PCR技术及实用方法

分子植物育种实验室方法(二)

M ETHODS IN LAB OF MOL ECULAR PLAN T BREEDIN G (2)

PCR 技术及实用方法

郑景生1,2　吕蓓1

1海南省农作物分子育种重点实验室,三亚,5720252福建省农业科学院稻麦研究所,福州,350019

摘要

本文系统介绍了PCR 技术的原理,反应组分、反应程序及PCR 产物的电泳检测方法。这些实用的PCR 方法大都来源于国内外一些著名的实验室并经海南省农作物分子育种重点实验室改进而成。这些方法作为分子植物育种实验室的技术平台具有非常好的实用性,能满足常规的分子生物学及生物工程技术研究的要求。

关键词

PCR 技术,分子植物育种

PCR Technique and its Practical Methods

Zheng Jingsheng 1,2　L üBei 1

1Hainan Provincial Key Laboratory of Crop Molecular Breeding ,Sanya ,572025

2The Institute of Rice &wheat ,Fujian Academy of Agricaltural Sciences ,Fuzhou ,350019

ABSTRACT

This paper introduced PCR principles ,reaction components ,reaction programs and electrophoresis detecting techniques 1All of the practical protocols were derived from many famous domestic and international laboratories and modified by Hainan Provincial K ey Laboratory of Crop Molecular Breeding (HiCMBL )1It has more beneficial to adapt those protocols as technology platform in the lab of molecular plant breeding due to its good practicability ,which could meet the demands of the researches in fields of molecular biology and biotechnology 1

KEYWORDS

PCR ,Practical method ,Molecular plant breeding

1前言

PCR ,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR )是1985年由美国PE 2Cetus 公司

的科学家Kary Banks Mulis 发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的技术。这项新技术

是根据生物体内DNA 序列能进行快速复制的某些

特点,实现在体外对特定DNA 序列进行快速扩增,可在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA 序列拷贝。PCR 技术操作简便、结果可靠,并被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析,对分子生物学的发

分子植物育种,2003年,第1卷,第3期,第381—394页Molecular Plant Breeding ,2003,Vol 11,No 13,381—394　

展产生了革命性的影响。发明人Kary Banks Mulis 也因此荣获1994年度诺贝尔化学奖。

PCR 技术的原理是:DNA 聚合酶以单链DNA 为模板,借助一小段双链DNA 来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。在适宜的温度和环境下,DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3’-OH 末端,并以此为起始点,沿模板5’→3’方向延伸,合成一条新的DNA 互补链。PCR 反应的基本成分包括:模板DNA (待扩增DNA )、引物、4种脱氧核苷酸(dN TPs )、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。

PCR 反应中,通过双链DNA 的高温变性(denaturation )、引物与模板的低温退火(anneal 2ing )和适温延伸(extension )这三步反应反复循环。每一循环中所合成的新链,又都可作为下一循环中的模板。PCR 合成的特定的DNA 序列产量随着循环次数呈指数增加,从而达到迅速大量扩增的目的。

2PCR 反应基本成分

211模板DNA

PCR 反应的模板可以是单链或双链DNA ,可

以是基因组DNA 或cDNA ,mRNA 也可作为PCR 的模板,只需用逆转录酶把mRNA 逆转录为cD 2NA 即可。由于PCR 反应的特异性由寡聚核苷酸引物决定,模板DNA 不需要高度纯化,但应避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、能结合DNA 的蛋白质及多糖类物质的污染。选用纯化的DNA 做模板,可增加模板分子的浓度,除去可能抑制PCR 反应的杂质如SDS 会严重抑制Taq DNA 聚合酶的活性,可显著提高PCR 扩增的有效性。通常,模板DNA 保存于10mmol/L Tris 2HCl (p H716)、011mmol/L ED TA (p H810)缓冲液中。

PCR 所需模板DNA 的量极微(通常在纳克级范围内),通常适宜的模板DNA 浓度为30-50ng ,不到1纳克的基因组DNA 序列就足以用来进行PCR 分析,甚至用1个DNA 分子就能扩增出特定的DNA 序列。利用PCR 技术可以从石蜡包埋40多年的宫颈癌活检组织中检测出人乳头瘤病毒(HPV )DNA ,可以用多年前的血斑分析苯丙酮尿症,甚至从几千年的埃及木乃伊中分离出来的

DNA 也可用作PCR 反应的模板。

212引物

PCR 引物是一段与待扩增的目标DNA 序列侧

翼片段互补的寡核苷酸片段,长度大多为10-30个碱基。通常,一对引物包含5’端与正义链互补的寡核苷酸片段和3’端与反义链互补的寡核苷酸片段,这两个寡核苷酸片段在模板DNA 上的结合位置之间的距离决定PCR 扩增片段的长度。

根据统计学计算,长约17个碱基的寡核苷酸序列在人类基因组中可能出现的概率为1次。因此,只要引物不少于16个核苷酸,就能保证PCR 扩增序列的特异性。引物过长往往会降低其与模板的杂交效率,从而减低PCR 的反应效率。

PCR 反应成功的关键是设计最佳的引物。引物设计的先决条件是与引物结合的靶DNA 序列必须是已知的,与两个引物结合的序列之间的靶DNA 序列则未必清楚。设计引物时应尽可能选择碱基随机分布的序列,尽量避免多嘌呤、多聚嘧啶或其他异常序列。两个引物中G +C 碱基对的百分比(G +C %)应尽量相似,若待扩增序列中GC 含量已知时,引物的GC 含量则应与其类似。

一般情况下,设计引物时,G +C 碱基对含量以40%-60%为佳,解链温度(melting temperature ,Tm )高于55℃。避免引物自身形成发夹结构等二级结构,尤其是。两个引物之间不应存在互补序列,尤其是在引物的3’末端,即使无法避免,其3’端的互补碱基也不能多于2个,以减少“引物二聚体”的形成。否则会影响靶DNA 序列的扩增。在合成新链时,DNA 聚合酶将单核苷酸添加到引物的3’末端,因此引物3’端的5-6个碱基与靶DNA 片段的配对必须精确、严格。

简并引物是由多种寡核苷酸片段组成的混合物,彼此间有一个或数个核苷酸差异。简并引物的设计是通过对氨基酸序列或对相关基因的同源序列的推测进行的(陆德如等,2002)。通常一条引物中的简并碱基不能超过4处,简并碱基数过多,会造成反应体系中有效引物量相对较少,而增加引物的使用量,易引起非特异性扩增。简并引物与模板错配产生的非特异扩增可通过提高退火温度或“热起动”方法来克服。

由于引物设计涉及的因素较多,因此常场借助PCR 引物设计软件如PCGEN E 、DNAMan 进行辅助设计,然后由专业的生物技术公司用DNA 合

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分子植物育种

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