转基因动物技术与药物生产

6.2 转基因技术
人工染色体
人工酵母染色体(Yeast Artificial Chromosome,YAC) 人工细菌染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)
6.2 转基因技术
染色体DNA的三种功能元件（functional elements） 自主复制DNA序列(autonomously replicating DNA
细胞或胚胎干细胞； 2.选择获得携有目的基因的细胞，选择合适的体外培养
系统和宿主动物； 3.转基因细胞胚胎发育及鉴定； 4.筛选所得的转基因动物品系。
6.2 转基因技术
转基因技术 目的基因的制备和来源 目的基因的克隆 细胞转染外源基因的方法 转染细胞的鉴定
6.2 转基因技术
目的基因的制备和来源 1．采用限制性内切酶，获取目的基因 2．通过mRNA合成cDNA 3．人工体外合成DNA片断 4．聚合酶链式反应(PCR)扩增特定基因片段
6.2 转基因技术
目的基因的克隆 基因克隆的载体
（1）质粒载体 （2）病毒类载体（λ 噬菌体载体等） （3）粘粒载体 （4）人工染色体
6.2 转基因技术
质粒载体
质粒是细菌染色体外小型双链环状DNA复制子，对 细菌的某些代谢活动和抗药性表型有一定作用。质粒 DNA不但能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号 和启动子后，可以构建出能在原核或真核细胞中均可 复制的穿梭质粒，因此以质粒为载体的基因克隆方法 被广泛使用。
6.2 转基因技术
粘粒载体
粘粒(cosmid)是由质粒和噬菌体的粘性末端构建而成，由于 λ 噬菌体载体容量仍然受到一定限制，最大插入片段不能超 过23kb。1978年勘Collis和比Hohn发展了这类质粒与噬菌体 联合的新载体——粘粒，其基因组一般由以下几部分组成： 质粒复制起始位点，1个或多个限制性内切酶位点，抗药性 标记和带有粘性末端的DNA片段。粘粒载体大小为4—6kb， 而插入片段为29—45kb。
第三章 转基因动物技术与药 物生产
基因工程技术 按照人们的意志,通过人工操作的方式将外源基因整合 到生物体基因组内,使该转基因生物能稳定地将此基因 遗传给后代的实验技术。
特点:
• 基因体外重组 • 不受生物种类的限制 • 精确细致地控制
6.1 转基因动物的原理和方法
关键技术包括： 1.外源目的基因的制备，外源目6.2 转基因技术
细胞接受外源的方式
6.2 转基因技术
细胞转染外源基因的方法： 物理方法 化学方法 生物学方法
6.2 转基因技术
物理方法 1. 电穿孔法 2. 微注射法 3. 裸露DNA直接注射法
6.2 转基因技术
电穿孔法
6.2 转基因技术
电 穿 孔 法 示 意 图
6.2 转基因技术
6.2 转基因技术
优点： A. 保证大片段DNA的完整性 B. 提高较长外源片段在动物转基因时的整合率 C. 保证目的基因上下游的侧翼序列的完整性
因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。 YAC介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。
6.2 转基因技术
人工酵母染色体（YAC）的制备
6.2 转基因技术
微注射法
6.2 转基因技术
微 注 射 法 示 意 图
6.2 转基因技术
6.2 转基因技术
裸露DNA直接注射法 将裸露DNA直接注射到组织中, DNA有可能被细胞摄入 这是最简单的基因转移方法,但是转移效率很低
6.2 转基因技术
化学方法 主要原理是通过改变细胞膜的通透性或者增加DNA与细胞 的吸附而实现基因的转移
6.2 转基因技术
磷酸钙-DNA共沉淀法 是受二价金属离子能促进细菌吸收外源DNA而来. 当核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式存在时,细胞摄取 DNA的能力显著增加。
6.2 转基因技术
磷 酸 钙 共 沉 淀 法 图 示
-DNA
6.2 转基因技术
脂质体载体包埋法
6.2 转基因技术
脂 质 体 载 体 包 埋 法 图 示
6.2 转基因技术
反转录病毒载体
可获得稳定有效的转染 可用于不易转化的细胞 但有免疫反应,转染能力有限
6.2 转基因技术
6.2 转基因技术
• DEAE-葡聚糖法 • 磷酸钙-DNA共沉淀法 • 脂质体载体包埋法
6.2 转基因技术
DEAE-葡聚糖法 • 最早的动物细胞转染方法。 • 将外源DNA片段与DEAE——葡聚糖等高分子碳水化合
物混合，DNA链上带负电的磷酸骨架便被吸附于DEAE 的正电荷基团上，从而形成DNA大颗粒。后者黏附于 受体细胞表面，并通过胞饮作用进入细胞内。 • 该方法的转化率较低。
6.2 转基因技术
生物学方法 基因转移的生物学方法主要是病毒介导的基因转移。根 据受体细胞类型不同可选择不同宿主范围和不同感染途 径的病毒基因组作为载体。目前常用的病毒载体包括DNA 病毒载体（腺病毒载体、牛痘病毒载体等）、反转录病 毒载体等。
6.2 转基因技术
腺病毒载体
运载DNA片段较大 安全性好 宿主范围广 对受体细胞分裂周期要求不严 外源基因表达高效
sequence, ARS) 着丝粒DNA序列(centromere DNA sequence,CEN) 端粒DNA序列(telomere DNA sequence,TEL)
6.2 转基因技术
人工酵母染色体法 YAC能克隆百万对碱基的大片段DNA
技术途径：
A. 阳性ES细胞在YAC转染及体外筛选,囊胚腔注射 B. YAC的原核微注射。
6.2 转基因技术
病毒类载体（λ 噬菌体载体等）
λ 噬菌体是一种双链DNA噬菌体，基因组约有50kb，在λ 噬菌 体颗粒中分离出来的DNA为线性双链分子，在分子两端各有12 个碱基的互补单链顺序，是天然的粘性末端。λ 噬菌体功能 相关基因成簇排列在基因组上，中间部分(约占30％)为非裂 解生长所必须，根据这一特性，可用其他外源DNA片段插入或 取代该区域，而对噬菌体的感染和生长不会造成严重影响。 这是λ 噬菌体成为重要的、有价值的基因克隆载体的基础所 在。构建的重组λ 噬菌体分子，其总长不得超过野生型DNA的 105％，不能短于75％。