细胞爬片染色步骤
细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤
细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤
细胞爬片：
1.埋板准备：准备含有合适培养基的细胞培养板或培养皿。将培养基
预热至适宜的温度。
2.细胞处理：将需要爬片的细胞株从库存中取出，用PBS（磷酸盐缓
冲液）或无酶胰蛋白酶溶解细胞外基质粘附，用培养基洗涤细胞。
3.细胞计数：用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞浓度，然后根据
需要调整到合适的细胞密度。
4.接种细胞：将适量的细胞接种到埋板中，根据实验要求可以采用单
细胞克隆或稀释传代法。
5.培养细胞：将埋板放入细胞培养箱的适当环境中，通常为37°C、5%CO2的培养箱。根据实验需要，培养时间可以从几小时到几天不等。
固定：
1.筛选固定剂：选择适合的固定剂，常用的固定剂包括乙醛和甲醛等。
2.固定细胞：使用适当的浓度的固定剂，将培养的细胞浸泡在固定剂中，通常需要15-30分钟的固定时间。
3.洗涤细胞：使用PBS等缓冲溶液洗涤固定的细胞，去除多余的固定剂。
免疫荧光：
1.孔板准备：将需要进行免疫荧光染色的细胞或组织培养在培养皿或
孔板中。
2.阻断非特异性结合：用0.1-5%BSA或牛血清等蛋白质溶液阻断非特异性结合位点，减少假阳性信号。
3.一抗染色：加入适当浓度的一抗（具体浓度由厂家确定）到需要染色的细胞上，对于细胞表面的抗原，可以直接在细胞外孔板中加入一抗。
4.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤一抗残余的溶液。
5.二抗染色：加入与一抗同种小鼠或兔子抗体的特异性抗体（如荧光素、奥林染色试剂等）到孔板中，适当的浓度需根据实验所需，与一抗使用的缓冲液一致。
6.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤二抗残余的溶液。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：
1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟
3、4%的甲醛室温固定20-30分钟
4、1×PBS洗3次，每次10分钟
5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟
6、1×PBS洗3次，每次10分钟
7、5%BSA室温封闭30分钟
8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜
9、1×PBS洗3次，每次10分钟
10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光
11、1×PBS洗3次，每次10分钟
12、95%甘油封片
注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释
从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光
细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤
1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。
2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。
5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。PBS洗三次，每次5分钟。
6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。
7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。
8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。
9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min
11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。
12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。
稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。
淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)
另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。我没用淡氨水溶液。若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。
细胞载玻片爬片培养法进行免疫组化染色方法介绍 - 天津灏洋
细胞载玻片爬片培养法进行免疫组化染色方法介绍
天津市灏洋生物制品科技有限责任公司郑斌徐彬
传统的细胞爬片中使用24孔板或96孔板，因为是塑料材质不利于抗原热修复，而盖玻片较薄，易碎不容易取出，二者均存在一定的缺点。本实验采用体外细胞载玻片爬片培养法，便于做热修复，同时操作较方便、简单、实用。
1 材料
1．1 载玻片的处理：用肥皂水将载玻片洗净，自来水冲洗，晾干，再将载玻片浸泡在洗液中2~3小时，取出后再用自来水冲净，蒸馏水冲洗三遍，用干净的纱布将载玻片擦干，放在饭盒中，置170℃干烤5小时消毒灭菌。
1．2 人乳腺癌细胞系T47-D、人骨肉瘤细胞系U2OS。
1．3 仪器
倒置显微镜、光学显微镜、二氧化碳培养箱、隔水式电热恒温培养箱等。 1．4 试剂
胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、免疫组化试剂盒、无水乙醇、抗葡萄糖转移酶（Glut-1）多克隆抗体、抗脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（APE1）单克隆抗体、抗血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体、PBS(含0.01M 磷酸盐缓冲液，0.85%NaCl，pH 7.2~7.4) 、0.1 M枸橼酸缓冲液（pH 6.2~6.4）、分化液（10%乙醇、0.5%盐酸）、二甲基联苯胺（DAB）等。
2 方法
2．1 细胞爬片培养
取人乳腺癌细胞系T47-D细胞及人骨肉瘤细胞系U2OS细胞各一瓶，用吸管吸除培养瓶内旧培养液，向培养瓶内加入2ml 0.25%胰蛋白酶,覆满瓶底。室温放置5分钟后镜下观察，发现细胞变圆、细胞间隙增大后，立即终止消化，翻转培养瓶，使瓶底向上。将胰蛋白酶吸去，加入约2ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，将细胞从瓶壁上吹打下来，制成细胞悬液，滴于已处理好的载玻片上，每张片子1~2滴，注意:滴于载玻片后1/3的位置，且不能有汽泡。放在37℃ 5%CO
免疫荧光染色-爬片 2
这是针对细胞爬片的免疫荧光染色标准步骤：
1）实验前一天，将细胞接入铺有22×22mm（或24×24mm）盖玻片的六孔板中。2）第二天，待细胞汇合度达到70％左右开始进行染色步骤。
3）用新鲜配制的2％（或4％）多聚甲醛固定细胞10分钟。
4）PBS洗三遍，每次5分钟。
5）用0.2-0.5％ triton X-100（PBS配制）对细胞透化处理10分钟。
6）PBS洗三遍，每次5分钟。
7）2％BSA或者10％二抗同源血清（注意一定要是正常血清）封闭30分钟，PBS 洗两遍。
8）加入1抗，室温孵育1 小时。
9）PBS洗三遍，每次5分钟。
10）加入二抗，室温孵育30-45 分钟。
11）PBS洗四遍，每次5分钟。
12）加入0.5 ug/ml DAPI（PBS配制）染色10分钟（这里也可用其它的染核染料如hoechst 33258）。
13）用PBS洗三遍，去除多余的DAPI。
14）加入20 ul封片剂封片。
15）封片好的细胞样品可于4度冰箱中存放2周以上。
注意步骤5-7在某些蛋白的染色步骤中可能不是必须的，一抗如果有多种（但注意要是不同种属的）可以同时孵育，二抗同时使用时最好是同一种属来源（如驴抗兔，驴抗羊，驴抗鼠），以避免二抗间的交叉反应。
如果是组织切片样品，可能还涉及到样品的染色前处理（比如石蜡切片的脱蜡），请参阅其它的说明，但荧光染色步骤是一样的。
如果要做细胞涂片的免疫荧光染色，需用离心涂片机将细胞固定在玻片上，再进行后续步骤。
免疫荧光步骤
最近按丁香园的帖子进行免疫细胞化学染色,结果
出来了。总结如下:
1. 上午做的爬片晾到下午开始染色
2. PBS浸洗爬片3遍,每遍5分钟
3. 用0.1%的柠檬酸钠配制0.3%Triton-X100,
0.1%柠檬酸钠:0.1g柠檬酸钠+100ml蒸馏水
0.3%Triton-X100:30% Triton-X100 1ml + 99ml0.1%柠檬酸钠。
4. 将0.3% Triton-X100放入修复盒中,将盒置入冰盒中,将爬片放入修复盒中孵育30分钟
5. PBS浸洗爬片3次,每次5分钟
6. 取出爬片,将PBS甩掉,擦净细胞周围的PBS,保持爬片上少量液体,但不能干片,擦一张爬片滴一张爬片,滴加0. 3%双氧水,孵育10分钟,
7. PBS浸洗3遍,
8. 取出爬片,将PBS甩掉,擦净细胞周围的PBS,保持爬片上少量液体,但不能干片,擦一张爬片滴一张爬片,滴加封闭血清,孵育15分钟
9. 甩掉封闭血清,吸水纸吸去爬片周围残留血清,滴加PBS稀释的一抗,保持液体集聚在爬片上而不外流,入湿盒中置4度冰箱孵育过夜,约16小时
10. 第二日取出湿盒置室温45分钟,
11. PBS浸洗3遍×5分钟
12. 取出爬片,将PBS甩掉,擦净细胞周围的PBS,保持爬片上少量液体,但不
能干片,擦一张爬片滴一张爬片,滴加二抗,孵育20分钟
13. PBS浸洗3遍×5分钟
14. 取出爬片,将PBS甩掉,擦净细胞周围的PBS,保持爬片上少量液体,但不
能干片,擦一张爬片滴一张爬片,滴加试剂C,孵育20分钟
15. PBS浸洗3遍×5分钟
细胞爬片he染色方法[整理版]
![细胞爬片he染色方法[整理版]](https://img.taocdn.com/s3/m/41258eed760bf78a6529647d27284b73f2423649.png)
细胞爬片HE染色方法
一、原理
苏木素（Hematoxylin）－伊红（Eosin）染色法，简称HE染色法。
HE染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别于细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折光率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像。该染色过程既有化学反应，又有物理作用参与。从化学反应看，组织细胞内含有酸性物质和碱性物质，细胞的酸性物质与碱性染料的阳离子结合，而细胞核的碱性物质与酸性染料的阴离子结合，使其中酸性细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，而碱性的胞浆被酸性染料伊红染成红色。其结果胞核呈蓝色，胞浆呈红色。从物理现象看，主要有吸附、吸收之说。HE 染色提供良好的核浆对比染色，是细胞化学染色最常用的一种方法。
二、实验用品
1、固定液：常用95％乙醇和冰丙酮
2、苏木精染液：称取苏木精粉0.5g，铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中，然后取NaIO 31g，
水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均匀，滤纸过滤，备用。
3、伊红染液：称取0.5g水溶性伊红染液，溶于100ml蒸馏水中。
4、稀盐酸乙醇溶液：用75%乙醇配制1％盐酸。
5、系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶。
6、培养瓶、培养皿、眼科镊、盖玻片、载玻片、显微镜。
三、实验步骤
1、样品制备：对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1×105/ml，滴加于盖
玻片上（置于6孔板中），培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS洗涤3次。
2、样品固定：95％乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次1mi n。
3、染核：苏木素染液染色2－3min，自来水洗涤。
细胞免疫荧光的方法(自己实践记录)
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：
1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟
3、4%的甲醛室温固定20-30分钟
4、1×PBS洗3次，每次10分钟
5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟
6、1×PBS洗3次，每次10分钟
7、5%BSA室温封闭30分钟
8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜
9、1×PBS洗3次，每次10分钟
10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光
11、1×PBS洗3次，每次10分钟
12、95%甘油封片
注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释
从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光
细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤
1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。
2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。
5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。PBS洗三次，每次5分钟。
6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。
7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。
8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。
9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min
11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。
12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。
稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。
淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)
另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。我没用淡氨水溶液。若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。
最新细胞免疫荧光的方法（自己实践记录）
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：
1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟
3、4%的甲醛室温固定20-30分钟
4、1×PBS洗3次，每次10分钟
5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟
6、1×PBS洗3次，每次10分钟
7、5%BSA室温封闭30分钟
8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜
9、1×PBS洗3次，每次10分钟
10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光
11、1×PBS洗3次，每次10分钟
12、95%甘油封片
注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释
从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光
细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
细胞爬片RNA FISH具体步骤及说明
细胞爬片RNA FISH具体说明及步骤
一、检测原理
RNA荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization），简称为RNA FISH，是一种重要的非放射性原位杂交技术。传统的RNA FISH，直接在oligos上标记荧光素，根据碱基互补配对原则，与待检测的RNA特异结合，通过荧光显微镜以检测荧光信号，该方法一般需要20个oligos以上，以便检测到较强较多的荧光信号点。本系统中SA（链霉亲和素蛋白）是一类四聚体蛋白，大小为66KDa，每一分子SA能够与四分子生物素进行高度特异性的结合，且两者之间的亲和力较强。应用该原理，我们将染料Cy3偶联到SA蛋白上，一分子SA能偶联上6个Cy3；同时在探针上标记生物素，将两者在体外进行亲和连接，大约每个SA能与4条oligo-Biotin结合，每个SA上有6个Cy3，也就是每一条探针上连接了6个Cy3，因此该方法具有一定的放大信号的作用
二、实验方法
贴壁细胞（以48孔板为例）
1.按照1×104细胞/孔的密度将贴壁细胞接种于48孔板（孔内提前放入已处
理好的且大小合适的盖玻片）中（建议事先铺在Confocal专用培养皿中），于培养箱中培养过夜；
2.吸弃培养基，PBS洗两次，每次5min；
3.吸弃PBS，每孔加入100μl 4%多聚甲醛，室温固定15min；
4.吸弃4%多聚甲醛，每孔加入100μl 0.5% Buffer A（现用现配）室温处理细
胞15min（细胞通透）；
5.吸弃0.5% Buffer A，PBS洗两次，每次5min；
细胞爬片 多重免疫荧光染色
细胞爬片多重免疫荧光染色
细胞爬片多重免疫荧光染色是一种常用的细胞学实验技术，用于研究细胞内蛋白质的定位、表达水平和相互作用等。在这种技术中，细胞首先被固定在载玻片上，然后通过特定的抗体和荧光染料来标记感兴趣的蛋白质。这种方法可以同时检测多种蛋白质的表达情况，并观察它们在细胞内的分布和相互作用关系。
在进行细胞爬片多重免疫荧光染色实验时，首先需要选择合适的细胞系或组织样本，并将其均匀地涂在载玻片上。接下来，使用适当的方法对细胞进行固定，通常使用乙醇或甲醛等化学试剂进行固定。然后，通过孔径较小的抗体，对感兴趣的蛋白质进行特异性的标记，常用的标记颜色包括荧光染料的绿色、红色和蓝色等。在染色完成后，可以通过荧光显微镜观察细胞内不同蛋白质的分布情况，通过不同波长的荧光信号来识别和定量感兴趣的蛋白质。
细胞爬片多重免疫荧光染色技术具有高灵敏度和高分辨率的优点，能够在单个细胞水平上对多种蛋白质进行定量和定位分析。这种技术在细胞生物学、免疫学和病理学等领域具有广泛的应用，可以帮助研究人员深入了解细胞内蛋白质的功能和相互作用机制，对于疾病诊断和药物研发具有重要意义。
总的来说，细胞爬片多重免疫荧光染色技术是一种强大的细胞学研究工具，可以帮助科研人员全面了解细胞内蛋白质的表达和分布情况，为细胞功能和疾病机制研究提供重要的信息。
细胞爬片多重免疫荧光染色
细胞爬片多重免疫荧光染色
细胞爬片多重免疫荧光染色是一种常用的技术，用于研究细胞的形态和分子表达。这种染色方法结合了多种抗体标记的技术，可以同时观察多个分子在细胞中的分布和相互作用。
在细胞爬片多重免疫荧光染色中，首先需要将细胞固定在载玻片上，并穿透性固定细胞膜，使得抗体可以进入细胞内部。接下来，使用特异性的抗体来识别和结合目标分子，这些抗体会被标记上荧光染料。不同的抗体可以使用不同颜色的荧光染料进行标记，从而使得在显微镜下观察时可以区分不同的分子。
通过细胞爬片多重免疫荧光染色，研究人员可以同时观察多个分子在细胞中的定位和相互作用。例如，可以观察细胞核中染色体的分布和蛋白质的定位，或者观察细胞膜上不同受体的分布和相互作用。这种技术可以帮助科学家更好地理解细胞的功能和调控机制。
细胞爬片多重免疫荧光染色的优势在于可以同时观察多个分子，并且可以使用不同颜色的荧光染料进行标记，从而使得观察结果更加清晰和准确。此外，这种技术还可以应用于临床诊断，例如观察肿瘤细胞中关键蛋白的表达和定位，从而帮助医生制定更精准的治疗方案。
细胞爬片多重免疫荧光染色是一种重要的技术手段，可以帮助科学家更好地理解细胞的结构和功能。通过这种方法，研究人员可以同
时观察多个分子在细胞中的定位和相互作用，从而揭示细胞内部复杂的生物过程和调控机制。这种技术在生命科学研究和临床诊断中具有广泛的应用前景。
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：
1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟
3、4%的甲醛室温固定20-30分钟
4、1×PBS洗3次，每次10分钟
5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟
6、1×PBS洗3次，每次10分钟
7、5%BSA室温封闭30分钟
8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜
9、1×PBS洗3次，每次10分钟
10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!!
11、1×PBS洗3次，每次10分钟
12、95%甘油封片
注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释
从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光
细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
细胞爬片免疫组织化学染色注意事项
此爬片由于该盖片 处理得不好,虽爬上 细胞但细胞的形态 很差,表现在细胞膜 和细胞器边界不清 晰
U251MG培养细 胞 (10hr)扫描电镜图
FN
Fra Baidu bibliotek
LN
BSA
FN +anti-Inβ1
LN +anti-Inβ1
5.悬浮细胞的处理
用甩片机将悬浮细胞甩在载片上；将合 适浓度的悬浮细胞涂在载片上。
三、讨 论
在试验过程中注意上述各步骤将为获得 一个满意的实验结果打下良好的基础。但是， 由于细胞爬片形态单一，不像常规的组织免 疫组化一样有内对照，因此，在观察实验结 果时，尤其要注意排除假阳性的可能，从而 获得一个真实、可靠的实验结果。
二、实验过程中应注意的一些问题
细胞载体的处理： 盖片和载片在接种细胞前一定要处理好， 不要怕麻烦。盖片和载片入酸前要将所附 着的脏东西洗干净。过蒸馏水和酒精时要 用镊子一片一片的过，平放在干净滤纸上 自然干燥。包装好后经烤箱干烤消毒保存。
2．细胞种植时应注意的一些问题：
选用何种载体：细胞在盖片和载片上一般4小时就 可以贴壁并开始生长，如果细胞贴壁后不需再进 一步处理，则可以将细胞爬在载片上，载片不用 消毒，也可以用DAKO笔在载片上画圈。用 DAKO笔划过圈的载片最好不要干烤消毒。细胞 帖壁后还要加药继续培养若干时间的则应选用盖 片爬片，这时盖片最好选用160度干烤消毒。
细胞免疫荧光染色步骤
细胞免疫荧光染色步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
第二天：
6. 加荧光二抗： PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBS浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBS 5min/次;4次洗去多余的DAPI；
8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
注意事项
1.取细胞爬片时，动作应轻柔，防止将细胞爬片夹碎，影响实验进程。
2.种细胞过程中，要注意将细胞轻柔混匀，“八”字或者“十”字形摇晃，防止细胞局部生长过密。
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免疫组化法：
1 胰酶消化细胞，收集至离心管；调整样本细胞数为1×106/ml；
2 将单细胞悬液滴加至平皿内无菌载玻片表面，置于37℃ 5%的加湿CO2孵箱中过夜，使细胞爬片。
3 吸弃平皿内培养上清，加入新鲜培养基，用无菌培养基洗3次；
4 PBS冲洗相应方案的载玻片3次；
5 将载玻片置于95%乙醇中固定约1h；
6 倒置相差显微镜下观察，并划定载玻片上细胞爬片密集区；
7 在相应区域滴加按一定比例稀释后一抗，4℃冰箱内过夜湿孵。阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。
8 先暂复温30min，后PBS冲洗载玻片3次；
9 滴加二抗，室温湿孵30min；后PBS冲洗载玻片3次；
10 DAB显色：将配置好的DAB溶液滴加至载玻片上，室温下孵育3min至载玻片略显黄色；
11 清水充分冲洗载玻片，苏木素复染核3-5min，清水冲洗，盐酸酒精分化20s，清水冲洗，氨水返蓝3min，清水冲洗，后置于75%-80%-95%-无水酒精中脱水，每步骤约2min；
12 将载玻片置于1、2、3道二甲苯中，各约15min，中性树脂封片，置于阴凉通风处风干。