单克隆抗体的制备流程

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单克隆抗体制备流程图

单抗制备流程

1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备

(一) 免疫方案

选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

初次免疫1×10７／ ip (腹腔内注射)

↓2～3周后

第二次免疫1×10７／ ip

↓3周后

加强免疫(融合前三天) 1×10７／ ip或iv(静脉内注射)

↓

取脾融合

2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般～1ml ／点)

↓3周后

第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

单克隆抗体的制备流程

（一）动物的选择与免疫

1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐

剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）

↓3周后

第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）

↓3周后

第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）

↓2～3周

加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）

↓3天后

取脾融合

目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

初次免疫1×107/0.5ml ip

↓2～3周后

第二次免疫1×107/0.5ml ip

单克隆抗体制备实验过程

一、免疫动物

免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。

PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。

2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。

3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。

二、细胞融合（Cell fusion）

【材料和试剂】

（1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。

（2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，•分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，

剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108个脾细胞。

单抗制备

杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：

（1）抗原制备；

（2）免疫动物；

（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；

（4）细胞融合；

（5）杂交瘤细胞的选择培养；

（6）杂交瘤细胞的筛选；

（7）杂交瘤细胞的克隆化；

（8）单克隆抗体的检定；

（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；

（10）单克隆抗体的大量制备。

下面简要介绍单克隆抗体的制备过程：

1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

2、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT 选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

单克隆抗体制备步骤及注意事项

一、脾细胞的准备：

1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。无菌操作取出脾脏，置于盛有

5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。

2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。

3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。再以同样的方法洗涤离心一

次。

4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液

备用。

注意事项：

➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

二、骨髓瘤细胞的准备：

1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。

2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。

3.制备细胞悬液，计活细胞数。

4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。

注意事项：

➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。

➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。

➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20%。细胞的最大密度不得超过106个/mL。

➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时。➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。

单克隆抗体技术操作流程

一、免疫原制备

免疫原是制备单克隆抗体的关键，它可以是蛋白质、多肽、病毒、细胞表面分子等。首先需要获得纯度高的免疫原，并进行适当的处理，如去除杂质、进行修饰等。接下来，将免疫原与适当的佐剂混合，以增强免疫原的免疫原性，如将免疫原与完全佐剂混合，然后注射到小鼠等实验动物体内。

二、免疫动物免疫

将制备好的免疫原注射到实验动物体内，激发其免疫系统产生抗体。通常情况下，需要多次免疫以增强免疫效果。在每次免疫后，需要采集动物的血清样本，检测抗体的产生情况。可以使用酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法对血清中的抗体进行检测。

三、细胞融合与筛选

当动物产生了满意的抗体效价后，需要从其脾脏等淋巴组织中获得抗体产生的细胞。将脾脏细胞与骨髓瘤细胞（如NS-1细胞）进行融合，形成杂交瘤细胞。融合后的细胞具有双亲细胞的优点，既能产生抗体，又具有无限增殖的能力。

为了筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞，通常需要进行限稀稀释、酶标记法、细胞毒性试验等步骤。其中，限稀稀释法是最常用的筛选方法，通过将杂交瘤细胞逐级稀释，最终得到单个细胞的克隆。

然后，将这些单克隆细胞扩大培养，并对其产生的抗体进行筛选和鉴定。

四、抗体纯化与鉴定

通过培养和扩增单克隆细胞，可以得到大量的单克隆抗体。接下来，需要对抗体进行纯化和鉴定。纯化可以使用各种离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等技术，去除杂质，得到纯度较高的抗体。

鉴定抗体的特异性和亲和力是非常重要的步骤。特异性可以通过免疫印迹、免疫组化等方法进行检测，判断抗体是否能够特异性地结合目标抗原。亲和力可以通过表面等离子共振（SPR）等技术进行测定，评估抗体与抗原的结合强度。

单克隆抗体的制备过程及原理

单克隆抗体（monoclonal antibody，简称mAb）是指使用浓度较高的、单种类且结构恒定的抗体，它是具有特定抗原性和可重复使用的特殊免疫球蛋白分子。单克隆抗体由于

特异性、可重复使用、界限清晰等具有重要的理论意义和重要的经济意义，在生物分子的

研究、疾病的检测和治疗中已经发挥出重要作用。

单克隆抗体制备的方法有奥托尔·米勒法、佩泰法和融合细胞法等。其制备过程通常

包括以下7个步骤：生物反应物的提取、细胞培养，抗体浓度的上升、表达工艺的改进、

纯化工艺的筛选、反应物的表达和功能检测。

（1）生物反应物的提取。抗体制备过程的第一步是提取有用的生物反应物，例如鼠、猴、牛等动物的血液或淋巴液中的B细胞，或者细菌中的免疫球蛋白定量因子（immunoglobulin，Ig）分子等。

（2）细胞培养。细胞培养就是将这些细胞表现成抗体制备所需的反应物，而培养方

法又分为实验室筛选（laboratory selection）和大规模培养（large-scale production）。

（3）抗体浓度的上升。在细胞培养过程中，抗体浓度也会随着增加，完成这一步后

可以得到单克隆抗体。

（4）表达工艺的改进。表达工艺是抗体分离纯化的关键步骤。一般来说，可以采用

谷氨酸免疫池（Glu-immune pool）、数字筛选技术（digital selection）、高通量测序

技术（high-throughput sequencing）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等方法来筛选合适的抗体表达体。

单克隆抗体的制备过程

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

制备过程

1、免疫动物

免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

2、细胞融合

采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融

合，形成杂交瘤细胞。

3、选择性培养

选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化

在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

单克隆抗体的主要步骤

单克隆抗体的制备主要分为以下几个步骤：

首先，选定合适的抗原并进行免疫，采集含有抗原特异性淋巴细胞的动物脾脏。运用免疫规划原则，通过周期性注射抗原刺激动物的免疫系统生成大量特异性B

淋巴细胞。

其次，通过粘膜炎症急性期反应融合技术，将抗原特异性B淋巴细胞和肿瘤细胞进行融合，得到的细胞即为混源杂交瘤细胞。

然后，对获得的杂交瘤细胞进行筛选，挑选出能稳定分泌目标抗体的杂交瘤克隆。利用ELISA、FACS等方法，能对杂交瘤筛选进行优化。

接着，研究人员会对所选克隆进行鉴定，了解其分泌的抗体与抗原的亲和力。结合测序和质粒制备，进一步明确杂交瘤克隆的免疫学特征。

随后，利用无菌操作技术进行体外扩增和冻存，保证抗体质量的稳定。

最后，通过体内成瘤或者体外不系细胞培养的方式进行大量抗体生产，然后提取，纯化单克隆抗体。密集摇瓶和生物反应器培养技术是临床试验阶段常用的抗体生产策略。

单克隆抗体的研究和生产是一个复杂且需要精细操作的过程，旨在通过这些步骤高效、可靠地生产出具有特异性的单克隆抗体。对于抗体药物研发、生物技术、诊断试剂等领域，具有不可替代的重要价值。

综述单克隆抗体的主要步骤

单克隆抗体是一种可以特异性识别并结合抗原的免疫蛋白，可以被广

泛应用于医学诊断、治疗和研究等领域。单克隆抗体的制备是一个复杂的

过程，包括以下主要步骤：免疫原制备、细胞融合、筛选和鉴定、生产和

纯化。

首先，制备免疫原是制备单克隆抗体的第一步。免疫原可以是多肽、

蛋白质、细胞、细胞器或生物大分子等。在这个步骤中，免疫原需要经过

一系列处理，如纯化、浓缩、变性等，以提高其免疫原性。

接下来，将免疫原注射到小鼠或其他动物的体内，以激发其免疫系统

产生抗体。通常情况下，免疫过程需要重复多次，以增加抗体的产生。一

般来说，免疫过程分为初次免疫和再次免疫。

获得免疫动物后，从其体内获得免疫细胞作为原始免疫细胞。接下来，将这些免疫细胞与癌细胞（如骨髓瘤细胞）融合，形成杂交瘤细胞。

融合细胞后，需要进行筛选和鉴定。这个过程旨在鉴定并筛选出能够

产生特异性抗体的杂交瘤细胞。一种常用的方法是酶联免疫吸附试验（ELISA），通过与免疫原结合来筛选出高亲和力的单克隆抗体。

通过限稀稀释法、固相筛选法或细胞流式术等鉴定方法，确定哪些杂

交瘤细胞产生了具有期望效果的单克隆抗体。

得到合适的单克隆抗体后，需要进行大规模的生产和纯化。生产单克

隆抗体通常使用无脊椎动物细胞（如昆虫细胞）或哺乳动物细胞进行工程

表达。合适的表达系统可以确保抗体的高效表达和抗体质量的稳定性。

在生产过程中，需要对培养条件、培养基、收集工时等进行优化，以

确保单克隆抗体的高产量和高质量。随后，通过多种纯化方法（如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析）对抗体进行纯化，去除杂质和冗余物质。

单克隆抗体的制备流程

（一）动物的选择与免疫

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐

剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）

↓3周后

第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）

↓3周后

第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）

↓2～3周

加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）

↓3天后

取脾融合

（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

初次免疫1×107/0.5ml ip

↓2～3周后

第二次免疫1×107/0.5ml ip

单克隆抗体的制备

Western blot 实验步骤
• 1. SDS-PAGE 蛋白电泳 • 2. 转膜 • 3. 封闭 • 4. 一抗反应 • 5. 洗膜 • 6. 二抗反应 • 7. 洗膜 • 8. 底物现色 • 9. 中止反应
免疫胶体金技术（immuno-colloidal gold technology）
其它免疫技术
• 放射免疫技术 • 免疫荧光技术 • 免疫共沉淀技术
• 自从ELISA方法建立之后，在应用于植物病毒的检测过程中又有了很多的改进。介绍常用的几种ELISA方法。
常用的几种ELISA方法
• 1）直接ELISA：待测抗原直接包被塑料微量滴定板，然后加入抗原特异性的酶-特异性抗体偶联物。因为所用的酶已经标记在特定的抗体上，可检测的病毒种类只能局限于某一种。
7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定
• 将单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C 小鼠IgA, IgG1,IgG2a, IgG2b、IgG3,IgM抗体，作双向琼脂扩散试验。
• ELISA方法
• 用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，腹水效价在10－5―10－7之间的可用于实际应用。
• 1971年Engvall和Perlman 第一次建立了 ELISA检测方法，使对抗原和抗体的检测和定量可以通过简单的颜色反应实现（Engvall & Perlman，1971），是目前检测中应用得最多的方法，它把抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机地结合在一起。与其他血清学方法相比，该方法具有灵敏度高（1-20 ng）、操作简单、特异性好、安全并可同时检测大批量样品的优势。

单克隆抗体的制备流程

（一）动物的选择与免疫

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐

剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）

↓3周后

第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）

↓3周后

第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）

↓2～3周

加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）

↓3天后

取脾融合

（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

初次免疫1×107/0.5ml ip

↓2～3周后

第二次免疫1×107/0.5ml ip

单克隆抗体的制备过程

单克隆抗体的制备过程包括鉴定抗原、免疫动物、制备抗体、纯化抗体和评价抗体等步骤。

鉴定抗原：鉴定抗原是单克隆抗体的制备过程中的第一步，需要确定免疫动物对抗原的反

应性。

免疫动物：免疫动物是单克隆抗体的制备过程中的第二步，需要选择具有良好免疫反应的

动物。

制备抗体：制备抗体是单克隆抗体的制备过程中的第三步，需要将抗原注射到免疫动物体内，以诱导动物产生抗体。

纯化抗体：纯化抗体是单克隆抗体的制备过程中的第四步，需要对制备的抗体进行纯化，

以得到高纯度的抗体。

评价抗体：评价抗体是单克隆抗体的制备过程中的第五步，需要对纯化的抗体进行评价，

以确定其性能。

单克隆抗体制备流程图

单抗制备流程

一、细胞融合前准备

(一) 免疫方案

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)

↓2～3周后

第二次免疫1×10７／0.5ml ip

↓3周后

加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)

↓

取脾融合

初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)

↓3周后

单克隆抗体制备流程图

单抗制备流程

1975年,Kohler与Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤,下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备

(一) 免疫方案

选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1、颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

初次免疫1×10７／0、5ml ip (腹腔内注射)

↓2～3周后

第二次免疫1×10７／0、5ml ip

↓3周后

加强免疫(融合前三天) 1×10７／0、5ml ip或iv(静脉内注射)

↓

取脾融合

2、可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂,常用佐剂:福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂。要求抗原与佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般0、8～1ml 0、2ml／点)

↓3周后