷第6期2010年12月 上饶师范学院学报J OURNAL O F SHANGR AO NOR MAL UNIVERSITY Vol 30,No 6Dec 2010收稿日期:2009-12-14基金项目:2009年江西省高校省级教改立项项目(编号:J XJG-09-16-10);上饶师范学院校级教改课题(SR1018)作者简介:李丹(1988-),女,生命科学系06生物科学(1)本科在读学生,研究方向为植物组织培养。
黑节铁皮石斛原球茎诱导、再分化以及腋芽萌发和生根的初步研究李 丹,王馨彩,尹明华(上饶师范学院,江西上饶334001)摘 要:对黑节铁皮石斛的原球茎诱导、再分化以及腋芽萌发和生根进行了初步的研究,以期为黑节铁皮石斛的人工繁殖提供理论指导。
采用植物组织培养和单因子试验的方法,获得了黑节铁皮石斛带芽茎段最佳的消毒方式为70%酒精处理30s 后再用0.1%HgCl 2处理20min 。
黑节铁皮石斛带芽茎段原球茎诱导的最佳培养基为MS+KT1mg/L +NAA0.1mg/L 。
黑节铁皮石斛带芽茎段原球茎再分化的最佳培养基为MS+KT2mg /L+NAA0.5mg/L 。
黑节铁皮石斛带芽茎段腋芽萌发的最佳培养基为MS+KT 2mg/L+NAA0.5mg/L 。
黑节铁皮石斛带芽茎段生根的最佳培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L 。
这些实验结果为黑节铁皮石斛试管苗的工厂化生产奠定了技术基础。
关键词:黑节铁皮石斛;原球茎;腋芽;生根中图分类号:S567.23.9 文献标识码:A 文章编号:1004-2237(2010)06-0073-06DOI:10.3969/j.issn.1004-2237.2010.06.015铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.)为兰科石斛属植物,不仅是中国的特有种,也是传统的名贵中药材[1]。
石斛的主要药用成分为石斛多糖和石斛碱[2],具有养阴生津、润肺明目、抗癌防老等功效[3]。
铁皮石斛茎段原球茎的诱导、分化与植株再生
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． １ ９ ３ ０ ３ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ８ — ０ ３ ８ ４ ． ２ ０ １ ６ ． １ ０ ． ０ １ ４
林 江 波 ，王 伟 英 ，李 海 明 ，等 ． 铁 皮 石 斛 茎 段 原 球 茎 的 诱 导 、分 化 与 植 株 再 生 Ｃ Ｊ ７ ． 福 建 农 业 学 报 ，２ ０ １ ６ ，３ １（ １ ０ ） ：１ ０ ７ ５ —１ ０ ７ ９ ．
Ｆｕ ｊ ｉ ａ ｎ ３ ６ ３ ０ ０ ５．Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｔｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｎ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ａ ｎ ｄ ｒ ａ ｐ ｉ ｄ ｐ ｒ ｏ ｐ ａ ｇ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ Ｄｅ ｎ ｄｒ ｏ ｂ ｉ ｕ ｍ ｏ ｆ ｆ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｅ ，ｓ ｔ ｅ ｒ ｉ ｌ ｅ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｕ ｔ ｔ ｉ ｎ ｇ ｓ
ｆ ｒ ｏ ｍ ｔ ｈ ｅ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｗｅ ｒ ｅ ｕ ｓ ｅ ｄ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｓ ｆ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ． Ｅｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｓ ｏ ｆ ｃ ｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｄ ｉ ａ ，ｇ ｒ ｏ ｗｔ ｈ ｒ ｅ ｇ ｕ ｌ ａ ｔ ｏ ｒ ｓ ，ｓ ｕ ｃ ｒ ｏ ｓ ｅ
黑节铁皮石斛原球茎诱导、再分化以及腋芽萌发和生根的初步研究
ｌ 材料与方法
１１ 材 料 ： ．
黑节铁皮石斛（ 上饶县翰海生态综合开发有限公司温室大棚种植基地提供 ） 。
１２ 方 法 ．
收 稿 日期 ＂０９—１ —１ ２０ ２ ４
基金项 目：Ｏ９年江西省高校 省级教改立项项 目（ ２Ｏ 编号 ：பைடு நூலகம்Ｊ Ｊ Ｇ一０ ６—１ ）上饶师范学院校级教 改课题 （Ｒ ０８ Ｘ ９—１ ０ ； Ｓ １１）
式为 ７ ％酒精 处理 ３ｓ ０ ０ 后再用 ０ ％Ｈ Ｃ ．１ ｇ Ｉ ２处理 ２ ｍｎ ０ ｉ。黑节铁皮石 斛带芽茎段原球 茎诱 导的最佳培养基 为 Ｍ ＋ ｓ
Ｋ ｎ Ｌ＋Ｎ Ａ ．ｍ ／ 。黑 节铁皮石斛带 芽茎段 原球 茎再分 化的最佳培养基 为 Ｍ ＋Ｋ ２ ｇＬ Ａ ０５ ＴＩｗ＇ Ａ ０ １ ｇ Ｌ ｓ Ｔ ｍ ／ ＋Ｎ Ａ ．ｎ 培养基 为 １２ ＋ Ｎ Ａ ．ｍ／ 。这些 实验结果为 黑节铁皮石斛试管苗的工厂化生产 奠定 了技术基础 。 ／ＭＳ Ａ ０５ ｇ Ｌ
ＤＯ ：０ ３６／．ｓ ．０４ ２７２ １ ．６ ０５ Ｉ１ ．９９ｊｉ ｎ １０ —２３ ．０ Ｏ０ ．１ ｓ
铁皮 石斛 （Ｄ ｎｒｂｕ ｎ ｉ ｍ Ｗａ ． ｘＬｎ１） ｅｄｏｉｍｃ ｄｄ ｌ ｅ ｉｄ．为兰 科石斛 属植 物 ， 仅 是 中国 的特有 种 ， ａ ｕ １ 不 也是传 统 的 名 贵 中药 材… 。石 斛的主要 药用成 分 为石斛 多糖 和石 斛碱 ］具有 养 阴生津 、 ， 润肺 明 目、 抗癌 防老 等功效［ 引。 铁 皮石斛 在我 国仅分 布于南 方诸省 （ 江 、 西 、 建 、 浙 广 福 贵州 、 南 、 南 、 徽等 地 ） 原始 森林 ， 云 河 安 的 主要生 长 在 山谷 半 阴湿 的岩 石上 ， 要求 的生态环 境 比较特 殊 ， 自然 繁殖 率极 低 Ｊ加 上人 们 无休 止 地采 挖 以及 自然 生境 ， 的不 断丧失 ， 野生 铁皮石 斛愈来 愈稀 少 ， 因此对 其繁 殖 方法 进行 研究 显 得 十分 必要 。利 用组 织 培 养技 术 ， 对 药用铁 皮石 斛进行 快速 繁殖 ， 目前 解决生 产 种苗 问题 的有 效方 法 。黑节 铁 皮石 斛 是 由野 生铁 皮石 斛培 育 是
铁皮石斛体细胞胚胎发生研究
铁皮石斛体细胞胚胎发生研究本文以铁皮石斛原球茎为材料，在愈伤组织诱导及植株再生、体细胞胚胎发生的形态学过程、体胚发生过程中同工酶的变化以及体胚发生过程中的基因表达四个方面进行了研究，主要实验结果如下：1．以已分化出两片幼叶的原球茎为外植体，建立了通过愈伤组织的植株再生体系，探讨了不同外源激素对外植体出愈及愈伤组织分化的影响。
将外植体培养在附加2.0 mg l<sup>-1</sup>6-BA的1／2MS培养基上出愈率可达82％，继代2次后的愈伤组织在不添加外源激素的1／2MS基本培养基上能够很好地实现类原球茎再生，当类原球茎进一步培养在添加0.2 mg l<sup>-1</sup>NAA的1／2MS培养基上可发育形成幼苗，将再生植株炼苗后移栽到蛭石中，成活率可达95％。
2．通过石蜡切片技术，以处于不同分化阶段的愈伤组织为材料，研究了体细胞胚胎发生的细胞学过程。
结果表明体胚既可起源于愈伤组织的表层，又可起源于愈伤组织内层的单个胚性细胞。
内起源体胚的早期胚胎发生过程与铁皮石斛体内胚胎发育过程相一致，主要经单细胞胚、二细胞胚、四细胞胚、五细胞胚以及球形胚；球形胚以后的发育过程与铁皮石斛种子体外萌发所经历的过程相一致，主要经球形胚、心形原球茎、子叶原球茎直至成苗。
3．在上述实验体系之上，以不同发育时期含体胚的愈伤组织为材料，进行了过氧化物酶、过氧化氢酶、细胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶、酶酯、苹果酸脱氢酶、淀粉酶、乙醇脱氢酶的同工酶及过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶三种抗氧化酶的活性研究，结果表明这些酶在体胚发生过程中呈现一定的规律性变化，酯酶、细胞色素氧化酶、乙醇脱氢酶同工酶在心形原球茎期都出现新的特异性条带，而苹果酸脱氢酶同工酶中的一条酶带在心形原球茎时期消失；三种抗氧化酶活性都在单细胞体胚发生时期达到峰值。
4．在铁皮石斛体胚发生基础之上，用RT-PCR技术在体胚发生过程中检测到与胚胎发育相关的TIM和CUC基因，通过3’-RACE和5’-RACE获得了TIM和CUC mRNA序列，并初步对TIM和CUC进行了序列分析。
铁皮石斛不定芽诱导与增殖技术研究
铁皮石斛不定芽诱导与增殖技术研究铁皮石斛不定芽诱导与增殖技术研究[ 作者：刘健，张玲菊，沈岚，王芳，朱宏芬，张国芳，黄坚，严成其转贴自：本站原创更新时间：2012-5-21 9:57:17 点击数：747 ] 2012年第一期摘要：以铁皮石斛茎节段为外植体，研究不同浓度的外源激素配比对铁皮石斛诱导和增殖的影响。
实验表明，不定芽诱导最佳诱导培养基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，最佳增殖培养基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+10%椰子汁。
关键词:铁皮石斛;不空等;诱导;增值铁皮石斛（Dendrobium officinale）又名黑节草，属气生兰科草本植物。
其所含主要成分石斛多糖和石斛碱，具有滋阴、益胃、生津止渴、润肺止咳、强壮及增强免疫活性的作用[4]，为南亚和东南亚地区著名的中草药[5]。
在我国主要分布于江西、广西、广东、贵州、云南、安徽、浙江、湖南、陕西、河南、福建等地[1-3]，多分布于海拔近千米的山地半阴湿岩石上，一般均能耐-5℃的低温[4]。
在野生状态下，铁皮石斛繁殖速率低下、生长缓慢，加之掠夺性采挖，使其野生资源日益减少，远远不能满足国内外市场经济发展和临床医学的需要，因此铁皮石斛人工种植的规模迅速扩大[6-7]。
常规条件下，铁皮石斛人工繁殖较困难，组织培养技术在铁皮石斛生产中得到广泛应用。
本实验以铁皮石斛茎段为外植体，并直接从茎段诱导丛生芽增殖，获得大量的试管苗，建立了铁皮石斛的快速繁殖体系，缩短了铁皮石斛无性繁殖的周期，为进一步加快铁皮石斛组织培养产业化发展奠定了技术基础。
1 材料与方法1.1实验材料供试材料铁皮石斛外植体采自宁波市鹿亭乡白鹿村。
1.2 外植体的消毒与培养从铁皮石斛植株上选择新生健壮的茎段作为外植体，摘去叶片和膜质叶鞘，剪取2cm长带茎节的小段，用洗洁剂小心清洗后，置流水下冲洗10min备用。
优化铁皮石斛原球茎生物反应器的培养体系
优化铁皮石斛原球茎生物反应器的培养体系铁皮石斛为兰科石斛属植物,具有独特的药理作用和较高的药用价值,是一种极其珍贵的药用植物,近年来铁皮石斛的野生资源严重匮乏,进行人工栽培又具有产量不稳定和有效成分含量低等问题,使得石斛资源的开发和利用受到了阻碍。
因此,本试验以铁皮石斛无菌播种诱导出的原球茎作为试验材料,研究生物反应器内影响原球茎生长的多种因素,优化反应器培养原球茎及活性物质积累的体系,同时也为铁皮石斛生产提供一种新的方法。
通过对原球茎在反应器和固体培养条件下增殖生长的比较,发现在生物反应器内原球茎增殖生长明显好于固体培养,原球茎鲜物重和干物重为固体培养的1.48和1.75倍,增殖系数达到5.5。
为了确立原球茎反应器培养的优化体系,研究了对原球茎以及活性物质积累的影响因素,结果表明,通气方式对原球茎生长和活性物质的积累有很大影响,在逐渐提高通气量的变量通气条件下不但原球茎生物量而且多糖和生物碱的含量及产量明显高于恒量通气。
反应器培养过程中接种量是另一重要因素,当原球茎接种量为30g(FW)时,增殖系数最高,但接种量提高到50g时原球茎的生物量最多,但多糖和生物碱的最高积累则分别出现在接种量为50和40g时,因此针对不同的物质生产采用不同的接种量。
对培养基条件进行优化的结果表明以蔗糖作为碳源,浓度为30g·L-1时有利于原球茎的增殖生长及活性物质的积累；对培养基无机盐进行了筛选,将MS培养基浓度减半,P043-浓度调节为1.8mM,并单独使用30mM的N03-时,有利于原球茎生长和多糖及生物碱的积累。
另外,培养基中pH对原球茎生长和多糖及生物碱积累有很大的影响,原球茎在pH5.8生长最佳,pH4.8和7.8对原球茎生长有抑制效果,而多糖含量和生物碱含量分别在pH7.8和pH4.8达最高,分别为574.13mg·g-1和330.73gg·g-1,但两种物质最高的生产量出现pH5.8,多糖和生物碱生产量分别达到5.52g·L-1和3.11mg·L-1对铁皮石斛原球茎和栽培植株茎叶中多糖和生物碱进行组织化学定位研究,发现多糖的分布量在原球茎多于植株茎和叶中,在原球茎中多糖主要存在于薄壁细胞内,茎中在维管束周围,而叶片中主要分布于叶肉细胞内。
铁皮石斛类原球茎增殖和分化的研究
期为进行工厂化育苗提供有效途径。铁皮石斛植株由上海中药研究所引进，
! ! 收稿日期： "##* 8 #& 8 #9 基金项目： 宁德市科技计划项目 （编号为 "##(:%" ） 。 作者简介： 林丛发 （%&** 8 ） ， 男， 副研究员， 从事生物技术研究工作。
江西农业学报! "##$ ， %& （%） ： ’( ) ’* +,-. +/01,23-20.4 51.6/71
铁皮石斛类原球茎增殖和分化的研究
林丛发， 钟爱清， 林云斌， 陈芦根
（福建省宁德市农业科学研究所， 福建 宁德 ;99#%$ ）
摘! 要： 通过单因素浓度试验和正交试验研究了 9 种金属离子、 不同激素组合及不同天然附加物对铁皮石斛类原球茎增 殖、 分化的影响。试验结果表明， 9 种金属离子对类原球茎增殖影响的主次顺序为 </" = ! >4" = ! ?." = ! <6" = ! :6" = ， 类原 球茎增殖的最佳培养基为 % @ "<A = B++ #C 9D/ @ E = %#F 马铃薯汁 = ;F 蔗糖 （含 </" = %C # DDG3 @ E、 ?." = "C # DDG3 @ E、 >4" = #C % DDG3 @ E、 <6" = #C %DDG3 @ E 和 :6" = #C #; DDG3 @ E） 。培养基 % @ "<A = B++ #C 9D/ @ E = "#F 马铃薯汁 = 蔗糖 "#/ @ E = 琼脂 #C ’/ @ E 最适于铁皮石斛类原球茎的分化。 关键词： 铁皮石斛； 类原球茎； 金属离子； 增殖； 分化 中图分类号： H&(&C $%’! 文献标识码： +! 文章编号： %##% 8 ’9’% （"##$） #% 8 ##’( 8 #;
铁皮石斛茎段类原球茎的诱导及植株再生
Protocorm-like Bodies Induction and Plant Regeneration from Stem Segments of Dendrobium officinale Kimura et Migo
作者： 袁芳[1];宋凯杰[1];杨泽东[1];王兵[1];蔡熙彤[1];兰小中[1]
作者机构： [1]西藏农牧学院,西藏林芝860000
出版物刊名： 东北农业科学
页码： 66-71页
年卷期： 2019年 第4期
主题词： 铁皮石斛;茎段;类原球茎;植株再生;组织培养
摘要：以铁皮石斛幼嫩的带节茎段为外植体,通过研究植物生长调节剂对类原球茎诱导、增
殖和分化的影响,筛选出适宜铁皮石斛类原球茎植株高效再生的条件。
结果表明:类原球茎诱导的最适培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L+土豆泥60 g/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖25
g/L+琼脂6.5 g/L,茎段接种45 d后,类原球茎诱导率为97.78%;类原球茎增殖和分化的最适培养基为MS+6-BA 2.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L,培养30 d,增殖倍数为7.94,培养至60 d,丛生芽诱导率为97.33%;再生苗在MS+NAA 0.5 mg/L培养基中培养30 d,生根率达到100%。
液体悬浮培养促进铁皮石斛原球茎高效诱导_增殖的研究
收稿日期:2008-12-21基金项目:云南省昆明市西山区科技计划项目(西科字34号)作者简介:苏钛(1981-),男,云南大理人,硕士,主要从事药用植物生物技术方面和药用植物资源方面的研究。
E -m a i:l kusuta i 2000@yahoo 液体悬浮培养促进铁皮石斛原球茎高效诱导、增殖的研究苏 钛,张晓南(云南省药物研究所,云南昆明650111)摘 要 用正交设计方法对铁皮石斛原球茎具有高效增殖影响的激素(BA,NAA,KT,马铃薯汁)以及配比进行研究,结果表明:以茎段为外植体在培养基M S+B A 2.0mg /L +NAA 2.0mg /L +马铃薯汁10%+糖3%,具有很好的原球茎诱导作用,50d 后诱导率达95.20%;原球茎在1/2M S+BA 2.0m g /L+NAA 1.0mg /L +KT0.5mg /L +糖3%的培养基上,以液体悬浮培养,原球茎增殖达49.032g /50d 。
关键词 铁皮石斛;原球茎;悬浮培养中图分类号:Q 943.1 文献标识码:A 文章编号:1006-9690(2009)04-0054-03Study on the Inducti on and Proliferati on of Protocor m i nD endrobi u m off ici nale by Suspension CultureSu Ta,i Zhang X iaonan(Yunnan I nstitute o fM ateria M ed ica ,Kunm ing 650111China)Abst ract To study on the effects of plant gro w th regu lator (B A,NAA,KT,and Po tato j u i c e)on the in -ducti o n and pr o liferati o n o f Dendrobium officinale pr o tocor m by orthogona l design.The resu lts show ed tha t the opti m u m induction m ed i u m isM S+B A 2.0m g /L+NAA2.0m g /L+potato j u ice10%+sugar 3%,the inducti o n rate of protocor m is 95.20%after 50days ;the p lants are transp lanted i n the proliferation m edi u m of 1/2M S+B A2.0m g /L +NAA1.0mg /L+KT0.5m g /L +sugar 3%after the protocor m are i n ducted .Pro liferati o n rate of Dendrobium off icinale protocor m in liqu id m ed i u m is 49.032g /50d .K ey w ords D endrobium officinale ;pr o tocor m ;suspension c u lture 铁皮石斛(D endrobium officinale K i m ura etM -i go)为兰科(O rch i d aceae)石斛属(D endrobiu m )珍稀濒危植物,仅分布于我国南方诸省(浙江、广西、福建、贵州、云南、河南、安徽等地)原始森林,有养阴生津、润肺明目、抗癌防老等功效[1]。
液体悬浮培养促进铁皮石斛原球茎高效诱导、增殖的研究
液体悬浮培养促进铁皮石斛原球茎高效诱导、增殖的研究
液体悬浮培养促进铁皮石斛原球茎高效诱导、增殖的研究
用正交设计方法对铁皮石斛原球茎具有高效增殖影响的激素(BA,NAA,KT,马铃薯汁)以及配比进行研究,结果表明:以茎段为外植体在培养基MS+BA2.0 mg/L+NAA2.0 mg/L+马铃薯汁10%+糖3%,具有很好的原球茎诱导作用,50 d后诱导率达95.20%;原球茎在1/2MS+BA2.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+KT0.5 mg/L+糖3%的培养基上,以液体悬浮培养,原球茎增殖达49.032 g/50d.
作者：苏钛张晓南 Su Tai Zhang Xiaonan 作者单位：云南省药物研究所,云南,昆明,650111 刊名：中国野生植物资源英文刊名：CHINESE WILD PLANT RESOURCES 年，卷(期)：2009 28(4) 分类号：Q943.1 关键词：铁皮石斛原球茎悬浮培养。
真菌诱导子对铁皮石斛原球茎诱导作用的研究
真菌诱导子对铁皮石斛原球茎诱导作用的研究由于铁皮石斛繁殖能力低、生长缓慢、成熟周期长，加上近年来的过分采挖，野生资源已濒临枯竭。
因此，用铁皮石斛组培苗或原球茎代替野生药材的研究在我国逐渐引起关注。
根据兰科植物与真菌共生形成菌根的特点，本文对真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生长发育及其质量的影响进行了较系统研究。
选用24种真菌制成诱导子与液体培养的铁皮石斛原球茎共培养后发现：10号真菌诱导子对原球茎生长量有提高作用，而其它真菌诱导子无影响；多种诱导子分别处理的原球茎的提取物对T淋巴细胞增殖有促进作用，其中24号真菌诱导子处理的原球茎的提取物既可促进淋巴细胞的增殖、也可抑制肿瘤细胞生长。
通过对24号真菌形态学特性的研究和ITS序列的分析，初步确定24号真菌为小菇属真菌。
培养基添加24号真菌诱导子培养106小时，可以使液体培养的铁皮石斛原球茎总生物碱含量比对照提高58.2％。
薄层层析和高效液相色谱分析结果表明：24号真菌诱导子处理的原球茎比处理前有7种新成分出现；其中有3种成分为野生铁皮石斛所特有。
采用液体-固体双重循环培养方法实现原球茎的快速繁殖，并研究各个环节中原球茎生长和发育的因素。
研究结果表明选择1／2MS固体培养基、20％马铃薯提取液、3％蔗糖、pH5.8的培养条件对原球茎的生长较为有利；其中培养基中添加马铃薯提取液是原球茎快速生长和BAP促进其分化苗的必要条件。
pH6.0、添加灭活真菌的培养基上的原球茎生长受到抑制；激素NAA可使原球茎生长量比对照提高16％。
铁皮石斛原球茎在液体培养体系(67-V)生长迅速、品质良好；由此获得的原球茎向固体培养转移的最优培养基为全1／2MS固体培养基。
循环培养过程中筛选出了性状稳定的G、B、E、Hp6原球茎株系；其中株系B和Hp6的总生物碱的含量比普通原球茎(CK)高20％以上。
而株系G的原球茎阶段稳定、对真菌诱导子敏感。
在此基础上，对原球茎株系G进行单一胚系筛选，选出的铁皮石斛原球茎苗不发育株系(SUDP)的形态发生和发育速度一致的，性状稳定，适合作诱导作用的实验。
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铁皮石斛茎尖诱导原球茎再生体系的研究
作者：王波崔翠顾颖慧
来源：《南方农业·下旬》2015年第06期
摘要以铁皮石斛茎尖为外植体进行高效再生体系建立实验，采用单因素实验研究不同基础培养基、激素浓度的配比、天然添加物对原球茎诱导、增殖、分化的影响，筛选出适合各培养阶段的培养体系配方，建立铁皮石斛组织培养快速繁殖体系
关键词铁皮石斛；原球茎诱导；快繁体系
中图分类号：S682.31 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2015）18-00-03
铁皮石斛（Dendrobium candidum），又称黑节草，云南铁皮，兰科多年生附生草本植物，道家养生经典著作《道臧》誉其为“中华九大仙草之首” [1]。
由于人们对野生铁皮石斛的过度采挖，使得其野生资源已濒临灭绝，而铁皮石斛的种子极小且无胚乳，自然条件下萌发率极低，实生苗人工栽培相对比较困难；并且传统的分株、扦插等繁殖方式生长周期长，繁殖率低，远不能满足生产上的需要[2]。
为此，开展铁皮石斛的组织培养研究成为必然。
目前，有关铁皮石斛组织培养成功的报道很多[3]。
在铁皮石斛再生体系技术研究中，原球茎诱导是整个再生的体系中开始的环节，其诱导率的高低直接影响瓶苗的出苗率、生产成本。
本研究以铁皮石斛无菌苗作为外植体，对茎尖诱导原球茎的增殖和分化进行系统研究，以基础培养基、激素的浓度配比和天然添加物为因子，采用正交试验筛选出最优的培养基配方，以期缩短组培苗生长周期、提高组培苗质量和移栽成活率，为人工规模化繁殖和栽培提供技术依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选用潍坊工程职业学院花卉研究所培育的铁皮石斛无菌苗作为组织培养的外植体材料
1.2 实验方法
选取健壮无污染的组培苗，在解剖镜下仔细剥离茎尖，逐层剥去外围组织，用解剖刀切取0.1～0.2 mm的茎尖，分别接种到诱导培养基中，经过一段时间的诱导，外植体膨大产生原球茎。
将产生的原球茎转入增殖培养基和分化培养基，经原球茎的增殖和分化形成新的植株。
人工气候培养箱培养，培养条件：温度（25±1）℃，湿度为75%，光照强度为2 000 lx，时间12 h/d。
2 结果与分析
2.1 原球茎的诱导
以茎尖为外植体诱导原球茎的发生阶段做三因素三水平正交试验（表1），将切取的茎尖接种到不同配方的培养基中，每瓶接种4个茎尖，每个处理接种5瓶，重复3次。
基本培养基：MS+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，pH值5.8。
培养期间定期观察原球茎诱导情况，培养30 d 后统计诱导率。
对照不加激素和天然添加物，试验结果表明（表2），在不添加激素和天然添加物时，外植体的诱导率为13.3%，当添加不同浓度的激素和天然添加物后原球茎的诱导率均有所上升。
并且极差分析表明在所设置的3个因素中6-BA对试验结果的影响比较明显，其次为天然添加物椰肉和NAA。
综合分析极差结果，该试验最佳培养基配比为：MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+10 g/L椰乳+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。
表1 L9（34）正交试验因素水平设计
因素
水平 A B C
NAA/（mg/L） 6-BA//（mg/L）椰肉/（g/L）
1 0.1 0.
2 5
2 0.2 0.5 10
3 0.5 1.0 15
表2 L9（34）正交试验结果分析
试验号 A B C 诱导率/%
CK 0 0 0 13.3
1 1 1 1 31.7
2 1 2 2 41.7
3 1 3 3 35.0
4 2 1 3 31.7
5 2 2 1 43.3
6 2 3 2 38.3
7 3 1 2 31.7
8 3 2 3 35.0
9 3 3 1 35.0
K1 108.4 95.1 110 -
K2 113.3 120 116.7 -
K3 101.7 108.3 91.7 -
k1 36.1 31.7 36.7 -
k2 37.8 40.0 38.9 -
k3 33.9 36.1 33.9 -
R 3.9 8.3 5.0 -
2.2 原球茎的增殖
将上述试验中相同条件下生长良好的原球茎，切割成直径约1.0 cm×1.0 cm小块接种到不同激素和天然添加物配比的培养基中，每瓶接种4块，60 d内统计原球茎的增殖情况。
基本培养基。
1/2MS+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，pH值5.8。
以NAA、6-BA、KT、椰乳为因素设计四因素三水平的正交试验（表3）。
原球茎培养7 d后，增殖现象开始明显，新增原球茎淡黄绿色；30 d原球茎增殖加快；60 d后部分原球茎少部分出现黄化现象。
9 组试验原球茎增殖倍数和生长状况都出现差异（表4），试验组5号、6号、9号原球茎生长紧致，颜色绿色，增殖倍数较大；试验组1号、4号和7号原球茎的增殖倍数较低，生长后期出现黄化坏死现象。
极差分析结果表明NAA、6-BA、KT、椰乳四个对试验结果影响顺序为6-BA>NAA>KT>椰乳，最适实验组合为
B2A2C2D3。
综合原球茎增殖倍数及生长状况，增殖最适培养基为1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+15 g/L椰乳+ 7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。
表3 不同激素和天然添加物因素水平表
因素
水平 A B C D
NAA/（mg/L） 6-BA/（mg/L） KT 椰乳/（g/L）
1 0.
2 1.0 0 5
2 0.5 1.5 0.5 10
3 1.0 2.0 1.0 15
2.3 原球茎的分化
将上述增殖试验中生长一致且状态健壮的原球茎，切割成直径约1.0 cm×1.0 cm小块接种到不同激素和天然添加物配比的分化培养基中，每瓶接种4块，每种处理接5瓶，30 d统计原球茎的分化情况。
基本培养基：MS+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，pH值5.8。
以NAA、6-BA、KT、马铃薯提取物为测试因素设计四因素三水平的正交试验（表5）。
在设置的9组试验中原球茎的分化出现了明显的差异（表6），试验组5号、6号原球茎分化率最大；试验组1号、2号和3号分化率较低。
极差分析结果表明NAA、6-BA、KT、马铃薯提取物四个对试验结果影响顺序为NAA>6-BA>KT>马铃薯提取物，最适实验组合为A2B1C2D3。
原球茎最适分化培养基为MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT+150 g/L椰乳+ 7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。
表5 原球茎分化培养基因素水平表
因素
水平 A B C D
NAA/（mg/L） 6-BA/（mg/L） KT 马铃薯提取物/（g/L）
1 0.5 1.0 0 50
2 1.0 1.5 0.1 100
3 1.5 2.0 0.5 150
（上接第页）
3 结论
自然状态下，铁皮石斛的种子极小，繁殖率低，用组织培养方法快速繁殖大量试管苗，是解决种苗最有效的途径之一[4]。
本研究综合各试验阶段初步建立了一套较完整的铁皮石斛组织培养繁殖体系。
以茎尖为外植体分别研究了不同激素配比和天然添加物对铁皮石斛原球茎的诱导、增殖和分化的影响。
从中比较和筛选出适合不同培养阶段的培养基配方。
结果表明，茎尖诱导原球茎的最适诱导培养基为MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+10 g/L椰乳+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，原球茎增殖培养基为1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+15 g/L 椰乳+ 7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。
原球茎分化培养基为MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT+150 g/L椰乳+ 7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。
在本试验体系中原球茎的分化率最大可以达到93.3%，这为铁皮石斛规模化生产提供了更加有力的保障。
参考文献
[1][魏]吴普，等述.神农本草经[M].[清]孙星衍，等辑.北京：人民卫生出版社，1982：21.
[2]徐路加，华允芬.石斛原球茎的组织培养研究进展[J].北方园艺，2014（6）.
[3]王丽萍，梁淑云.铁皮石斛原球茎诱导与增殖研究[J].中国农学通报，2010（1）.
[4]张启香，付素静，方炎明，等.铁皮石斛拟原球茎的发生过程[J].浙江林学院学报，2009（3）.
（责任编辑：刘昀）。