少动鞘氨醇单胞菌ZX4儿茶酚2,3-双加氧酶基因的克隆与表达

摘
要 ：应 用 Ｐ Ｃ Ｒ方 法 克 隆 了少 动 鞘 氨 醇 单胞 菌 （ Ｓ ｐ ｈ ｉ ｎ ｇ ｏ ｍ ｏ ｎ ａ ｓ ｐ ａ ｕ ｃ ｉ ｍ ｏ ｂ ｉ ｌ ｉ ｓ ） Ｚ Ｘ ４菌 株 的儿 茶 酚 ２ ， ３ 一 双 加
氧酶基 因（ ｃ ２ ３ ０ 一 Ｚ Ｘ ４ ） 。核 苷 酸 序 列测 定 与 分 析 表 明 ， 该 基 因片 段 全 长 ９ ２ ４ ｂ ｐ且 具 有 一 个 完 整 的 阅读 框 ， 编 码 ３ ０ ６个 氨 基 酸 残 基 。该 基 因 与 已报 道 的 来 自菌 株 Ｓ ．ｙ ａ ｎ ｏ ｉ ｋ ｕ ｙ ａ ｅ Ｂ １和 Ｓ ｐ ｈ ｉ ｎ ｇ ｏ ｍ ｏ ｎ ａ ｓ ｓ ｐ 、Ｋ ＭＧ ４ ２ ５的 ｘ ｙ ｌ Ｅ基 因 （ 编码产物均 为 Ｃ ２ ３ ０） 具 有 较 高 的 核 酸 序 列 同源 性 ， 分别为 ９ ４ ． ３ ７ ％和 ９ ４ ． ０ ５ ％ 。 通 过 胁 Ⅲ 和 Ｘ ｈ ｏ Ｉ两 个 限 制性 酶 切 位 点 将 该 基 因连 接 到 质 粒 ｐ Ｅ Ｔ ３ ０ （ ａ ）＋上 得 到 重 组 表 达 质 粒 ｐ Ｅ Ｔ ． Ｓ ３ ， 并在 Ｅ ．ｃ ｏ ｌ ｉ Ｂ Ｌ ２ １进 行 了 表 达 ， 得 到了 ４ ２ ． ３ ｋ Ｄ 的融 合 蛋 白 。 酶 活 测 定 发 现 该 基 因工 程 菌 株 的发 酵 产 酶 活 力 明显 高 于 出发 菌株 。 关 键 词 ：菲 降 解 ；少 动 鞘 氨醇 单 胞 菌 ；儿 茶 酚 ２ ， ３ ． 双 加 氧 酶 基 因
少动鞘 氨醇 单 胞 菌 Ｚ Ｘ ４儿 茶 酚 ２ ， ３ 一 双 加 氧 酶 基 因 的 克 隆 与 表 达
周德 平 ，吴淑杭 ，闵 航 ，姜震 方
（ 上 海 市 农 业 科 学 院 环 境 科 学研 究 所 ， 上海 ２ ０ １ １ ０ ６ ； 浙江大学生命科学院 ， 杭州 ３ １ ０ ０ ２ ９ ）
中 图 分 类 号 ：ｘ １ ７ ２ 文 献 标 识 码 ：Ａ
芳 烃类 化合 物是 一类 环 境 中广泛 存在 的有 机 污染 物 ， 具 有致 癌 、 致 畸和 致 突 变 的特 性 ， 而儿 茶 酚 （ 亦
称 邻苯 二 酚 ） 则是 多 环芳 烃类 化合 物 降解过 程 中能被 开 环 的一个 关键 性 中间产 物 。儿 茶酚 ２， ３ 一 双 加 氧酶
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上海农业学报
２ ０ ０ ７ ， ２ ３ （ ２ ） ： ７—１ ０
Ａｃ ｔ ａ Ａｇｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｅ Ｓ ｈ ａ ｎ ｇｈ ａ ｉ
文章 编 号 ： １ ０ ０ ０ — ３ ９ ２ ４ （ ２ ０ ０ ７ ） ０ ２ － ０ ７ — １ ０
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 菌株 和质 粒 试 验 所 用 出发 菌株 Ｓ ．ｐ ａ ｕ ｃ ｉ ｍ ｏ ｂ ｏ ｌ ｉ ｓ Ｚ Ｘ ４系本 实 验室 筛 选得 到 ， 克 隆宿 主 菌 为 Ｅ ．ｃ ｏ ｌ ｉ Ｄ Ｈ ５ ｃ ｃ ； 克 隆载体 为 ｐ Ｇ Ｅ Ｍ— Ｔ Ｅ ａ ｓ ｙ Ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ （ Ｐ ｒ ｏ ｍ ｅ ｇ ａ公 司 产 品 ） ， 表达宿 主菌为 Ｅ ．ｃ ｏ ｌ ｉ Ｂ ［ ２ １及 表 达 载 体
ｐ Ｅ Ｔ 一 ３ ０ ａ （ ＋） 为Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ公 司产 品 。 １ ． ２ 工具 酶和 试剂 （ 盒） Ｈ ｉ ｎ ｄ ｌ ｌ Ｉ 和Ｘ ｈ ｏ Ｉ 限 制酶 均 购 自上 海生 物工 程 有 限公 司 。Ｇ ｅ ｎ ｏ ｍ ｉ ｅ Ｄ Ｎ Ａ ｍｉ ｎ ｉ ． ｐ ｒ ｅ ｐ Ｋ ｉ ｔ 为Ｖ ｉ ｔ ａ ｇ ｅ ｎ ｅ公 司产 品 。Ｑ Ｉ Ａ ｑ ｕ ｉ ｃ ｋ Ｇ ｅ ｌ Ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｋ ｉ ｔ 为Ｑ Ｉ Ａ Ｇ Ｅ Ｎ公 司产 品 。质 粒 提 取试 剂 盒 Ｗｉ ｚ ． ａ ｒ ｄ Ｐ ｌ ｕ ｓ Ｍ ｉ ｎ ｉ ｐ ｒ ｅ ｐ ｓ Ｄ Ｎ Ａ Ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｋ ｉ ｔ ， 连接试 剂 盒 ｐ Ｇ Ｅ Ｍ— Ｔ Ｅ ａ ｓ ｙ Ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ Ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ Ｉ以及 Ｐ Ｃ Ｒ试 剂盒 则均 为 Ｐ ｒ ｏ ｍ ｅ ｇ ａ公 司产 品 。
即变成 黄 色 ， 因而是 一种 很好 的选 择性 标记 。此外 ， 在 污 染 物 的分 子 监 测技 术 中还 可 通过 儿 茶 酚 ２ ， ３ ． 双
加 氧酶 基 因 （ ｃ ２ ３ ０ ） 含量 的检 测来 分 析某 一环 境受 多环 芳 烃 的 污染 程 度 ＇ 。本 试 验 分 离 到 １株 菲 降 解 菌株 ， 经鉴 定 为少动 鞘氨 醇单 胞 菌 ， 命名为 Ｓ ．ｐ ａ ｕ ｃ ｉ ｍ ｏ ｂ ｏ ｌ ｉ ｓ Ｚ Ｘ ４ ， 在 其 菲 降 解 过 程 中 检测 到 了 Ｃ ２ ３ ０ 的 活性 。本研 究进 一 步克 隆其 基 因并 在 大肠 杆 菌 中进 行 高效表 达 。
（ Ｃ ２ ３ ０） 由于能催 化 苯环 的邻位 裂 解 ， 故 和其 他 开环 酶一 起对 消 除芳烃 类化 合 物 的污 染具 有 重 要作 用 ， 编 码 此酶 的 ｘ ｙ ｌ Ｅ基 因最 早发 现 于恶臭 假单 胞 菌 （ Ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍ ｏ ｎ ａ ｓ ｐ ｕ ｔ ｉ ｄ ａ ） 的Ｔ Ｏ Ｌ质粒 ｐ ＷＷＯ上 ¨ 。Ｃ ２ ３ ０能 使 无色或 微棕 色 的儿 茶酚转 变 成黄 色 的 ２ 一 羟 粘糠 酸半 醛 ， 用 底 物儿 茶 酚 溶 液 喷射 产 该 酶 的 菌落 ， 菌 落可 立