生化分析与技术

拟南芥psrp．3基因的PCR

扩增与生物信息学分析

拟南芥psrp．3基因的PCR扩增与生物信息学分析

[摘要] 采用PCR法获得拟南芥叶绿体核糖体psrp．3基因序列并进行生物信息学分析．根据psrp．3基因序列保守区设计2对引物，通过RT-PCR获得预期大小的基因序列，琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段．利用生物信息学软件对拟南芥psrp．3基因序列进行同源比对、氨基酸组成、功能域、二级结构、疏水性、蛋白质功能及系统进化分析和预测．结果表明，RT-PCR获得了一段753 bp的序列，psrp一3蛋白是等电点为9．27的亲水性稳定蛋白，包含一个结构域和一个区域，a螺旋和不规则卷曲是其蛋白质二级结构的主要结构元件，p折叠和伸展链散布其中，和菠菜、葡萄、蓖麻、大豆等的psrp．3蛋白有较高的同源性．为进一步了解psrp．3基因的功能和作用机制打下基础．

[关键词]拟南芥；叶绿体；psrp一3基因

引言

叶绿体是植物细胞和真核藻类的重要细胞器，是植物进行光合作用的场所．叶绿体是半自主性细胞器，具有自身独立的遗传体系和蛋白质合成的全套机构，包括核糖体．叶绿体基因组是植物基因工程研究的热点u剖．至2006年底，已经公布了包括不同物种的叶绿体基因组数据82组，这其中包括同一个种的不同亚种∽J．研究发现，叶绿体70S核糖体含有58。62个核蛋白，其中约有2／3由核基因组编码，其余1／3由叶绿体基因组编码…1．虽然组成叶绿体的绝大多数蛋白质都是来自细胞质，但目前在各种植物的叶绿体中已确定了20个电子传递和光合固碳的基因：编码RuBP羧化酶的大亚基，Ps I的2个亚基，PsⅡ的8个亚基，A TP合成酶的6个亚基，细胞色素b／f复合物的3个亚基，这些都是叶绿体核糖体所合成的重要蛋白质∞剖．因而，研究叶绿体核糖体的重要基因，不仅可以在分子水平上阐明

蛋白质之间的相互作用、光合作用各过程的调控，而且可以了解叶绿体的起源与进化、核质互作关系．在叶绿体核糖体中存在着6个特殊的蛋白质(质体特异性核糖体蛋白，plastid．specific ribosomalpro．teins，psrps)，它们都是由核基因编码．其中，psrp—l，psrp-2，psrp．3，psrp-4位于30S小亚基上，psrp-5，psrp-6位于50S大亚基上b4J．叶绿体核糖体只负责合成叶绿体DNA编码的不到一百个多肽，但是其中却包括一些在生物圈中含量最丰富的蛋白质．因而，叶绿体核糖体必须能够维持一个比较高的蛋白质合成率，并且必须具备响应光强度的变化而改变蛋白质合成速率的机制．为了满足光合成蛋白质的需要和核糖体功能的协调，在长期的进化过程中，叶绿体转录翻译发展了大量叶绿体特异的调控元件．定位于核糖体的psrps，就是这样的一套调控元件．psrps可能以总体的形式参与叶绿体中蛋白质合成调控，但目前作用机制并不清楚．

Psrp-3基因在拟南芥存在两个同源基因，分别位于染色体I和染色体V(A TlG68590，AT5G15760)上．ATlG68590可以表达，AT5G15760不转录，有可能是伪基因或沉默基因，只在特殊条件下才会表达怕J．psrp．3基因所编码的psrp．3蛋白存在两种形式，一种是N．末端经过翻译后修饰，一种未修饰．这两种形式之间的比率是否固定目前尚不清楚，很可能依据光照强度和光照时间的改变而变化【3,6]．psrp．3蛋白质参与光介导的叶绿体蛋白合成，但其在光介导蛋白合成中的具体功能及作用机制，迄今尚无研究报道．

1材料与方法

1．1材料

1．1．1植物材料

拟南芥(Arabidopsis thaliana

ecotype Columbia)Columbia生态型(col一0)．培养条件：光照强度I>3 000 Ix，光暗周期为12 h／12 h，温度为(25±1)℃，相对湿度约70％．生物信息学分析以NCBI数据库中的拟南芥psrp-3基因(ATl G68590)作为研究对象．

1．1．2茵株和质粒

大肠杆菌JMl09、质粒pBIl21载体由南京中医药大学第--I临i床学院针药结合实验室保存．1．1．3试剂及工具酶TaqDNA聚合酶、反转录酶、dNTP、OligadT等购自宝生物工程(大连)有限公司和上海生工生物公司，DNA分子Marker、DNA回收试剂盒、琼脂糖等其他相关生化试剂购于上海生工生物公司．引物由大连宝生物公司合成．

1．2方法

1．2．1拟南芥总RNA提取

用Tfizol试剂法提取叶片总RNA：将0．3 g叶片放在180℃热处理过的研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末，然后将粉末放入装有l mLTrizol试剂的Eppendorf管中．用宝生物公司提供的RNAiso Reagent试剂盒提取总RNA，经琼脂糖电泳检测总RNA质量．

1．2．2引物设计与psrp-3基因的RT．PcR扩增反应

根据GenBank已登录的拟南芥psrp．3基因序列(A TlG68590)，设计合成引物【10]．并根据植物双元载体pBIl21的多克隆酶切位点，分别设计2条含有Sac I和XbaI限制性内切酶位点的PCR引物．上游引物R：5’．CGTCCA7唧AGACAcAAAA7rCTCCA田GT形硼盼3’，下游引物L：5 7．A’rCGAGAGCTCAA CI’cAGAGTrGCI'IGATG'IqqB3’．以拟南芥RNA 为模板，R和L为引物，进行RT-PCR扩增．在PCR管中加入总RNA 8皿，Oligo dT 2皿置于70℃5 min，然后放于冰上；再依次加入5 x Buffer 4 gL，10 mmol／L dNTP 2ttL，AMV l汕，RNase Inhibitor 1肚，42℃放置60 min，冰上冷却，产物置于70℃保存．50μL PCR 反应体系为：Ex-Taq25μL，cDNA2μL，引物R和L各1μL，去离子水补至50μL．反应条件为：预变性94℃，2 rain；循环参数，94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，1 min 30 s；循环数35；最后延伸，72℃，5 min；4℃保存．PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下