浙江大学液相色谱课件
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流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。另外 可以安装自动进样器实现自动化大批量样品处理。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.3 分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小 填料粒度和柱径以提高柱效。按照柱子的用途可以分为用来进行大量样 品分离的制备柱和用来进行痕量样品分析的检测柱
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
分配色谱
• 正相分配色谱：流动相极性＜固定相极性 • 反相分配色谱：流动相极性＞固定相极性 化学键合相色谱 反相：固定相：C18, C8 流动相：水，甲醇，乙腈等极性溶剂的混合溶剂 适合极性小的芳香族化合物 正相：固定相：-CN, -NH2 流动相：烷烃，异丙醇，四氢呋喃等的混合溶剂 适合于极性差异大的化合物
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
Agilent HP 100
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.1 高压输液系统
2.1.1 高压泵
(1) 往复恒流泵
15 ～ 35 MPa 脉冲小 流量稳定可调 耐腐蚀性
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
二、液相仪器及其结构
2.4 液相色谱的流动相
流动相的物理、化学性质及其纯度将直接影响到色 谱系统的：
• 固定相的稳定性 • 分离效率 • 分离速度 • 检测灵敏度
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.4.1 流动相的选择原则：
为了保持色谱柱的稳定性，要求： 1) 与固定相不互溶 2) 不发生不可逆吸附 3) 有合适的pH值（需注意与另一溶剂混合后不析出固体） 化学惰性——不与样品及固定相发生反应。 适用于所选择的检测器 对样品有很强的溶解力。 清洗与更换方便：可减少更换溶剂时的间隔时间。 低价、毒性小、纯度高。 低粘度。
f= (As/ms)/(Ar/mr)
其中As和Ar分别为内标物和对照品的峰面积或峰高，ms和mr分别 为加入内标物和对照品的量。 2：取含有内标物的待测组分溶液进样，记录色谱图，再根据含内标物 的待测组分溶液色谱峰响应值，计算含量（mi）：
mi=f×Ai/(As/ms)
其中 Ai和As分别为待测组分和内标物的峰面积或峰高，ms为加入 内标物的量。
• 示差折射计（Refractive Index Detector，RID）
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
• 二极管阵列检测器（diode-array detector，DAD）
《现代仪器分析实验技术与方法》
三、液相色谱的定性定量方法
峰面积百分比法
要求样品中所有组分必须都出峰，否则计量会有误差 。由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用
利用两台（二元 泵）或四台（四 元泵）高压输液 泵，将两种或四 种不同极性的溶 剂按一定的比例 送入梯度混合室， 混合后进入色谱 柱。溶剂比例可 依照需要进行改 变和控制。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.1.3 输液系统的辅助装置 • 过滤器：除掉机械杂质及固体颗粒
•
• • • •
《现代仪器分析实验技术与方法》
一、液相色谱原理介绍
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常 压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方 法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法 (High performance Liquid Chromatography，HPLC)是 在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相 色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区 别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起 高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法 (High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因 分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。
内标法是将一定质量的纯物质作为内标物加到一定 量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品 进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积 （或峰高）及相对校正因子，即可求出被测组分在样 品中的百分含量。
《现代仪器分析实验技术与方法》
三、液相色谱的定性定量方法
计算方法
1：精密称（量）取对照品和内标物，分别配成溶液。精密量取各溶液 ，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量进样，记录色谱图。 用含对照品和内标物的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式算出校 正因子（f）：
2.4.2 溶剂过滤
不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器，降低泵 的操作性能。
遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器的寿命： 使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。 用滤膜过滤溶剂去除微生物。 每两天更换或过滤溶剂。
避免溶剂瓶直接日照。
向溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠。
混合器：体积不宜大，靠动力学特性而混合
脉动阻尼器：种类多，都有一定容积和弹性 压力测量装置：电子压力控制器流量 测量装置：电子流量计 脱气装置：除掉溶于流动相中的各类气体，以保证柱 效能。根据不同需要可采用通氮脱气、超声脱气、自 动脱气机脱气等。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.2 进样装置
外标法
要求仪器重复性很严格，适于大量的分析样品，因为 仪器随着使用会有所变化，因此需要定期进行曲线校 正。在液相色谱中用的最多。
内标法
要求对于内标物的选择要严格，操作较复杂，适于分 析样品量较少的情况。在标准方法中用的最多
《现代仪器分析实验技术与方法》
三、液相色谱的定性定量方法
内标法
《现代仪器分析实验技术与方法》
三、液相色谱的定性定量方法
内标物的选择
1、一个能得到纯样的已知化合物 2、和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化 学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度 等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同 系物。
3、必须能与样品中各组分充分分离。
•
• • •
液-固吸附色谱 （Liquid-solid adsorption chromatography, LSAC）
离子交换色谱（Ion-exchange chromatography） 空间排阻色谱（Size-exclusion chromatography） 亲和色谱法（Affinity chromatography）
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
a) 排除物理性质不合适的溶 剂(沸点、粘度、紫外吸收 等); b) 选择洗脱强度适当的溶剂 (k’在1~10或0.5~20之 间);
c) 选择分离因子合适的溶剂 （α>1.05)。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
(2) 螺旋注射泵
压力可达60 Mpa 压力平稳无脉冲 清洗不便 压力控制精密 费用较高
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
(3) 往复隔膜泵
不易形成较高压力 压力平稳无脉冲 清洗方便 压力控制精密
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.1.2 梯度洗脱装置
《现代仪器分析实验技术与方法》
三、液相色谱的定性定量方法
外标法
仪器分析常用的方法之一，是比较法的一种。与内 标相比，外标法不是把标准物质加入到被测样品中， 而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得 到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求 得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质 但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被 测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。 外标法在操作和计算上可分为校正曲线法和用校正 因子求算法。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.3.2 主要分离柱类型
• 分配色谱：
液液分配色谱（Liquid-liquid partition chromatography）
化学键合相色谱（Chemically bounded phase chromatography, CBPC） 反相离子对色谱
一般为填充柱，内填液相色谱固定相。不同类型的固定相可以实现 不同类型的分离方法和分离效果。具有特定手性的固定相还可以对 不同手性构象的底物进行分离。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.3.1 固定相材料
按材料分类 刚性固体固定相：硅胶及表面改性硅胶 硬胶固定相： 按孔隙类型分类 表面多孔型： 实心玻璃珠外覆盖一层多孔材料（ 如硅胶） 全多孔型： 由10 nm的硅胶微粒制成， 表面多孔型 全多孔型 各种树脂
《现代仪器分析实验技术与方法》
Hale Waihona Puke Baidu
三、液相色谱的定性定量方法
校正曲线法（标准曲线法）：
用已知不同含量的标样系列在相同的液相条件下进行 进样分析，然后做出响应信号与含量之间的关系曲线， 也就是校正曲线（标准曲线）。定量分析样品时，在测 校正曲线相同条件下注入待测样品，从色谱图上测出峰 高或峰面积，再从校正曲线查出样品的含量。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
下列优良/常规实验操作能够最大限度降低维修费用：
清洁仪器, 流动相和样品;如果必要, 进行过滤。 保证溶剂的相溶性。
仪器使用完毕，冲洗整个系统，去掉盐份，防止污染。
对仪器的维护和保养进行记录。 定期使用异丙醇冲洗系统。
《现代仪器分析实验技术与方法》
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.5 液相色谱检测器
• 紫外吸收检测器（Ultraviolet Visible Detector，UVD） 目前在HPLC中应用最广泛的检测器。包括： 可变波长紫外检测器（VWD） 二极管阵列检测器（DAD）
• 荧光检测器（Fluorescence Detector，FD）
浙江大学研究生核心课程建设 《现代仪器分析实验技术与方法》
液相色谱实验
许凡 浙江大学化学系 2012年6月
《现代仪器分析实验技术与方法》
一、液相色谱原理介绍
色谱法分离原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分 经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作 用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相 中流出，达到分离检测的目的。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法 (Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸 色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
选择合适的滤膜
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推荐用于蛋白质和其 相关的样品。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸、70%乙醇、 二氯甲烷、不适用于DMF二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。 注意：1，每张滤膜只能用一次。 2，水相和有机相不要搞混。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.3.3 液相色谱柱的保养
（1）柱易被极细的颗粒堵塞，因此必须将流动相仔细地蒸馏、过滤。在流 动相贮槽与柱之间，使用0.5μm孔径的过滤器。 （2）在水溶液流动相（如缓冲液）中，细菌容易生长，可能堵塞筛板。防 止细菌生长的办法是加入抑制剂，如0.01%NaNO3。显然，抑制剂不能 干扰分离和测定。 （3）在恒定压力下，发现流量减少，柱子可能部分堵塞。堵塞最容易发生 在极窄的入口接头处以及入口、出口筛板处。堵塞后需要仔细拆洗，清除 堵塞物，但必须防止较强的机械震动，防止用热手接触柱子，致使柱内的 固定相层被扰动，使柱效发生变化。 （3）柱子的实际操作压力应低于填装时的最高压力，最好在最高压力的一 半以下。实际操作压力过高，易使入口的固定相层下沉，形成一个空穴。 若空穴形成，应重新装柱。在空穴中加入新的匀浆或玻璃微珠，也无法恢 复到原来的柱效。 （4）应该用进样阀进样，而不用注射器进样，以防止注射隔膜碎屑集聚在 柱入口。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.3 分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小 填料粒度和柱径以提高柱效。按照柱子的用途可以分为用来进行大量样 品分离的制备柱和用来进行痕量样品分析的检测柱
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
分配色谱
• 正相分配色谱：流动相极性＜固定相极性 • 反相分配色谱：流动相极性＞固定相极性 化学键合相色谱 反相：固定相：C18, C8 流动相：水，甲醇，乙腈等极性溶剂的混合溶剂 适合极性小的芳香族化合物 正相：固定相：-CN, -NH2 流动相：烷烃，异丙醇，四氢呋喃等的混合溶剂 适合于极性差异大的化合物
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
Agilent HP 100
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.1 高压输液系统
2.1.1 高压泵
(1) 往复恒流泵
15 ～ 35 MPa 脉冲小 流量稳定可调 耐腐蚀性
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
二、液相仪器及其结构
2.4 液相色谱的流动相
流动相的物理、化学性质及其纯度将直接影响到色 谱系统的：
• 固定相的稳定性 • 分离效率 • 分离速度 • 检测灵敏度
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.4.1 流动相的选择原则：
为了保持色谱柱的稳定性，要求： 1) 与固定相不互溶 2) 不发生不可逆吸附 3) 有合适的pH值（需注意与另一溶剂混合后不析出固体） 化学惰性——不与样品及固定相发生反应。 适用于所选择的检测器 对样品有很强的溶解力。 清洗与更换方便：可减少更换溶剂时的间隔时间。 低价、毒性小、纯度高。 低粘度。
f= (As/ms)/(Ar/mr)
其中As和Ar分别为内标物和对照品的峰面积或峰高，ms和mr分别 为加入内标物和对照品的量。 2：取含有内标物的待测组分溶液进样，记录色谱图，再根据含内标物 的待测组分溶液色谱峰响应值，计算含量（mi）：
mi=f×Ai/(As/ms)
其中 Ai和As分别为待测组分和内标物的峰面积或峰高，ms为加入 内标物的量。
• 示差折射计（Refractive Index Detector，RID）
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
• 二极管阵列检测器（diode-array detector，DAD）
《现代仪器分析实验技术与方法》
三、液相色谱的定性定量方法
峰面积百分比法
要求样品中所有组分必须都出峰，否则计量会有误差 。由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用
利用两台（二元 泵）或四台（四 元泵）高压输液 泵，将两种或四 种不同极性的溶 剂按一定的比例 送入梯度混合室， 混合后进入色谱 柱。溶剂比例可 依照需要进行改 变和控制。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.1.3 输液系统的辅助装置 • 过滤器：除掉机械杂质及固体颗粒
•
• • • •
《现代仪器分析实验技术与方法》
一、液相色谱原理介绍
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常 压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方 法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法 (High performance Liquid Chromatography，HPLC)是 在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相 色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区 别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起 高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法 (High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因 分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。
内标法是将一定质量的纯物质作为内标物加到一定 量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品 进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积 （或峰高）及相对校正因子，即可求出被测组分在样 品中的百分含量。
《现代仪器分析实验技术与方法》
三、液相色谱的定性定量方法
计算方法
1：精密称（量）取对照品和内标物，分别配成溶液。精密量取各溶液 ，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量进样，记录色谱图。 用含对照品和内标物的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式算出校 正因子（f）：
2.4.2 溶剂过滤
不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器，降低泵 的操作性能。
遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器的寿命： 使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。 用滤膜过滤溶剂去除微生物。 每两天更换或过滤溶剂。
避免溶剂瓶直接日照。
向溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠。
混合器：体积不宜大，靠动力学特性而混合
脉动阻尼器：种类多，都有一定容积和弹性 压力测量装置：电子压力控制器流量 测量装置：电子流量计 脱气装置：除掉溶于流动相中的各类气体，以保证柱 效能。根据不同需要可采用通氮脱气、超声脱气、自 动脱气机脱气等。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.2 进样装置
外标法
要求仪器重复性很严格，适于大量的分析样品，因为 仪器随着使用会有所变化，因此需要定期进行曲线校 正。在液相色谱中用的最多。
内标法
要求对于内标物的选择要严格，操作较复杂，适于分 析样品量较少的情况。在标准方法中用的最多
《现代仪器分析实验技术与方法》
三、液相色谱的定性定量方法
内标法
《现代仪器分析实验技术与方法》
三、液相色谱的定性定量方法
内标物的选择
1、一个能得到纯样的已知化合物 2、和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化 学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度 等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同 系物。
3、必须能与样品中各组分充分分离。
•
• • •
液-固吸附色谱 （Liquid-solid adsorption chromatography, LSAC）
离子交换色谱（Ion-exchange chromatography） 空间排阻色谱（Size-exclusion chromatography） 亲和色谱法（Affinity chromatography）
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
a) 排除物理性质不合适的溶 剂(沸点、粘度、紫外吸收 等); b) 选择洗脱强度适当的溶剂 (k’在1~10或0.5~20之 间);
c) 选择分离因子合适的溶剂 （α>1.05)。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
(2) 螺旋注射泵
压力可达60 Mpa 压力平稳无脉冲 清洗不便 压力控制精密 费用较高
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
(3) 往复隔膜泵
不易形成较高压力 压力平稳无脉冲 清洗方便 压力控制精密
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.1.2 梯度洗脱装置
《现代仪器分析实验技术与方法》
三、液相色谱的定性定量方法
外标法
仪器分析常用的方法之一，是比较法的一种。与内 标相比，外标法不是把标准物质加入到被测样品中， 而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得 到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求 得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质 但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被 测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。 外标法在操作和计算上可分为校正曲线法和用校正 因子求算法。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.3.2 主要分离柱类型
• 分配色谱：
液液分配色谱（Liquid-liquid partition chromatography）
化学键合相色谱（Chemically bounded phase chromatography, CBPC） 反相离子对色谱
一般为填充柱，内填液相色谱固定相。不同类型的固定相可以实现 不同类型的分离方法和分离效果。具有特定手性的固定相还可以对 不同手性构象的底物进行分离。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.3.1 固定相材料
按材料分类 刚性固体固定相：硅胶及表面改性硅胶 硬胶固定相： 按孔隙类型分类 表面多孔型： 实心玻璃珠外覆盖一层多孔材料（ 如硅胶） 全多孔型： 由10 nm的硅胶微粒制成， 表面多孔型 全多孔型 各种树脂
《现代仪器分析实验技术与方法》
Hale Waihona Puke Baidu
三、液相色谱的定性定量方法
校正曲线法（标准曲线法）：
用已知不同含量的标样系列在相同的液相条件下进行 进样分析，然后做出响应信号与含量之间的关系曲线， 也就是校正曲线（标准曲线）。定量分析样品时，在测 校正曲线相同条件下注入待测样品，从色谱图上测出峰 高或峰面积，再从校正曲线查出样品的含量。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
下列优良/常规实验操作能够最大限度降低维修费用：
清洁仪器, 流动相和样品;如果必要, 进行过滤。 保证溶剂的相溶性。
仪器使用完毕，冲洗整个系统，去掉盐份，防止污染。
对仪器的维护和保养进行记录。 定期使用异丙醇冲洗系统。
《现代仪器分析实验技术与方法》
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.5 液相色谱检测器
• 紫外吸收检测器（Ultraviolet Visible Detector，UVD） 目前在HPLC中应用最广泛的检测器。包括： 可变波长紫外检测器（VWD） 二极管阵列检测器（DAD）
• 荧光检测器（Fluorescence Detector，FD）
浙江大学研究生核心课程建设 《现代仪器分析实验技术与方法》
液相色谱实验
许凡 浙江大学化学系 2012年6月
《现代仪器分析实验技术与方法》
一、液相色谱原理介绍
色谱法分离原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分 经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作 用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相 中流出，达到分离检测的目的。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法 (Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸 色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
选择合适的滤膜
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推荐用于蛋白质和其 相关的样品。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸、70%乙醇、 二氯甲烷、不适用于DMF二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。 注意：1，每张滤膜只能用一次。 2，水相和有机相不要搞混。
《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
2.3.3 液相色谱柱的保养
（1）柱易被极细的颗粒堵塞，因此必须将流动相仔细地蒸馏、过滤。在流 动相贮槽与柱之间，使用0.5μm孔径的过滤器。 （2）在水溶液流动相（如缓冲液）中，细菌容易生长，可能堵塞筛板。防 止细菌生长的办法是加入抑制剂，如0.01%NaNO3。显然，抑制剂不能 干扰分离和测定。 （3）在恒定压力下，发现流量减少，柱子可能部分堵塞。堵塞最容易发生 在极窄的入口接头处以及入口、出口筛板处。堵塞后需要仔细拆洗，清除 堵塞物，但必须防止较强的机械震动，防止用热手接触柱子，致使柱内的 固定相层被扰动，使柱效发生变化。 （3）柱子的实际操作压力应低于填装时的最高压力，最好在最高压力的一 半以下。实际操作压力过高，易使入口的固定相层下沉，形成一个空穴。 若空穴形成，应重新装柱。在空穴中加入新的匀浆或玻璃微珠，也无法恢 复到原来的柱效。 （4）应该用进样阀进样，而不用注射器进样，以防止注射隔膜碎屑集聚在 柱入口。