除草剂室内高通量筛选方法研究

除草剂室内高通量筛选方法研究

摘要:以狗牙根为材料,对除草剂筛选的限制因素进行了研究｡结果表明,水分流失和真菌污染是引起筛选结果不稳定的主要因素;运用多种规格的组织培养板和雾化补水可以控制水分流失对筛选的不利影响;添加抗真菌剂和对种子进行杀菌处理可以消除真菌污染对靶标的侵害和延长试验的可观察时间｡进一步的筛选试验结果表明,运用以上方法能够稳定､高效地对不同来源的样品进行筛选｡

关键词:高通量筛选;除草活性;种子处理;抗真菌剂

Study on High Throughput Screening of Herbicide

Abstract: In order to optimize the high throughput screening of herbicide, various factors that affect the growth of grass in testing plates were studied. The results showed that the key factors were the loss of water and fungal infection. So a screening model was advanced to break the series of limiting factors. The loss of water had been controlled by the application of different testing plates and addition of water by the atomizer; by the application of selective fungicide and seeds treatment, the problem of fungal infection had been solved and the period of testing had been lengthened. The screening method had been tested and verified with three standards and about 1280 samples from different sources. The results showed that it is a stable and highly efficient method for the screening of herbicide activity of samples from different sources.

Key words: high throughput screening; herbicidal activity; seeds treatment; fungicide.

直接应用目标杂草进行除草剂筛选具有针对性强､活性反应真实､直观等优点,在新药发现方面更具有独特的优势｡而对于来源多样､理化性质复杂及数量巨大的样品,直接使用目标杂草进行筛选存在着操作复杂､工作量大､活性重现性差､可观察时间短等诸多瓶颈｡本试验以狗牙根种子为筛选起点,使用琼脂为载体对除草剂室内高通量筛选的限制因素进行了探索[1],同时选择3个标准样品和一些不同来源的样品进行了筛选,旨在找到高效､稳定的除草剂室内高通量筛选方案｡

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 种子狗牙根种子发芽率大于70%,保藏温度为17~20 ℃｡

1.1.2 培养基原料琼脂粉(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司,型号DH010-4)､PDB培养基原料(Becton,Dickinson & CO.)｡

1.1.3 试剂及标准样品试剂丙酮､乙醇､二甲基亚砜､吐温-80均为市售分析纯,抗菌剂特比萘芬､放线菌酮､嘧菌酯､咪鲜胺为市售分析纯,除草剂标准样品乙草胺､草甘膦､硝磺酮为市售原药｡

1.1.4 供筛选试验样品化学合成物由湖北省生物农药工程研究中心绿色化学研究室提供,真菌和放线菌发酵提取物由湖北省生物农药工程研究中心微生物工程研究室提供,微生物源先导化合物及植物提取物由湖北省生物农药工程研究中心先导化合物分析室提供｡

1.1.5 主要仪器､设备B100-1F蠕动泵､KQ-250DE型数控超声波清洗器､医用雾化器､BIOHIT eLINE(MCE8k)电子移液器､High Tech Lab DV8-200移液器､人工气候室(光､温､湿可调)､经过灭菌处理的96孔组织培养板和深孔组织培养板､JN.GL 100 W LED植物生长灯(0.4 m距离光照度为3 500~4000 lx)､生物安全柜｡

1.2 试验方法

1.2.1 狗牙根生长试验试验设4个处理组:第一组为载体对照组,把0.7%的琼脂加入96孔组织培养板,每孔加入量为0.2 mL;第二组为种子对照组,在作为载体的琼脂表面接入未经处理的狗牙根种子,接入量约为20粒/孔;第三组为种子杀菌处理组,在琼脂表面接入经过杀菌处理的种子,接入量约为20粒/孔;第四组为加入营养成分的载体对照组,把真菌培养基(已加入抗细菌剂重铬酸钾,终浓度为0.020 mg/mL)加入96孔组织培养板｡组织培养板移入70 cm × 40 cm × 15 cm的无盖白色食品盆中,盆口以透明塑料薄膜覆盖｡所有培养盆均在人工气候室中培养(30 ℃､相对湿度70%~80%､光照14 h/d,光源100 W LED植物生长灯距植物20~25 cm)｡每个处理组使用3个组织培养板,每组设2个重复｡每天称取培养板重量,并计算各组水分流失的平均值｡同时观测4､7､14 d时植物生长状况及真菌污染情况｡

1.2.2 培养板中真菌的分离及抑菌试验从1.2.1生长试验中培养14 d后的组织培养板中分离真菌,并进行纯化培养[2],使用管碟法半定量测定特比萘芬､放线菌酮､嘧菌酯､咪鲜胺对分离获得的3个真菌纯培养的抑菌效果[3],根据抑菌圈的大小进行抑菌活性分级｡各抗真菌剂使用3个浓度梯度(0.020､0.010､0.002 mg/mL)进行试验｡

1.2.3 抗菌剂及种子处理的应用效果试验根据1.2.2的结果,选择抑菌活性最强和最弱的抗菌剂｡试验中使用的狗牙根种子分为2组,一组为未处理的普通种子,另一组以温汤法进行杀菌处理[4]｡

1.2.4 稳定性试验

1)活性评价指标｡根据活性反应的不同,使用2项指标标记除草活性｡一是以株高为指标进行标记,按0､3､5､7､9分级｡0表示无活性,指标为株高与阴性对照组株高一致; 9表示活性为100%,指标为种子未萌发｡在0与9之间设置3个级别,对于植株株高明显高于阴性对照的样品标记为“S”｡二是以植株黄化程度为指标进行