甲醇营养型酵母高密度培养过程中甲醇和乙醇的GC快速检测
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第 31 卷 第 2 期 2001 年 6 月
工 业微 生 物
Industrial M icrobiology
V ol. 31 N o. 2 June. 2001
甲醇营养型酵母高密度培养过程中 甲醇和乙醇的 GC 快速检测
邓兵兵, 方宏清, 薛 冲, 赵洪亮, 刘志敏*
( 军事医学科学院生物工程研究所, 北京 100071)
样品处理简单, 对萃取时间无严格要求; 稳定性、重 现性好; 操作简便, 可同时测定甲醇和乙醇的含量, 测定耗时少; 并可使用分析纯试剂, 成本低廉, 很适 合用于发酵过程的实时控制。而快速灵敏的分析方 法对甲醇营养型酵母工程菌高密度高表达发酵条件 的过程优化至关重要, 对发酵液中甲醇、乙醇浓度进 行适当控制, 既能满足酵母生长及目的基因表达的 需要, 又能尽可能地减少抑制细胞生长和基因表达 的因素, 有效地提高目的蛋白的产率, 在我们的发酵
0、5. 0、6. 0、8. 0、10. 0 ( mg/ ml) 的标准水溶液。取 Ce( mg/ ml) = 11. 569A e/ A p ( 2) R= 1. 000
0. 9ml 甲醇或乙醇 标准溶液, 加入 0. 1ml 64mg/ ml Cm、Ce: 样品中甲醇乙醇浓度
正丙醇溶液, 混匀后用 1ml 正丁醇萃取 5min, 取 0. Am、Ae: 甲醇乙醇色谱峰的积分面积
27
第2期
工业微生物
第 31 卷
谱分析, 正丁醇萃取时间分 别为 5、15、30m in, 结果 如表 1。由表可知, 萃取时间 在 30min 之内 对测定
结果无显著影响。本实验萃取时间采用 5~ 10min。
图 5 甲醇测定标准工作曲线
图 6 乙醇测定标准工作曲线
表 1 正丁醇萃取时间的研究
样品( mg/ mL)
2. 4 方法重现性的研究
方法进行 3 次重复实验, 结果如表 2。由表可知, 与
对样品 A、甲醇标准液 D( 6mg/ m L) 、乙醇标准 国外同类文献相比, 本方法重现性较好。
液 E( 5mg/ m L) 、发酵液上清样品 F 、G, 分别按上述
表 2 甲醇和乙醇测定的重现性研究
样品( mg/ mL)
摘 要 采用气相色谱法( GC) 快速检测甲醇营养型酵母发酵液中的甲醇、乙醇含量, 具有样品处 理简便, 测定时间较短, 结果重现性好的特点。在 1~ 10mg/ mL 范围内具有很好的线性关系。在 毕赤酵母高密度高表达发酵过程中应用此法对甲醇和乙醇进行实时监控, 细胞终密度超过 300g/ L ( 干重) 。本方法为甲醇营养型酵母工程菌的发酵中试工艺研究提供了重要的发酵生化参数。 关键词: 气相色谱; 甲醇营养型酵母; 甲醇; 乙醇
传统的甲醇测定方法有比色法、酶动力学法等, 随着色谱技术的发展, 气相色谱法成为快捷、简便的 甲醇测定方法[ 3, 4] 。本文采用毛细管色谱柱和气相 色谱法, 研究了同时快速检测甲醇营养型酵母发酵 液中甲醇和乙醇含量的方法, 并已用于 5L 罐重组 毕赤酵母高密度发酵过程, 取得了令人满意的结果。
0
平均值 ( mg/ mL)
3. 6794 2. 7056 0. 9912 0. 0339 1. 8697
-
SD
0. 04024 0. 01392 0. 01675 0. 00074 0. 09802
-
CV( % )
1. 0937 0. 5144 1. 6901 2. 1777 5. 2423
-
注: S D 为标准偏差; CV 为相对标准偏差, 即变异系数。
第2期
邓兵兵, 等: 甲醇营养型酵母高密度培养过程中甲醇和乙醇的 GC 快速检测
第 31 卷
气相 色 谱 仪: HP GC4890; 色 谱 柱: HP - INNOWAX 250mm 0. 25mm; 载 气: 高纯氮 气; 载 气 流速: 1mL / min; 检测器: F ID; H 2 流速: 30 mL/ min; 进样方式: 分流; 分流比: 50 1; 炉温: 程序升温, 初始 温度 60 , 停留 1min, 20 / min 升至 100 , 10 / min 升至 160 , 停留 1m in, 共 10m in。 1. 5 样品制备
注: 由上而下为图 1~ 图 4
图 1 发酵液上清+ 正丁醇
图 2 发酵液上清+ 正丁醇+ 甲醇
来自百度文库
图 3 发酵液上清+ 正丁醇+ 甲醇+ 乙醇 图 4 发酵液上清+ 正丁醇+ 甲醇+ 乙醇+ 正丙醇
2. 2 工作曲线的确定
理, 所得标准曲线方程如( 1) 和( 2) :
用色谱纯甲醇、乙醇配成浓度为 0、1. 0、2. 0、4. Cm( mg/ ml) = 23. 881Am/ Ap ( 1) R= 1. 000
3. 0063
-
3结 论
在本方法研究中我们还考虑了用氯仿和乙醚 作溶剂。分析纯氯仿中杂质多, 出峰复杂, 且含有乙 醇; 分析纯乙醚中虽然杂质少, 出峰单一, 但它对甲 醇的萃取量比正丁醇低得多, 且考虑到其挥发性强, 操作时用量易发生变化, 因此选择正丁醇作溶剂。
本方法能快速测定巴斯德毕赤酵母发酵液中 甲醇和乙醇的含量, 不受发酵液中其它成分的干扰;
甲醇
A
乙醇
甲醇
B
乙醇
甲醇
C
乙醇
5 3. 7254 2. 7199 1. 0078 0. 0336 1. 9826
0
萃取时间( min) 15
3. 6514 2. 6921 0. 9743 0. 0333 1. 8067
0
30 3. 6610 2. 7048 0. 9915 0. 0347 1. 8197
甲醇
A
乙醇
D
5. 8574
E
乙醇
甲醇
F
乙醇
甲醇
G
乙醇
1# 3. 7254 2. 7199 5. 9580 4. 9255 10. 9700
0 2. 2943
0
测定序号 2#
3. 6538 2. 6701 5. 8017 4. 9722 11. 0773
0 2. 1905
0
3# 3. 6777 2. 6801 5. 8715 4. 8950 11. 0469
0 2. 0860
0
平均值 ( mg/ mL)
3. 6856 2. 6900 0. 07922 4. 9309 11. 0314
2. 1903
-
SD
0. 03645 0. 02634 1. 3493 0. 03888 0. 04508
0. 06585
-
CV( % )
0. 9891 0. 9793
0. 7885 0. 4086
酵母表达体系作为一种外源基因表达系统, 既 有原核生物那样生长、繁殖快速, 表达量高的特点, 又有与高等真核生物十分相象的蛋白质翻译后加工
和基因表达调控的特征, 近年来越来越受到人们重 视[ 1] 。尤其是甲 醇营养 型酵母 巴斯 德毕赤 酵
母( Pichia p ast ori s ) 、多 形 汉 逊 酵 母 ( H ansenula p oly morp ha) 和博伊丁假丝酵母( Candida boidi nii ) 等更是近年迅速发展的几种表达宿主系统, 它们有 许多优点: 含有诱导型强启动子, 用甲醇可以严格 地诱导表达调控。 外源蛋白 可以分泌到培 养基 中, 有利于维持其天然构象及生物活性。 生存能 力强, 生物量大, 表达水平较高, 培养基成本较低廉, 发酵工艺成熟, 可以实现高密度培养, 细胞干重可达 100 g/ L 以上, 易于进行工业化大规模生产。
1 材料与方法
1. 1 试剂 甲醇为色谱纯, 乙醇、正丁醇、正丙醇、氯仿、乙
醚、乙酸乙酯和异丙醇为分析纯。 1. 2 菌种
毕赤酵 母 GS115: pPIC9- hNGF, 由本 实验室 构建。 1. 3 发酵条件
Biostat B5 发酵罐( B. Braun Biotech Int ernat ional) , 计算机在线控制溶氧、温度、转速和 pH 值, 利用 BT 00- 100M 型兰格蠕动泵控制甲醇、甘油等的补 料速率。 1. 4 色谱条件
军事医学科学院科技创新研究基金资助项目 作者简介: 邓兵兵( 1969~ ) , 女, 助理研究员。
26
* 通讯作者: 刘志敏
恰当时, 发酵液中甲醇的残留量更易积累至毒性水 平。所以也必须通过测定甲醇的量来及时调整其流 加速率, 使甲醇浓度维持在适当的水平, 通常为 0. 2% ~ 0. 8% ( v/ v) [ 2] 。总之, 实时监控发酵液中甲醇的含 量是甲醇营养型酵母发酵过程中不可缺少的条件。 在毕赤酵母高密度发酵过程的后期, 我们发现有少量 的乙醇积累, 其作用还不甚明确, 但过高的乙醇含量 可能会对目的基因的表达产生抑制作用。
6 L 进样分析。分别以甲醇或乙醇浓度为横坐标, Ap: 正丙醇色谱峰的积分面积
以甲醇峰面积或乙醇峰面积与正丙醇峰面积的比值 2. 3 正丁醇萃取时间的研究
为纵坐标, 绘制工作曲线, 结果见图 5~ 图 6。将得
取样品 A( 含 3. 6mg/ m L 甲醇和 2. 7mg/ mL 乙
到的结果用 SPSS 软件 进行过零 点的线 性回归 处 醇的水溶液) 以及发酵液上清样品 B, C 进行气相色
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第2期
邓兵兵, 等: 甲醇营养型酵母高密度培养过程中甲醇和乙醇的 GC 快速检测
第 31 卷
实践中也证实了这一点。目前, 该方法用 于 5L 罐 重组毕赤酵母高密度发酵过程中, 能使细胞生长状 况良好, 终密度已超过 300g/ L ( 干重) , 目的蛋白产 率超过克级水平。因此, 本方法为甲醇酵母工程菌 的发酵中试工艺研究提供了重要的发酵生化参数。
参考文献
[ 1 ] James M . Cregg, Thomas S. Vedvick and W illiam C. Raschke.
Recent advances in the expression of foreign genes in Pichis pastoris. [ J] Bio/ Technology, 1993, 11( 8) : 905 [ 2] StrattonJ, Chiruvolu V, M eagher M . High cell- density fermentation. M ethods M ol Biol, 1998, 103: 107 [ 3 ] Toshio Kawai, et al. Simple method for determ ination of methanol in blood and its application in occupational health. Bull. Environ. Contam. Toxicol, 1991, 47: 797 [ 4 ] Gary M . Pollack and Jodi L. Kaw agoe. Determination of methanol in w hole blood by capillary gas chromatography w ith d-i rect on - column injection. Journal of Chromatography, 1991, 570: 406
0. 9mL 发酵液上清样品加入 0. 1mL 8mg/ mL 正 丙醇, 用 1mL 正丁醇萃取 5~ 10min, 0. 6 L 进样。
2 结果与讨论
2. 1 内标的选择
由于在制备过程中样品萃取的不完全性以及溶 剂正丁醇的挥发性会引起样品定量测定的误差, 因 此采用内标法。经实验, 从正丙醇、异丙醇和乙酸乙 酯等试剂中选择正丙醇为内标物, 并确定测定所选 浓度为 8mg / mL。由图 1~ 图 4 可知, 经正丁醇萃 取后去除了发酵液 中的绝大多数 干扰物, 甲 醇、乙 醇、正丙醇和正丁醇峰可有效分离, 它们的保留时间 依次约为 3. 66min、3. 91min、4. 85min、6. 30min。正 丁醇色谱图 中有 两个杂 质峰, 保留 时间 分别 约为 4. 15min和 5. 43m in, 但不影响目标物的检测。
在甲醇营养型酵母的发酵过程中, 诱导表达阶段 为主要阶段, 耗时最长。在此阶段, 甲醇诱导启动子 转录, 外源基因得以表达, 同时甲醇是细胞赖以生存 的唯一碳源与能源, 其含量是否合适, 对细胞的生长 和外源基因表达至关重要。尤其是对 Mut+ 菌株, 其 细胞对甲醇残留浓度非常敏感, 浓度高时, 甲醇代谢 的中间产物甲醛的含量会迅速积累到毒性水平, 造成 细胞中毒, 甚至死亡。这种情况在诱导表达初期尤为 明显, 因为此时细胞处在由生长向表达的过渡期, 更 为脆弱。因此, 在 Mut+ 菌株发酵过程中, 必须严格控 制甲醇 的含 量, 使 其维 持在 较低 的浓 度。相对 于 Mut+ 菌株, Muts 菌株对甲醇的利用速率和外源蛋白 的生成速率都比较慢, 对甲醇的残留浓度不太敏感, 因而更易大规模培养。但也正因如此, 当流加速率不
工 业微 生 物
Industrial M icrobiology
V ol. 31 N o. 2 June. 2001
甲醇营养型酵母高密度培养过程中 甲醇和乙醇的 GC 快速检测
邓兵兵, 方宏清, 薛 冲, 赵洪亮, 刘志敏*
( 军事医学科学院生物工程研究所, 北京 100071)
样品处理简单, 对萃取时间无严格要求; 稳定性、重 现性好; 操作简便, 可同时测定甲醇和乙醇的含量, 测定耗时少; 并可使用分析纯试剂, 成本低廉, 很适 合用于发酵过程的实时控制。而快速灵敏的分析方 法对甲醇营养型酵母工程菌高密度高表达发酵条件 的过程优化至关重要, 对发酵液中甲醇、乙醇浓度进 行适当控制, 既能满足酵母生长及目的基因表达的 需要, 又能尽可能地减少抑制细胞生长和基因表达 的因素, 有效地提高目的蛋白的产率, 在我们的发酵
0、5. 0、6. 0、8. 0、10. 0 ( mg/ ml) 的标准水溶液。取 Ce( mg/ ml) = 11. 569A e/ A p ( 2) R= 1. 000
0. 9ml 甲醇或乙醇 标准溶液, 加入 0. 1ml 64mg/ ml Cm、Ce: 样品中甲醇乙醇浓度
正丙醇溶液, 混匀后用 1ml 正丁醇萃取 5min, 取 0. Am、Ae: 甲醇乙醇色谱峰的积分面积
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工业微生物
第 31 卷
谱分析, 正丁醇萃取时间分 别为 5、15、30m in, 结果 如表 1。由表可知, 萃取时间 在 30min 之内 对测定
结果无显著影响。本实验萃取时间采用 5~ 10min。
图 5 甲醇测定标准工作曲线
图 6 乙醇测定标准工作曲线
表 1 正丁醇萃取时间的研究
样品( mg/ mL)
2. 4 方法重现性的研究
方法进行 3 次重复实验, 结果如表 2。由表可知, 与
对样品 A、甲醇标准液 D( 6mg/ m L) 、乙醇标准 国外同类文献相比, 本方法重现性较好。
液 E( 5mg/ m L) 、发酵液上清样品 F 、G, 分别按上述
表 2 甲醇和乙醇测定的重现性研究
样品( mg/ mL)
摘 要 采用气相色谱法( GC) 快速检测甲醇营养型酵母发酵液中的甲醇、乙醇含量, 具有样品处 理简便, 测定时间较短, 结果重现性好的特点。在 1~ 10mg/ mL 范围内具有很好的线性关系。在 毕赤酵母高密度高表达发酵过程中应用此法对甲醇和乙醇进行实时监控, 细胞终密度超过 300g/ L ( 干重) 。本方法为甲醇营养型酵母工程菌的发酵中试工艺研究提供了重要的发酵生化参数。 关键词: 气相色谱; 甲醇营养型酵母; 甲醇; 乙醇
传统的甲醇测定方法有比色法、酶动力学法等, 随着色谱技术的发展, 气相色谱法成为快捷、简便的 甲醇测定方法[ 3, 4] 。本文采用毛细管色谱柱和气相 色谱法, 研究了同时快速检测甲醇营养型酵母发酵 液中甲醇和乙醇含量的方法, 并已用于 5L 罐重组 毕赤酵母高密度发酵过程, 取得了令人满意的结果。
0
平均值 ( mg/ mL)
3. 6794 2. 7056 0. 9912 0. 0339 1. 8697
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SD
0. 04024 0. 01392 0. 01675 0. 00074 0. 09802
-
CV( % )
1. 0937 0. 5144 1. 6901 2. 1777 5. 2423
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注: S D 为标准偏差; CV 为相对标准偏差, 即变异系数。
第2期
邓兵兵, 等: 甲醇营养型酵母高密度培养过程中甲醇和乙醇的 GC 快速检测
第 31 卷
气相 色 谱 仪: HP GC4890; 色 谱 柱: HP - INNOWAX 250mm 0. 25mm; 载 气: 高纯氮 气; 载 气 流速: 1mL / min; 检测器: F ID; H 2 流速: 30 mL/ min; 进样方式: 分流; 分流比: 50 1; 炉温: 程序升温, 初始 温度 60 , 停留 1min, 20 / min 升至 100 , 10 / min 升至 160 , 停留 1m in, 共 10m in。 1. 5 样品制备
注: 由上而下为图 1~ 图 4
图 1 发酵液上清+ 正丁醇
图 2 发酵液上清+ 正丁醇+ 甲醇
来自百度文库
图 3 发酵液上清+ 正丁醇+ 甲醇+ 乙醇 图 4 发酵液上清+ 正丁醇+ 甲醇+ 乙醇+ 正丙醇
2. 2 工作曲线的确定
理, 所得标准曲线方程如( 1) 和( 2) :
用色谱纯甲醇、乙醇配成浓度为 0、1. 0、2. 0、4. Cm( mg/ ml) = 23. 881Am/ Ap ( 1) R= 1. 000
3. 0063
-
3结 论
在本方法研究中我们还考虑了用氯仿和乙醚 作溶剂。分析纯氯仿中杂质多, 出峰复杂, 且含有乙 醇; 分析纯乙醚中虽然杂质少, 出峰单一, 但它对甲 醇的萃取量比正丁醇低得多, 且考虑到其挥发性强, 操作时用量易发生变化, 因此选择正丁醇作溶剂。
本方法能快速测定巴斯德毕赤酵母发酵液中 甲醇和乙醇的含量, 不受发酵液中其它成分的干扰;
甲醇
A
乙醇
甲醇
B
乙醇
甲醇
C
乙醇
5 3. 7254 2. 7199 1. 0078 0. 0336 1. 9826
0
萃取时间( min) 15
3. 6514 2. 6921 0. 9743 0. 0333 1. 8067
0
30 3. 6610 2. 7048 0. 9915 0. 0347 1. 8197
甲醇
A
乙醇
D
5. 8574
E
乙醇
甲醇
F
乙醇
甲醇
G
乙醇
1# 3. 7254 2. 7199 5. 9580 4. 9255 10. 9700
0 2. 2943
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测定序号 2#
3. 6538 2. 6701 5. 8017 4. 9722 11. 0773
0 2. 1905
0
3# 3. 6777 2. 6801 5. 8715 4. 8950 11. 0469
0 2. 0860
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平均值 ( mg/ mL)
3. 6856 2. 6900 0. 07922 4. 9309 11. 0314
2. 1903
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SD
0. 03645 0. 02634 1. 3493 0. 03888 0. 04508
0. 06585
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CV( % )
0. 9891 0. 9793
0. 7885 0. 4086
酵母表达体系作为一种外源基因表达系统, 既 有原核生物那样生长、繁殖快速, 表达量高的特点, 又有与高等真核生物十分相象的蛋白质翻译后加工
和基因表达调控的特征, 近年来越来越受到人们重 视[ 1] 。尤其是甲 醇营养 型酵母 巴斯 德毕赤 酵
母( Pichia p ast ori s ) 、多 形 汉 逊 酵 母 ( H ansenula p oly morp ha) 和博伊丁假丝酵母( Candida boidi nii ) 等更是近年迅速发展的几种表达宿主系统, 它们有 许多优点: 含有诱导型强启动子, 用甲醇可以严格 地诱导表达调控。 外源蛋白 可以分泌到培 养基 中, 有利于维持其天然构象及生物活性。 生存能 力强, 生物量大, 表达水平较高, 培养基成本较低廉, 发酵工艺成熟, 可以实现高密度培养, 细胞干重可达 100 g/ L 以上, 易于进行工业化大规模生产。
1 材料与方法
1. 1 试剂 甲醇为色谱纯, 乙醇、正丁醇、正丙醇、氯仿、乙
醚、乙酸乙酯和异丙醇为分析纯。 1. 2 菌种
毕赤酵 母 GS115: pPIC9- hNGF, 由本 实验室 构建。 1. 3 发酵条件
Biostat B5 发酵罐( B. Braun Biotech Int ernat ional) , 计算机在线控制溶氧、温度、转速和 pH 值, 利用 BT 00- 100M 型兰格蠕动泵控制甲醇、甘油等的补 料速率。 1. 4 色谱条件
军事医学科学院科技创新研究基金资助项目 作者简介: 邓兵兵( 1969~ ) , 女, 助理研究员。
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* 通讯作者: 刘志敏
恰当时, 发酵液中甲醇的残留量更易积累至毒性水 平。所以也必须通过测定甲醇的量来及时调整其流 加速率, 使甲醇浓度维持在适当的水平, 通常为 0. 2% ~ 0. 8% ( v/ v) [ 2] 。总之, 实时监控发酵液中甲醇的含 量是甲醇营养型酵母发酵过程中不可缺少的条件。 在毕赤酵母高密度发酵过程的后期, 我们发现有少量 的乙醇积累, 其作用还不甚明确, 但过高的乙醇含量 可能会对目的基因的表达产生抑制作用。
6 L 进样分析。分别以甲醇或乙醇浓度为横坐标, Ap: 正丙醇色谱峰的积分面积
以甲醇峰面积或乙醇峰面积与正丙醇峰面积的比值 2. 3 正丁醇萃取时间的研究
为纵坐标, 绘制工作曲线, 结果见图 5~ 图 6。将得
取样品 A( 含 3. 6mg/ m L 甲醇和 2. 7mg/ mL 乙
到的结果用 SPSS 软件 进行过零 点的线 性回归 处 醇的水溶液) 以及发酵液上清样品 B, C 进行气相色
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第2期
邓兵兵, 等: 甲醇营养型酵母高密度培养过程中甲醇和乙醇的 GC 快速检测
第 31 卷
实践中也证实了这一点。目前, 该方法用 于 5L 罐 重组毕赤酵母高密度发酵过程中, 能使细胞生长状 况良好, 终密度已超过 300g/ L ( 干重) , 目的蛋白产 率超过克级水平。因此, 本方法为甲醇酵母工程菌 的发酵中试工艺研究提供了重要的发酵生化参数。
参考文献
[ 1 ] James M . Cregg, Thomas S. Vedvick and W illiam C. Raschke.
Recent advances in the expression of foreign genes in Pichis pastoris. [ J] Bio/ Technology, 1993, 11( 8) : 905 [ 2] StrattonJ, Chiruvolu V, M eagher M . High cell- density fermentation. M ethods M ol Biol, 1998, 103: 107 [ 3 ] Toshio Kawai, et al. Simple method for determ ination of methanol in blood and its application in occupational health. Bull. Environ. Contam. Toxicol, 1991, 47: 797 [ 4 ] Gary M . Pollack and Jodi L. Kaw agoe. Determination of methanol in w hole blood by capillary gas chromatography w ith d-i rect on - column injection. Journal of Chromatography, 1991, 570: 406
0. 9mL 发酵液上清样品加入 0. 1mL 8mg/ mL 正 丙醇, 用 1mL 正丁醇萃取 5~ 10min, 0. 6 L 进样。
2 结果与讨论
2. 1 内标的选择
由于在制备过程中样品萃取的不完全性以及溶 剂正丁醇的挥发性会引起样品定量测定的误差, 因 此采用内标法。经实验, 从正丙醇、异丙醇和乙酸乙 酯等试剂中选择正丙醇为内标物, 并确定测定所选 浓度为 8mg / mL。由图 1~ 图 4 可知, 经正丁醇萃 取后去除了发酵液 中的绝大多数 干扰物, 甲 醇、乙 醇、正丙醇和正丁醇峰可有效分离, 它们的保留时间 依次约为 3. 66min、3. 91min、4. 85min、6. 30min。正 丁醇色谱图 中有 两个杂 质峰, 保留 时间 分别 约为 4. 15min和 5. 43m in, 但不影响目标物的检测。
在甲醇营养型酵母的发酵过程中, 诱导表达阶段 为主要阶段, 耗时最长。在此阶段, 甲醇诱导启动子 转录, 外源基因得以表达, 同时甲醇是细胞赖以生存 的唯一碳源与能源, 其含量是否合适, 对细胞的生长 和外源基因表达至关重要。尤其是对 Mut+ 菌株, 其 细胞对甲醇残留浓度非常敏感, 浓度高时, 甲醇代谢 的中间产物甲醛的含量会迅速积累到毒性水平, 造成 细胞中毒, 甚至死亡。这种情况在诱导表达初期尤为 明显, 因为此时细胞处在由生长向表达的过渡期, 更 为脆弱。因此, 在 Mut+ 菌株发酵过程中, 必须严格控 制甲醇 的含 量, 使 其维 持在 较低 的浓 度。相对 于 Mut+ 菌株, Muts 菌株对甲醇的利用速率和外源蛋白 的生成速率都比较慢, 对甲醇的残留浓度不太敏感, 因而更易大规模培养。但也正因如此, 当流加速率不